蔣騫 張雅坤 侯維 趙妍麗 賈婷婷

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的80%,是肺癌病理診斷中最普遍的組織學(xué)類型。這個(gè)病理類型可進(jìn)一步分為兩個(gè)主要亞型,即：腺癌(LUAD)和鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)［1］。手術(shù)、放化療是NSCLC 主要治療手段,雖然相關(guān)分子靶向和免疫治療取得了進(jìn)展,但晚期NSCLC 患者的預(yù)后仍然很差［2］。因此,研究NSCLC演進(jìn)的潛在分子機(jī)制,為治療尋找更多有效靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

腫瘤干細(xì)胞也稱為腫瘤起始細(xì)胞(TICs),一直被認(rèn)為是腫瘤難以消除的主要原因［3］。目前的治療只針對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞,而不能根除TICs,所以殘留的TICs可導(dǎo)致治療后腫瘤復(fù)發(fā)［4］。包括利用細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133 在內(nèi)的幾種方法已經(jīng)被用來識(shí)別肺癌中的TICs［5］。在過去的幾年中,乙醛脫氫酶1(ALDH1)+癌細(xì)胞由于其在自我更新、增殖和體內(nèi)腫瘤形成方面的潛在能力而被定性為TICs［6］。研究TICs 的分子調(diào)控異常有助于進(jìn)一步了解肺腫瘤生物學(xué)。更重要的是,研究TICs 相關(guān)的分子機(jī)制可能為尋找NSCLC 的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

環(huán)狀RNA(circRNA)為具有閉環(huán)的非編碼RNA 的一種亞型,與傳統(tǒng)的線性RNA 明顯不同［7］。在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中,circRNA 的多種調(diào)控作用(包括作為分子海綿吸附miRNA 或蛋白、編碼多肽等)已引起人們廣泛關(guān)注［8］。相關(guān)研究例如：環(huán)狀RNA hsa_cic_0052112 通過吸附miR-125a-5p 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［9］,環(huán)狀RNA hsa_circ_0001313 與結(jié)腸癌細(xì)胞的放射敏感性有關(guān)［10］,環(huán)狀RNA hsa_circ_0000144 通過靶向miR-217/RUNX2 軸調(diào)節(jié)膀胱癌的進(jìn)展［11］。此外,越來越多的證據(jù)也證實(shí)了circRNA 在NSCLC 進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。例如：環(huán)狀RNA hsa_circ_0078767 通過吸附miR-330-3p 調(diào)節(jié)RASSF1A 的表達(dá),從而影響NSCLC 的進(jìn) 展［12］。環(huán) 狀RNA hsa_circ_0004015 通過靶 向miR-1183/PDPK1通路調(diào)節(jié)NSCLC的進(jìn)展［13］。環(huán)狀RNA hsa_circ_0008305 通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄中介因子1γ(TIF1γ)抑制了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的NSCLC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移［14］。而hsa_circ_0131457(circ-SOX4)為一種新的環(huán)狀RNA,其對(duì)腫瘤的調(diào)控作用尚不清楚。本研究為首次探討circ-SOX4 表達(dá)與肺TICs 干性的關(guān)系以及其促進(jìn)NSCLC 進(jìn)展的機(jī)制,這將為NSCLC 防治提供新的探索思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 NSCLC 細(xì)胞(A549,H1299,H1792,H226,H522,H1944,Calu-1 和H460)購自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存 庫(ATCC) (Manassas,VA,USA)；CCK-8 及Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體anti-Oct4、anti-Nanog、anti-SoX2、anti-Sox4、anti-GAPDH 均購自Abcam (Cambridge,USA)；抑制 劑RO4929097、LY294002、CHS828 和KYA1797 k購自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；表面標(biāo)記物CD133 購自 Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach,Germany)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。sh-circ-SOX4#1/2及其陰性對(duì)照shNCs 由Genechem(Shanghai,China)構(gòu)建。circ-SOX4 過表達(dá)質(zhì)粒和空pcDNA3.1 載體由ZonHon Biopharma Institute(Changzhou,Jiangsu,China) 構(gòu)建。6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)1 d,用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染,48h后收獲細(xì)胞。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應(yīng) 使用TRizol Reagent(Takara,Tokyo,Japan) 提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA。采用SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Waltham,MA,USA) 在Bio-Rad (Bio-Rad,Hercules,CA,USA) 上進(jìn)行qRT-PCR。相對(duì)表達(dá)歸一化至GAPDH,采用2-ΔΔCt方法測(cè)定表達(dá)量比值。

1.2.3 CCK-8 和平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按1×105/孔的數(shù)量接種于96 孔板中并培養(yǎng),用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、72、96 h)的增殖情況,通過分光光度板閱讀器(Olympus,Tokyo,Japan)監(jiān)測(cè)450 nm 的吸光度?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞按7×102/孔的數(shù)量接種于6 孔板中。培養(yǎng)14 d 后,固定細(xì)胞并染色,人工計(jì)數(shù)形成的克隆細(xì)胞 (≥50 個(gè)細(xì)胞)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6 孔板中并培養(yǎng),然后用冷磷酸鹽緩沖液沖洗2 次,再重懸細(xì)胞。隨后使用冰乙醇固定上述細(xì)胞1 h。最后使用Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒染色,并通過流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western blotting 用RIPA 緩沖液(Invitrogen)裂解細(xì)胞并提取總蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)移到PVDF (Bio-Rad)。在室溫下,用5%脫脂奶粉封閉2 h 后,TBST 緩沖液洗膜3 次,再與相應(yīng)一抗孵育過夜。次日將膜與羊抗兔抗體(1∶4000)或羊抗鼠二抗(1∶8000)在室溫下孵育1 h,隨后加入化學(xué)發(fā)光底物(Bio-Rad),最后使用ImageQuant LAS4000 成像分析儀(GE,USA)檢測(cè)。由Image J 軟件分析蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,并通過GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)和SPSS 19.0(SPSS,Chicago,IL,USA)軟件進(jìn)行分析。差異分析采用ANOV A 或Student's t-test。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ-SOX4 在肺TICs 中表達(dá)顯著上調(diào)并與TICs干性相關(guān) 查詢?cè)诰€數(shù)據(jù)庫(http://cgga.org.cn:9091/circRNADisease/),獲得NSCLC 原發(fā)腫瘤的circRNA 表達(dá)信息,并按ALDH1+和ALDH1-進(jìn)行分類比較。結(jié)果顯示：在ALDH1+腫瘤細(xì)胞中,hsa_circ_0000497、hsa_circ_0018082、hsa_circ_0024105、hsa_circ_0044360 及hsa_circ_0131457 表達(dá)顯著上調(diào)。見圖1A。

采用流式細(xì)胞術(shù)將肺癌細(xì)胞(A549、H1299、H1792、H226、H522、H1944、Calu-1 及H460) 按CD133+及CD133-進(jìn)行篩選分類。qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：相較于CD133-肺癌細(xì)胞,hsa_circ_0131457(circ-SOX4)在CD133+細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1B。

與陰性對(duì)照相比,過表達(dá)circ-SOX4 使CD133-H-1944/Calu-1 細(xì)胞中CD133 表達(dá)顯著上調(diào),而敲減circ-SOX 則顯著下調(diào)CD133+細(xì)胞中CD133 表達(dá),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1C。

圖1 circ-SOX4 在NSCLC 中的表達(dá)及與TICS 干性關(guān)系

2.2 下調(diào)circ-SOX4 抑制肺TICs 的增殖、促進(jìn)其凋亡 與陰性對(duì)照相比,敲減circ-SOX4 能顯著抑制體外培養(yǎng)48、72、96 h 時(shí)CD133+H-1944/Calu-1 細(xì)胞的增殖,減少CD133+H-1944/Calu-1 細(xì)胞的克隆形成,增加CD133+H-1944/Calu-1 細(xì)胞的凋亡,下調(diào)干性基因OCT4、Nanog、SOX2 和SOX4 的表達(dá),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2A,2B,2C,2D。

圖2 下調(diào)circ-SOX4 對(duì)肺TICs 增殖、凋亡及干性的影響

2.3 circ-SOX4 通過Wnt 通路促進(jìn)肺癌進(jìn)展 與陰性對(duì)照相比,過表達(dá)circ-SOX4 能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)48、72、96 h 時(shí)CD133-Calu-1 細(xì)胞的增殖,增加CD133-Calu-1 細(xì)胞克隆形成,抑制CD133-Calu-1 細(xì)胞凋亡,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Wnt 通路抑制劑KYA1797 k 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circ-SOX4 對(duì)上述細(xì)胞的影響。相較于單純過表達(dá)circ-SOX4,過表達(dá)circ-SOX4聯(lián)合KYA1797 k 能顯著抑制體外培養(yǎng)48、72 和96 h時(shí)CD133-Calu-1 細(xì)胞的增殖,減少CD133-Calu-1細(xì)胞克隆形成,并增加CD133-Calu-1 細(xì)胞凋亡,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而RO4929097(Notch通路抑制劑)、LY294002(PI3K/AKT 通路抑制劑)和CHS828(NF-κB 通路抑制劑)對(duì)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖和凋亡無顯著影響,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3A,3B,3C。

圖3 上調(diào)circ-SOX4 后,Wnt 等通路抑制劑對(duì)肺TICs 增殖及凋亡的影響

3 討論

目前,NSCLC 的主要治療方法包括手術(shù)、放化療、靶向及免疫治療。由于上述治療并非特異針對(duì)TICs,其殘留成為腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素［4］。多項(xiàng)研究闡明了環(huán)狀RNA 在乳腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌中的關(guān)鍵調(diào)控作用［9-11］。因此,需要以肺癌TICs 為研究NSCLC 進(jìn)展的切入點(diǎn),鑒定在肺癌TICs 中差異表達(dá)的circRNAs,并進(jìn)一步研究其生物作用。本研究篩選出在NSCLC 起始細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的circ-SOX4,驗(yàn)證其與TICs 干性正相關(guān)。并通過功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-SOX4 能促進(jìn)TICs 細(xì)胞增殖,正向調(diào)控其干性,抑制其凋亡。上述研究說明,circ-SOX4 是NSCLC 進(jìn)展中的重要癌基因。

越來越多的證據(jù)表明,Wnt 通路在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。例如,Wnt 途徑的蛋白質(zhì)可用作膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中調(diào)節(jié)CD133+癌癥干細(xì)胞的靶標(biāo)［15］。RHBDD1通過Wnt 途徑和對(duì)ZEB1 的調(diào)節(jié)促進(jìn)結(jié)直腸癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移［16］。在本研究中,探討了Wnt 通路在circ-SOX4促進(jìn)NSCLC 進(jìn)展中的作用。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-SOX4通過Wnt 通路促進(jìn)肺癌增殖,并抑制肺癌凋亡。由此說明Wnt 通路在NSCLC 進(jìn)展中發(fā)揮了正向調(diào)節(jié)作用,但Wnt 通路是如何激活,以及通路相關(guān)的上下游調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確。

綜上所述,在NSCLC 起始細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的circ-SOX4 能正向調(diào)控TICs 干性,并通過Wnt 通路促NSCLC 增殖,抑制其凋亡。因此,對(duì)circ-SOX4 及Wnt通路調(diào)控TICs 機(jī)制的研究將為NSCLC 防治提供新的思路。