付恒怡 汪成林

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都 610041

人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）最先由Mooney等[1]描述為干細(xì)胞，后于2000年證實(shí)存在于人牙髓組織中[2]，是一種具有干細(xì)胞性質(zhì)的未分化細(xì)胞，具有多向分化潛能，在再生醫(yī)學(xué)方面具有巨大的潛力[3]。目前，hDPSCs作為一種非侵入來(lái)源的干細(xì)胞[4]，已被應(yīng)用于治療Ⅰ型糖尿病、神經(jīng)疾病、免疫缺陷疾病以及骨和軟骨疾病等。但人牙髓中干細(xì)胞含量極低，必須在體外進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量來(lái)滿足應(yīng)用需求。

Gronthos等[2]最初從人牙髓組織分離出牙髓干細(xì)胞后，其體外培養(yǎng)的方法采用αMEM（α modification of Eagle’smedium），添加20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及多種抗生素。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者仍主要通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度的胎牛血清及抗生素培養(yǎng)及擴(kuò)增牙髓干細(xì)胞，但同時(shí)也發(fā)展出多種不含血清的培養(yǎng)方法。

1 干細(xì)胞培養(yǎng)方法的介紹和發(fā)展

常見的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，依據(jù)其是否使用血清，主要分為兩類，即含血清培養(yǎng)方法和不含血清培養(yǎng)方法。

1.1 含血清培養(yǎng)方法

1.1.1 FBS FBS是體外培養(yǎng)細(xì)胞的重要補(bǔ)充劑，含有必要的成分，如激素、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子等。然而，除涉及動(dòng)物倫理道德問題外，由于其為極其復(fù)雜的混合物，含有許多成分未知的組成部分，對(duì)其臨床應(yīng)用存在限制。首先，F(xiàn)BS存在攜帶細(xì)菌、病毒、支原體、蛋白傳染性疾病或朊病毒的風(fēng)險(xiǎn)。其次，血清可能含有不同數(shù)量的內(nèi)毒素、血紅蛋白和其他有害因子，影響產(chǎn)品的安全性[5]。此外，不同批次血清的質(zhì)量和蛋白質(zhì)濃度存在差異[6]，影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。更有研究[7]表明，F(xiàn)BS中包含的蛋白質(zhì)和多肽即使在最低濃度下也可能會(huì)在培養(yǎng)過程中與干細(xì)胞結(jié)合，使干細(xì)胞受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體，引發(fā)免疫反應(yīng)，并可能在需要重復(fù)注射的情況下導(dǎo)致移植細(xì)胞的排斥反應(yīng)[8]。

1.1.2 人來(lái)源血清 近年來(lái)，有學(xué)者[9]認(rèn)為，從成人外周血和臍帶血（umbilical cord，UC）中制備富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）在體外擴(kuò)增干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明其比FBS具有更強(qiáng)的促有絲分裂作用，對(duì)干細(xì)胞遷移具有更好的促進(jìn)效果。他們認(rèn)為，這些人來(lái)源血清培養(yǎng)基可以替代含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，用于體外培養(yǎng)及冷凍保存人和大鼠的牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。而在幾種血漿中，臍帶血來(lái)源的富血小板血漿在增殖、遷移方面更加具有優(yōu)勢(shì)，如0.1%濃度的臍帶血來(lái)源的富血小板血漿對(duì)DPSCs的增殖作用可超過培養(yǎng)基中添加的多種生長(zhǎng)因子的作用。Nakashima等[10]進(jìn)行牙髓再生臨床試驗(yàn)時(shí)也采用10%自體血清作為DMEM（dulbecco’s modification of Eagle’s medium）的添加物而培養(yǎng)hDPSCs。此類培養(yǎng)基均為人來(lái)源血清，有自體應(yīng)用前景，但其化學(xué)成分仍不明確，且使用過程中需要大量外周血或臍帶血，無(wú)法滿足大規(guī)模擴(kuò)增干細(xì)胞的需求。

1.2 不含血清培養(yǎng)方法

為了擺脫FBS的倫理爭(zhēng)議和安全隱患，以及人來(lái)源血清的供需矛盾，迫切需要開發(fā)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基。然而，無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求更高，技術(shù)體系暫不成熟，且有研究[11]顯示，無(wú)血清培養(yǎng)的DPSCs對(duì)外源性細(xì)胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，提示：不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞可能易受外源性細(xì)胞毒性的影響，在一定程度上影響干細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基未能在市場(chǎng)上廣泛使用，還需要進(jìn)一步的研究。

盡管如此，目前市場(chǎng)上也已開發(fā)出多種無(wú)血清培養(yǎng)基，適合不同細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，且均由營(yíng)養(yǎng)完全的基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加一定數(shù)量的添加因子均勻混合組成。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分已知，常見的有MEM（modification of Eagle’s medium）、DMEM等。添加因子按其功能的不同一般分為5類[12]：1）促貼壁因子，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。2）激素和促生長(zhǎng)因子，激素如胰島素；生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等。3）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。4）酶抑制劑：常用大豆胰酶抑制劑。5）其他微量元素，如硒等。

無(wú)血清培養(yǎng)基經(jīng)過多年的發(fā)展，目前已開發(fā)出完全不含血清、無(wú)蛋白或蛋白含量極低的培養(yǎng)基，即“雙無(wú)培養(yǎng)基”[12]，具有以下優(yōu)勢(shì)：1）內(nèi)容物明確，增加了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可靠性；2）成分比例一致，增加了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；3）無(wú)蛋白成分，有利于純化和下游加工；4）從根本上消除了血清源性或蛋白源性污染。

2 hDPSCs的無(wú)血清培養(yǎng)方法

2.1 無(wú)血清培養(yǎng)方法分類

無(wú)血清培養(yǎng)hDPSCs的方法主要可以分為2類：1）血清條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)，后更換至無(wú)血清培養(yǎng)基中；2）全程無(wú)血清條件培養(yǎng)。

普遍認(rèn)為，在運(yùn)送組織樣本以及在原代培養(yǎng)分離干細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)BS的使用是必需的[13]，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。同時(shí)，也有研究[13]表明，無(wú)血清培養(yǎng)的DPSCs對(duì)外源性細(xì)胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，這表明不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞可能易受外源性細(xì)胞毒性的影響。因此，在大多數(shù)有關(guān)無(wú)血清培養(yǎng)DPSCs的實(shí)驗(yàn)[12]中，研究者們?nèi)匀贿x擇第一種方法，即先用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間，再更換到無(wú)血清培養(yǎng)基中。

然而，Mochizuki等[11]認(rèn)為，在傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞即使只有一次也會(huì)引起安全問題；因此，他們?cè)谡麄€(gè)hDPSCs的培養(yǎng)過程中均未使用血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附力降低，形態(tài)變薄，提示：原代培養(yǎng)使用無(wú)血清培養(yǎng)基會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生或多或少的不利影響。Abdel Moniem等[14]在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中只有在傳代培養(yǎng)細(xì)胞胰蛋白酶失活時(shí)使用了最低濃度的FBS，他們建議在之后的研究中嘗試采用機(jī)械分離或用危害小的蛋白酶（如重組胰蛋白酶）取代胰蛋白酶，以確保細(xì)胞不會(huì)受到任何血清來(lái)源的影響。最近有研究[15]便采用了后者的方法，運(yùn)用消化酶AccutaseTM建立了一種從分離到培養(yǎng)和分化誘導(dǎo)全過程的無(wú)血清培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的hDPSCs可以和在常規(guī)培養(yǎng)條件下一樣增殖，提示全程無(wú)血清條件培養(yǎng)方法具有一定的可行性。

2.2 無(wú)血清培養(yǎng)基添加因子的研究進(jìn)展

有一些有關(guān)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加因子組成和配比的研究，如Hirata等[13]嘗試對(duì)比4種添加不同因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含1% 胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（insulin transferrin selenium，ITS）-Ⅹ和100 mg·mL-1胚胎營(yíng)養(yǎng)因子（embryo trophic factor，ETF）最適合hDPSCs的培養(yǎng)，具有較高的存活率和增殖率，且干細(xì)胞標(biāo)志物中表達(dá)最強(qiáng)。Machado等[16]在有血清和無(wú)血清的條件下，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的葡萄糖和谷氨酰胺，發(fā)現(xiàn)在去谷氨酰胺的無(wú)血清低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞具有較好的形態(tài)和活力。

有研究表明，在培養(yǎng)hDPSCs時(shí)應(yīng)用較多的有幾種雙無(wú)培養(yǎng)基。Bakopoulou等[17]對(duì)2種商業(yè)化的雙無(wú)培養(yǎng)體系StemPro和StemMacs進(jìn)行了評(píng)估并建議作為含血清培養(yǎng)基的替代品。然而，考慮到制造商往往不提供關(guān)于配方的信息，可能會(huì)導(dǎo)致樣本之間缺乏直接比較，還需要進(jìn)一步的測(cè)試。Xiao等[18]使用E8（Essential 8）培養(yǎng)基進(jìn)行hDPSCs的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。這是一種相對(duì)成熟的無(wú)血清培養(yǎng)基，常用于臨床和研究用途的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）培養(yǎng)，其中一些成分如重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和胰島素對(duì)hDPSCs的維持和生長(zhǎng)是必要的，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。有研究[14]報(bào)道，一種雙無(wú)培養(yǎng)基的新配方，添加因子包括bFGF、ITS、抗壞血酸、β-巰基乙醇和膽固醇，成功地增加了hDPSCs的增殖潛能和干性，是一種安全且具有應(yīng)用潛力的血清培養(yǎng)基替代品。

綜上，完全無(wú)血清的培養(yǎng)方法顯然能夠徹底避免血清的倫理及安全問題，但也可能會(huì)對(duì)hDPSCs的穩(wěn)定生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。這需要深入的研究論證，并為解決這些問題尋找無(wú)血清培養(yǎng)基更適合的添加因子，例如ITS-Ⅹ、ETF等。對(duì)于制造商較為成熟的無(wú)血清培養(yǎng)基，由于其配方信息未知，也需要經(jīng)過進(jìn)一步的測(cè)試，以明確其對(duì)hDPSCs生物性能的影響。

3 無(wú)血清培養(yǎng)hDPSCs的細(xì)胞特性

3.1 細(xì)胞形態(tài)

研究[17]顯示，用無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的hDPSCs表現(xiàn)出非常均勻的形態(tài)，梭形細(xì)胞排列整齊。相反，含F(xiàn)BS 培養(yǎng)基擴(kuò)增的hDPSCs表現(xiàn)為形狀和大小不一。Mochizuki等[11]早在原代培養(yǎng)中就開始使用無(wú)血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)雖然單個(gè)細(xì)胞大小與血清培養(yǎng)的細(xì)胞相似，但黏附率較低，形態(tài)明顯變薄，且呈梭形。Qu等[19]以及鐘萌等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了這一觀點(diǎn)，即與含F(xiàn)BS培養(yǎng)基相比，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hDPSCs顯示出更細(xì)長(zhǎng)、更薄、更立體、更近紡錘形的成纖維細(xì)胞形態(tài)。

3.2 細(xì)胞增殖

與含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基相比，關(guān)于無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞增殖的影響目前存在相互矛盾的結(jié)論，這可能是由研究中供體的不同特性、使用的培養(yǎng)基的成分不同或培養(yǎng)方法的差異所致。早期有學(xué)者[21]應(yīng)用低血清培養(yǎng)基，觀察到其分離后的貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯低于高血清培養(yǎng)基，認(rèn)為低血清培養(yǎng)基可能會(huì)對(duì)hDPSCs的增殖產(chǎn)生不利影響。有研究[13]通過增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，幾種無(wú)血清配方的培養(yǎng)基培養(yǎng)的hDPSCs增殖能力遠(yuǎn)低于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hDPSCs。但在無(wú)血清培養(yǎng)基中，其中同時(shí)添加1% ITS-Ⅹ和100 mg·mL-1ETF 與單獨(dú)添加1%ITS-Ⅹ或100 mg·mL-1ETF等配方相比，增殖能力較高且具有明顯差異。有學(xué)者[21]應(yīng)用低血清培養(yǎng)基，觀察到其分離后的貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯低于高血清培養(yǎng)基，認(rèn)為低血清培養(yǎng)基可能會(huì)對(duì)hDPSCs的增殖產(chǎn)生不利影響。

然而，Bakopoulou等[17]發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清條件下擴(kuò)增的hDPSCs在連續(xù)傳代過程中產(chǎn)生了與血清培養(yǎng)相似的生長(zhǎng)模式，且在完成不超過3代（早期）傳代后，已能夠?qū)崿F(xiàn)超過3 000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量。Fujii等[22]的實(shí)驗(yàn)通過分析hDPSCs基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，胎盤生長(zhǎng)因子和抑制素等與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。有研究[19]證實(shí)，hDPSCs在無(wú)血清培養(yǎng)基中的擴(kuò)增方式與血清培養(yǎng)在早期傳代時(shí)沒有明顯差異，但前者中細(xì)胞集落數(shù)量較少。在培養(yǎng)基的添加因子方面，Xiao等[18]發(fā)現(xiàn)，含抗壞血酸和ETF的特殊無(wú)血清培養(yǎng)基，可能通過加快細(xì)胞分裂速度以及降低細(xì)胞凋亡率，來(lái)提高h(yuǎn)DPSCs的增殖率。

采用全程無(wú)血清的培養(yǎng)方法時(shí)，Mochizuki等[11]報(bào)道雖然無(wú)血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)條件下hDPSCs在培養(yǎng)皿上黏附需要更長(zhǎng)的時(shí)間，但傳代培養(yǎng)時(shí)無(wú)血清培養(yǎng)條件下的hDPSCs比有血清培養(yǎng)條件下具有更強(qiáng)的增殖能力。另有研究[14]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hDPSCs在無(wú)血清培養(yǎng)基中的增殖率明顯提高，與常規(guī)10%FBS培養(yǎng)基相比，在培養(yǎng)第7天時(shí)分離獲得的細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異，但在培養(yǎng)第14天時(shí)獲得細(xì)胞數(shù)量更多。此外，值得注意的是，Mochizuki等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到過度融合時(shí)，無(wú)血清細(xì)胞形成了多層結(jié)構(gòu)，增殖受阻，不能傳代，而血清培養(yǎng)細(xì)胞則為單層結(jié)構(gòu)。通過觀察，他們認(rèn)為這種異常的細(xì)胞增殖行為可能由于這些細(xì)胞的“接觸抑制”減弱，異種血清成分的存在可能有助于接觸抑制，并控制細(xì)胞的正常增殖行為。

另外，體外培養(yǎng)hDPSCs時(shí)要注意其存在明顯的與年齡有關(guān)的細(xì)胞增殖的差異，研究[13]表明，年齡相關(guān)的衰老影響hDPSCs的增殖和分化能力。和年輕供體相比，年老的供體來(lái)源的hDPSCs增殖能力明顯下降。

由上述研究分析可知，無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)hDPSCs增殖的影響存在相互矛盾的結(jié)論，這可能是由研究中供體的特性不同、培養(yǎng)基成分不同或培養(yǎng)方法的差異所致。新的研究結(jié)果提示，在體外培養(yǎng)hDPSCs時(shí)應(yīng)盡可能選用年輕供體，無(wú)血清培養(yǎng)基的添加因子可以適當(dāng)選用ITS-Ⅹ、ETF以及抗壞血酸等。采用無(wú)血清培養(yǎng)方法擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)早期增殖能力可能會(huì)相對(duì)較弱，傳代培養(yǎng)后會(huì)逐漸增強(qiáng)，甚至超過含血清培養(yǎng)方法的細(xì)胞。但應(yīng)注意避免過度培養(yǎng)至過度融合，因?yàn)檫@會(huì)破壞細(xì)胞的增殖和進(jìn)一步培養(yǎng)的潛力。

3.3 細(xì)胞干性

多個(gè)課題組研究了無(wú)血清培養(yǎng)的hDPSCs的MSC相關(guān)的各種標(biāo)記物，通過其表達(dá)差別來(lái)探究無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞干性的影響。

3.3.1 干細(xì)胞重要標(biāo)記物的表達(dá) CD146具有黏附分子特性，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后密切相關(guān)，是某些內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞和血管周圍間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的標(biāo)記物[23]。低血清或無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的hDSPCs的研究[17,21]發(fā)現(xiàn)，表面CD146表達(dá)明顯減少。同時(shí)，更換使用含有大量血清的培養(yǎng)基可以恢復(fù)65%以上的CD146陽(yáng)性細(xì)胞，但不能完全恢復(fù)CD146的表達(dá)。類似的研究[24]也證實(shí)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠DPSCs存在CD146表達(dá)。

CD105是一種跨膜糖蛋白，通常被認(rèn)為是MSC最重要的標(biāo)記物之一[24]。與常規(guī)血清培養(yǎng)相比，研究[17]顯示，無(wú)血清條件早期培養(yǎng)（2～3代）hDPSCs時(shí)CD105的表達(dá)減少，而在長(zhǎng)時(shí)間傳代后（6～7代，10～11代）顯示出更明顯的下調(diào)。另有學(xué)者[19,25]進(jìn)行細(xì)胞鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的hDPSCs呈現(xiàn)CD105陽(yáng)性，但隨著傳代次數(shù)的增加（即使是僅3代之后），CD105陽(yáng)性的hDPSCs的百分率明顯降低，而血清培養(yǎng)的細(xì)胞則多呈陽(yáng)性。有趣的是，將無(wú)血清培養(yǎng)的hDPSCs換至添加血清的培養(yǎng)基中，可恢復(fù)CD105的表達(dá)。盡管在無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增的hDPSCs 的CD105表達(dá)水平降低，但仍可保持功能性的MSC表型。并且，考慮到人血清是模擬細(xì)胞用于移植時(shí)體內(nèi)條件的金標(biāo)準(zhǔn)，CD105的表達(dá)很可能在體內(nèi)移植時(shí)暴露在血清中后得以恢復(fù)[19]。與此相反，另一項(xiàng)研究[26]顯示，CD105在無(wú)血清培養(yǎng)hDPSCs中的表達(dá)非常低且培養(yǎng)過程中沒有明顯改變。

CD34是早期分離的MSC的重要標(biāo)記物，與高集落形成效率和延長(zhǎng)增殖能力相關(guān)，但其表達(dá)隨著傳代而逐漸減弱。有報(bào)道稱，無(wú)血清培養(yǎng)下的hDPSCs造血標(biāo)志物CD45及CD34表達(dá)呈陰性[14,17,19,27]，但長(zhǎng)期擴(kuò)增后CD34表達(dá)明顯上調(diào)[17,28]，與先前報(bào)告[29]一致。

另外，從傳代早期到后期，公認(rèn)的MSC標(biāo)記物如CD90和CD73在基于血清和無(wú)血清培養(yǎng)條件下都能穩(wěn)定地表達(dá)。然而，有學(xué)者[17]發(fā)現(xiàn)，其他MSC標(biāo)記如Stro-1和胚胎標(biāo)記階段特異性Embyronic抗原（stage-specific Embyronic antigen，SSEA）-1和SSEA-4，在無(wú)血清培養(yǎng)多代后顯示出明顯的下調(diào)，是否會(huì)因此而影響hDPSCs的干性，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以補(bǔ)充完善。

3.3.2 成骨、成軟骨及成脂標(biāo)志物的表達(dá) 早期研究[30]表明，成骨和成軟骨受到Runx2轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路調(diào)控，軟骨形成受到SOX-9的強(qiáng)烈調(diào)控，而成脂受到其主要轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）-γ調(diào)控。研究[17]顯示，無(wú)血清條件下擴(kuò)增hDPSCs會(huì)導(dǎo)致其成骨標(biāo)志物Runx2表達(dá)增加，成軟骨標(biāo)志物SOX-9和成脂標(biāo)志物PPAR-γ完全消失，而對(duì)比含血清條件下擴(kuò)增只有成骨標(biāo)志物的變化，成脂和成軟骨的變化不明顯。經(jīng)過多次傳代后，大多數(shù)最初高表達(dá)的成骨標(biāo)志物的表達(dá)減少，成軟骨標(biāo)志物表達(dá)顯著減少或完全消失。因此，學(xué)者們提出hDPSCs只能在早期傳代時(shí)確定可以保持高的成骨及成軟骨潛力。然而，也有學(xué)者[18-22]進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化刺激存在的情況下，無(wú)血清培養(yǎng)的hDPSCs中Runx2和PPAR-γ的表達(dá)水平均較高，提示無(wú)血清培養(yǎng)條件或能有效地維持hDPSCs向成骨和成脂組織的多向分化潛能。研究[14]顯示，無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記OCT4、SOX和NANOG基因的表達(dá)顯著上調(diào)，提示細(xì)胞的干性增強(qiáng)，但可能是由于培養(yǎng)基中添加因子的原因。實(shí)驗(yàn)[22]發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)成骨后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的hDPSCs誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性和鈣化結(jié)節(jié)形成水平均高于有血清培養(yǎng)基組，表明hDPSCs在無(wú)血清培養(yǎng)條件下保持了成骨分化潛能。

3.3.3 神經(jīng)相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá) 除此之外，趨化因子CXC亞家族受體（CXC subfamily receptor，CXCR）3與神經(jīng)炎性反應(yīng)有關(guān)，其陽(yáng)性細(xì)胞在牙髓免疫反應(yīng)中可被CXC趨化因子配體10吸引[31]。有學(xué)者[28]觀察無(wú)血清培養(yǎng)的貼壁hDPSCs發(fā)現(xiàn)，70%的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子CD56，30%表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71。另有少部分hDPSCs表達(dá)CXCR3陽(yáng)性，這部分hDPSCs可能具有遷移到需要修復(fù)區(qū)域的能力，可應(yīng)用于細(xì)胞治療中。

同時(shí)，在神經(jīng)分化方面，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)[21,24,28,32-35]觀察到，在無(wú)血清培養(yǎng)的情況下，來(lái)自不同患者供體的hDPSCs可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，并表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物Nestin[21,27,29-32]。同時(shí)，其他神經(jīng)標(biāo)記物如微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein，MAP）2、微管蛋白β3 等也被證實(shí)高度表達(dá)[15,29,32]。研究[15,29,31]顯示，無(wú)血清培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元誘導(dǎo)刺激hDPSCs后可以獲得類似表型的成熟神經(jīng)元。有學(xué)者[24,32,34]通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、MAP2的表達(dá)、以及神經(jīng)元標(biāo)志物的激活，證實(shí)培養(yǎng)過程中若缺乏血清和生長(zhǎng)因子，可能會(huì)導(dǎo)致hDPSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞向分化，獲得類似表型的成熟神經(jīng)元。

3.3.4 其他分化方向 除以上方向之外，還有研究揭示了無(wú)血清條件下誘導(dǎo)hDPSCs成其他細(xì)胞系的可能性。學(xué)者們[33-34]在無(wú)血清條件下成功誘導(dǎo)hDPSCs分化為高純度的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，以及胰島細(xì)胞系。除此之外，還有學(xué)者[19]進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以及體外血管生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無(wú)血清條件培養(yǎng)的hDPSCs在傳代至第2代和第6代時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的分泌明顯增加，提示無(wú)血清培養(yǎng)基可能比含血清培養(yǎng)基更能促進(jìn)毛細(xì)管樣的形成。

由上述結(jié)果可知，無(wú)血清培養(yǎng)的hDPSCs與含血清培養(yǎng)的hDPSCs相比，其多能分化潛能沒有明顯的差異，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出典型的MSC特征，且更容易誘導(dǎo)神經(jīng)分化以及毛細(xì)管樣形成。hDPSCs作為從牙齒組織中提取的干細(xì)胞，在無(wú)血清條件下增殖分化，對(duì)口腔科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)具有重要的意義。

4 hDPSCs無(wú)血清培養(yǎng)方法的其他應(yīng)用

4.1 三維培養(yǎng)系統(tǒng)

在干細(xì)胞研究中，二維單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)便于對(duì)干細(xì)胞和測(cè)試其多能性等特性的鑒定。但是，相比于單層培養(yǎng)系統(tǒng)，三維球體培養(yǎng)系統(tǒng)更能反映體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞行為。以往的三維培養(yǎng)系統(tǒng)多采用血清培養(yǎng)的方法，但由于使用血清存在安全隱患，不適用于臨床，學(xué)者們[31]對(duì)無(wú)血清三維培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行了多項(xiàng)改進(jìn)。

相較于骨髓MSC，hDPSCs具有更高的神經(jīng)球形成和分化為神經(jīng)元的潛力，因?yàn)槠渑c神經(jīng)嵴細(xì)胞有著共同的起源。有學(xué)者[31]發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基中人牙髓細(xì)胞24 h即可以自發(fā)形成球體，且可以存活15周以上。據(jù)報(bào)道，EGF和/或bFGF對(duì)細(xì)胞增殖及形成球形結(jié)構(gòu)具有作用[15,29]。研究[15]顯示，hDPSCs在全程無(wú)血清培養(yǎng)條件下可以在懸液中生成神經(jīng)球，并分化為神經(jīng)細(xì)胞，但傳代培養(yǎng)后形成的神經(jīng)球數(shù)目變少，形態(tài)變小。因此，在無(wú)血清培養(yǎng)基中，hDPSCs可以增殖并生成神經(jīng)球，但神經(jīng)球的自我更新能力有限。

這種球體模型為探索干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)提供了研究方法，且hDPSCs在無(wú)血清條件下生成神經(jīng)球的特點(diǎn)，未來(lái)可能用于臨床上神經(jīng)元退行性疾病的治療。

4.2 冷凍保存

在再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用過程中，簡(jiǎn)單可靠的活細(xì)胞冷凍保存方法是非常重要的。傳統(tǒng)的冷凍方法一般含有血清及10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。但血清存在安全隱患，且DMSO具有細(xì)胞毒性，在干細(xì)胞凍存中應(yīng)盡量減少使用濃度或不使用。

Lee等[35]推薦應(yīng)用磁冷凍法儲(chǔ)存hDPSCs，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比不同的凍存液和凍存條件的效果，發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入最低濃度的DMSO同時(shí)處于磁場(chǎng)下進(jìn)行冷凍時(shí)，解凍細(xì)胞的貼壁能力、增殖能力和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)均得到較好的保存，且具有與新鮮未凍存hDPSCs相同的分化潛能。Mochizuki等[11]使用無(wú)DMSO低溫保存的無(wú)血清培養(yǎng)hDPSCs進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明解凍后的細(xì)胞表現(xiàn)出與正常細(xì)胞相似的干細(xì)胞特性和增殖行為。

目前，此類研究結(jié)果仍然較少，不過仍然提示無(wú)血清培養(yǎng)基可應(yīng)用于hDPSCs的超低溫保存，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。