黃少鳳，牛向麗，林忠，朱雪紅，賓力，劉姝岑

育齡期患者放化療及早發(fā)性卵巢功能不全女性的生育力保存是臨床難點，也是生殖領(lǐng)域的關(guān)注熱點之一。目前女性生育力保存的方法主要有胚胎冷凍、卵巢組織凍存和卵母細胞凍存，其中胚胎冷凍和卵母細胞凍存均不適用于兒童、未婚女性及可能耽誤治療的癌癥患者，且卵母細胞由于凍存耐受性差，常會發(fā)生細胞紡錘體、細胞骨架和透明帶的損傷，成功率低[1]。而卵巢組織冷凍是有效的女性生育力保存方法，且有利于卵巢功能恢復(fù)，但目前尚處于試驗階段[2]。卵巢組織的冷凍方法主要有慢速冷凍法、快速冷凍法、玻璃化冷凍法和定向冷凍法。慢速冷凍法是卵巢組織冷凍的常規(guī)方案，目前報道的應(yīng)用卵巢組織移植技術(shù)分娩的嬰兒絕大多數(shù)是使用此方法[3]。玻璃化冷凍法是組織在高濃度冷凍保護劑下迅速降溫，將細胞內(nèi)外液直接轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w的玻璃化狀態(tài)，基本上可避免細胞內(nèi)冰晶形成對細胞的機械損傷，被認(rèn)為是目前最有效的卵巢組織凍存方法，且其無需特殊設(shè)備，可節(jié)約時間及成本[4]。玻璃化冷凍法有望成為卵巢組織慢速冷凍的替代方案。但由于高濃度冷凍保護劑具有細胞毒性，滲透平衡和解凍時的滲透壓劇烈變化都會給組織造成損傷，其安全性和有效性尚需進一步驗證。

目前卵巢組織凍存和移植的兩個重要挑戰(zhàn)是：①卵巢組織冷凍損傷及移植過程中的損傷可觸發(fā)卵泡凋亡，進而引起卵泡發(fā)育停滯和閉鎖；②卵巢組織移植后缺血再灌注及氧化應(yīng)激引起的原始卵泡丟失多達50%，因此移植過程中仍然有很多問題需要注意和解決[5]。卵泡損傷是卵巢組織凍存和移植發(fā)展的主要限制因素之一?，F(xiàn)針對卵巢組織玻璃化冷凍保存過程（冷凍保護劑、卵巢組織大小和冷凍載體）和卵巢皮質(zhì)片段移植過程（抗氧化劑、促進新血管形成、激素）中的損傷因素進行文獻檢索，探討其研究進展，以期能為廣大學(xué)者和臨床工作者提供參考。

1 冷凍損傷的因素

1.1 冷凍保護劑冷凍過程中冷凍保護劑的種類、濃度、冷凍時間、不同卵泡的發(fā)育階段及操作人員技術(shù)水平等均與冷凍效果密切相關(guān)。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類，其中滲透性冷凍保護劑包括二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙二醇、丙二醇和甘油等，通過滲透細胞起到保護作用，而非滲透性冷凍保護劑包括蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、白蛋白、ε-聚賴氨酸、聚乙二醇和動物血清等[6]。DMSO和乙二醇是目前國際上最常用和最成熟的冷凍保護劑，二者對卵巢組織均具有濃度依賴的毒性作用，滲透性強。當(dāng)DMSO濃度升高時，其抗氧化特性可轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸匦訹7]。單獨使用DMSO可破壞卵泡線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等結(jié)構(gòu)，降低卵泡活力。為降低冷凍保護劑的毒性，優(yōu)化凍存效果，卵巢組織凍存所用的冷凍保護劑幾乎都含滲透性和非滲透性冷凍保護劑，但目前國際尚無統(tǒng)一的最佳配方。相對于各發(fā)育階段的卵泡，原始卵泡對于凍存損傷的抵抗力最強。然而目前卵巢皮質(zhì)冷凍技術(shù)的效果并不是特別理想，冷凍期間卵泡的丟失和受損是玻璃化冷凍法發(fā)展過程中需要解決的問題。

目前人卵巢皮質(zhì)玻璃化冷凍方案常用的冷凍保護劑為DMSO+乙二醇+蔗糖，部分添加白蛋白、血小板裂解物等人血清制品。DMSO、乙二醇、蔗糖的常用濃度分別為10%～20%（V/V）、10%～35%（V/V）和0.1～0.5 mol/L（以0.5 mol/L最常見）[8]。由于原始卵泡約占正常卵巢卵泡總數(shù)的90%，其直徑為30～80 μm，比生長卵泡直徑更小，冷凍保護劑更易浸潤，且抗凍能力更強，故目前大多數(shù)研究都是針對原始卵泡[9]。在臨床中，針對不同類型卵泡采用不同的玻璃化冷凍方案，可盡可能保存女性生育力。

對于生長卵泡比例較高的卵巢組織，使用濃度更高的冷凍保護劑或延長玻璃化冷凍時間可更好地維持細胞內(nèi)外液玻璃化狀態(tài)，進而有效維持卵泡正常形態(tài)，但冷凍保護劑的毒性也隨著濃度增加。如DMSO在低濃度時，可通過降低細胞膜厚度或誘導(dǎo)細胞膜瞬時水孔形成等機制加速細胞液玻璃化；當(dāng)其濃度＞25%時，可對卵泡細胞膜造成不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p傷[7]。此外，Gandolfi等[10]研究指出，與丙二醇相比，DMSO保存初級卵泡效果更佳，而保存次級卵泡效果較差。對于次級卵泡比例較多的卵巢組織，可適當(dāng)提高冷凍保護劑中丙二醇的比例。

總而言之，冷凍保護劑的選擇需考慮種類、濃度和卵泡發(fā)育階段等。與單一冷凍保護劑相比，滲透性與非滲透性冷凍保護劑相結(jié)合更安全有效。在通過高濃度冷凍保護劑加快細胞液玻璃化狀態(tài)的同時，應(yīng)留意子代安全情況。針對卵巢組織中各個發(fā)育階段卵泡的比例不同，進行個體化冷凍可更好地為患者服務(wù)，但目前缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，難以在臨床規(guī)范化應(yīng)用。

1.2 卵巢組織大小理論上，冷凍效果與卵巢組織的面積與體積的比值相關(guān)，隨著其比值的增加，冷凍保護劑可更全面地浸潤卵巢組織。Fabbri等[11]已證實卵巢組織的表面積/體積的比值增加確實有利于提高冷凍保存效果。目前大部分研究將卵巢皮質(zhì)組織處理成厚約1～2 mm，長寬分別為5～8 mm和1～5 mm的片狀組織[12]。但是，面積過小的卵巢組織會降低其臨床冷凍及移植的意義，因為移植相同體積的卵巢組織，面積小的所需切割次數(shù)增加，易引起卵泡破壞或丟失；卵巢組織面積過小，增加冷凍復(fù)蘇過程和手術(shù)操作難度，更易導(dǎo)致卵泡受損；且在植入者體內(nèi)，缺血再灌注損傷等因素可導(dǎo)致至少50%的卵泡丟失，可使用卵泡減少。此外，若卵巢組織面積過小，其組織結(jié)構(gòu)可能無法充分支持卵泡生長。Zhao等[13]對大面積的人卵巢組織塊（大小為18 mm×10 mm×1 mm）經(jīng)孔洞修剪后進行玻璃化冷凍，獲得79.6%的原始卵泡正常形態(tài)率和26.1%的卵泡凋亡率，異種移植后新生血管可通過孔洞進入卵巢組織，降低缺血再灌注損傷。因此，大面積卵巢組織經(jīng)適當(dāng)孔洞修剪后可保證正常的卵泡結(jié)構(gòu)，且移植后可更快恢復(fù)卵巢組織血供，維持其內(nèi)分泌功能。

此外，若卵巢組織厚度＜1 mm，其凍存及移植效果并未進一步改善。Gavish等[14]將不同厚度（1～2 mm和0.5～0.9 mm）的牛卵巢皮質(zhì)條帶異種移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)降低移植物厚度對新生血管生成并無優(yōu)勢，反而減少原始卵泡和生長卵泡的存活數(shù)量。由此可見，對于正常卵巢組織來說，1～2 mm為卵巢組織玻璃化冷凍的最佳厚度。但對于早發(fā)性卵巢功能不全患者來說，其原始卵泡和初級卵泡的平均深度（從卵巢皮質(zhì)表面到卵泡遠端的距離）為566 μm，而70%次級卵泡的深度＞1 mm，部分卵泡位于＞1.5 mm的深度，因此該類患者需更加厚的卵巢皮質(zhì)進行冷凍。Haino等[15]研究指出，隨著年齡增長，原始卵泡和初級卵泡移向卵巢皮質(zhì)更深處，但均距皮質(zhì)表面＜1mm，僅有部分次級卵泡的深度＞1 mm。臨床中玻璃化冷凍方案需盡量個體化，可根據(jù)年齡、激素水平[如卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和抗苗勒管激素等]、B超檢測卵巢儲備功能、是否存在早發(fā)性卵巢功能不全、是否接受過性腺毒性治療、卵巢病理情況（如卵巢皮質(zhì)纖維化、多囊卵巢綜合征、接受睪酮治療的出生時被指定女性的變性人等）進行評估。

1.3 冷凍載體冷凍載體的選擇應(yīng)考慮降溫速率、生物安全性和經(jīng)濟等方面。根據(jù)卵巢組織是否直接與液氮接觸，可分為封閉式和開放式。封閉式冷凍載體最常用的是冷凍管，卵巢組織不會直接接觸液氮，但降溫速率較慢。銀制封閉式玻璃化冷凍管溫度傳導(dǎo)性能優(yōu)越，可迅速降溫，更好地保護卵巢組織的發(fā)育潛能[16]。開放式冷凍載體包括針浸潤載體、電鏡銅網(wǎng)、冷凍環(huán)、冷凍載桿、金屬網(wǎng)條和尼龍網(wǎng)柵等，卵巢組織直接與液氮接觸，降溫速率快，但可能存在組織污染等風(fēng)險[17]。雖然有開放式載體玻璃化冷凍的卵巢組織獲得健康嬰兒的報道，但在臨床應(yīng)用中，由于液氮無法通過紫外線照射、高溫等方式消毒，無法隔絕生物污染等風(fēng)險性，其安全性仍存在很大隱患，不適用于臨床。肖準(zhǔn)等[18]首創(chuàng)以超細針灸針作載體，最大程度地提高了降溫速率，取得了比程序化慢速冷凍和滴入法玻璃化冷凍更佳的冷凍效果。但其循證醫(yī)學(xué)證據(jù)仍較少，需進一步探討。在未來冷凍載體的探討上，如何盡可能兼顧降溫速率與低毒性是主導(dǎo)研究方向。金屬中銀、金的導(dǎo)熱性優(yōu)于鋁、銅，非金屬材料中導(dǎo)熱性較佳的為碳纖維、石墨、金剛石和氮化鉭，或許可從中尋找最佳的冷凍載體材料。載體設(shè)計還應(yīng)考慮通過鏤空等方式減少冷凍保護劑殘留，進而減少子代安全隱患。

2 移植損傷因素

從2004年Donnez等[19]報道了第1例人類利用卵巢組織凍存和移植獲得活產(chǎn)兒后，陸續(xù)有利用玻璃化冷凍技術(shù)獲得活產(chǎn)的案例。2021年孫寧霞等[20]報道了我國首例通過卵泡體外激活聯(lián)合玻璃化冷凍卵巢組織移植技術(shù)成功分娩的案例，經(jīng)2年隨訪，小兒體格發(fā)育、運動和精神神經(jīng)發(fā)育均正常，進一步驗證了卵巢組織凍存和移植的可行性及子代安全性。Donnez等[19]對歐洲五大中心的285例行卵巢組織凍存和移植的婦女進行研究發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)具有顯著恢復(fù)女性生育功能的潛力。但移植后缺血再灌注損傷及自由基等氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的原始卵泡丟失是限制女性生育能力恢復(fù)的主要因素。由于卵巢組織移植通常采用無血管方式進行，移植時未進行血管吻合，因此移植后卵巢組織會在血運重建前經(jīng)歷數(shù)日局部缺血和缺氧期。故血運重建及防止卵泡凋亡是卵巢組織移植物存活的關(guān)鍵。其因素包括抗氧化劑、促進新血管形成和激素等。

2.1 抗氧化劑抗氧化劑可分為非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑，前者包括維生素C、維生素E、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、谷氨酰胺、肉堿、麥角硫因、?；撬?、槲皮素、褪黑素、白藜蘆醇、蘋果多酚、葡萄籽原花青素及線粒體靶向肽Elamipretie等物質(zhì)；后者包括谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、輔酶Q10及其衍生物等。楊璐凱等[21]研究表明，低濃度槲皮素（1 μmol/L）可以提高卵巢組織內(nèi)相關(guān)抗氧化酶的水平，可較好保存冷凍卵巢組織的卵泡活性和基質(zhì)細胞密度，但高濃度槲皮素（10 μmol/L）并不能獲得正面效果。白藜蘆醇可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)保護卵巢，促進凍融后的卵巢組織自體異位移植功能恢復(fù)。Wang等[22]也指出，白藜蘆醇可通過增加超氧化物歧化酶2、Sirtuin-1、脂質(zhì)過氧化物和核因子κB含量抑制卵泡凋亡，改善小鼠移植后卵巢組織質(zhì)量（卵泡形態(tài)是否正常、卵泡凋亡情況和移植后卵巢內(nèi)分泌功能是否恢復(fù)）及胚胎結(jié)局。褪黑素作為一種抗氧化劑，可以隔離高反應(yīng)性自由基，中和羥基自由基，其效率高于還原型谷胱甘肽（內(nèi)源性抗氧化劑）或甘露醇（植物中發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑），可有效抑制卵泡凋亡[23]。

此外，有學(xué)者在冷凍保護劑和復(fù)蘇液中添加LeIBP（Leucosporidium ice-binding protein）、抗冷凍蛋白Ⅲ等抗冷凍蛋白，其在小鼠、家兔和牛等動物中獲得良好效果，可通過與冰晶結(jié)合，增加溶液冰點與熔點差值，抑制冰晶生長與重結(jié)晶，維持細胞液玻璃化狀態(tài)，進而有效維持卵泡正常形態(tài)，增加卵泡及其周圍內(nèi)皮細胞存活率，而內(nèi)皮細胞可能參與新血管形成，抑制移植物纖維化[24]。另外，抗冷凍蛋白可能存在抗氧化活性，通過增強超氧化物歧化酶活性抑制卵泡凋亡[25]。但抗冷凍蛋白在人類卵巢玻璃化冷凍保存和移植中的效果尚未得到證實。

1-磷酸鞘氨醇和Z-VAD-FMK等凋亡抑制劑也可能會提高卵巢組織移植的成功率[26]。然而，目前缺乏1-磷酸鞘氨醇和Z-VAD-FMK在卵泡保存和卵巢組織移植成功方面的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。此外，卵巢組織凍存和移植過程中凋亡抑制劑最佳給藥劑量或給藥方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，仍需進一步探索。

2.2 促進新血管形成原始卵泡的代謝需求非常低，其在移植后新生血管形成前相對較長時間缺血的情況下仍能存活。但血管生成速率作為卵泡存活的重要因素，仍是臨床亟待解決的關(guān)鍵問題。①血管生長因子，包括纖維母細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等。血管內(nèi)皮生長因子可通過酪氨酸激酶受體增加血管募集和功能性血管生成，解除缺氧狀態(tài)，增加卵泡存活數(shù)量及壽命。Kong等[27]研究指出，在異種移植前給予移植部位血管生成素2和血管內(nèi)皮生長因子預(yù)處理可促進血管生成，減輕缺血性損傷，從而維持卵泡的完整性和密度，減少卵泡凋亡和卵巢組織纖維化。血管內(nèi)皮生長因子的有效性理論上成立，但不可全身或局部大劑量應(yīng)用。Abir等[28]發(fā)現(xiàn)異種移植前將人卵巢移植物在生物膠+維生素E+血管內(nèi)皮生長因子A中孵化，可抑制卵泡閉鎖及基質(zhì)細胞凋亡，促進Ki-67表達，加快血管生成，減輕缺血性損傷，有利于移植物存活。②1-磷酸鞘氨醇由鞘氨醇激酶催化鞘氨醇磷酸化而成，調(diào)節(jié)細胞生長和分化等多種細胞增殖過程，促進卵巢移植物中血管生成，減輕組織缺血再灌注損傷[29]。③卵巢移植引起的炎癥反應(yīng)可促使毛細血管再生及纖維細胞增生，形成肉芽組織，進而減少缺血損傷。

2.3 激素在卵巢組織移植過程中，使用促性腺激素可有效促進卵泡存活。FSH與卵泡生長發(fā)育密切相關(guān)，可提高卵泡存活率，縮短凍融卵巢組織再移植后血流重建時間[30]。陳杰等[31]認(rèn)為在卵巢玻璃化冷凍全程中添加0.3 IU/mL FSH可抑制活化半胱氨酸蛋白酶3表達，促進顆粒細胞增殖，為健康卵泡生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)供給，減少凋亡的發(fā)生，維持卵泡的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少卵母細胞皺縮。而LH在參與卵巢內(nèi)血管周期性消長的同時，與FSH協(xié)同可促進卵巢卵泡的發(fā)育及存活，同時LH在抵抗凋亡促進血管發(fā)生過程中可提升卵泡對FSH的敏感性，從而促進卵泡生長發(fā)育，改善單一FSH刺激形成竇卵泡較少等不足[32]。玻璃化凍存過程添加重組FSH+重組LH的干預(yù)模式可增加血管內(nèi)皮生長因子、縫隙連接蛋白37及兩者mRNA的表達，加強卵母細胞與顆粒細胞間營養(yǎng)供給與信息交流，進而改善卵泡存活率，其中以全程干預(yù)效果最佳[33]。此外LH作為垂體前葉分泌的促性腺激素，可通過降低卵泡膜細胞的凋亡來保持卵泡激素合成[34]。早發(fā)性卵巢功能不全患者對激素受體反應(yīng)較低，或許增加FSH、LH劑量有利于其卵泡及顆粒細胞生長，降低卵巢組織移植損傷。

3 總結(jié)與展望

卵巢組織凍存和移植適用人群廣，且是青春期前、需緊急放化療患者生育力保存的唯一途徑，但運用此技術(shù)需謹(jǐn)慎評估風(fēng)險。本文從6個方面闡述了影響卵巢皮質(zhì)玻璃化凍存及移植損傷的因素，但目前仍無統(tǒng)一的卵巢皮質(zhì)玻璃化凍存國際標(biāo)準(zhǔn)，且許多研究仍局限于嚙齒類、兔、羊和牛等非靈長類動物。卵巢皮質(zhì)玻璃化凍存的進一步發(fā)展有賴于安全有效的卵泡保護方法，如何進一步進行卵泡定位（可根據(jù)患者年齡、激素水平、卵巢儲備功能、是否存在早發(fā)性卵巢功能不全、是否接受過性腺毒性治療及卵巢病理情況等進行評估）、針對不同發(fā)育程度的卵泡進行個體化治療（根據(jù)卵巢組織中各個發(fā)育階段卵泡的比例調(diào)整冷凍保護劑種類、濃度、冷凍時間等）、殘留的冷凍保護劑對子代發(fā)育的毒性、針對大塊組織迅速有效的封閉型冷凍載體等均有待進一步研究。此外，卵巢組織凍存中心化（指各醫(yī)療機構(gòu)使用系統(tǒng)的、標(biāo)準(zhǔn)的卵巢組織凍存方案開展工作）還需考慮何種方式更易于臨床操作、經(jīng)濟和侵入性操作少等方面，從而進一步推廣應(yīng)用。