趙 歡，龐義存*，趙 郡，邢慧敏，馬曉琳，霍翠敏

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051;2.河北省石家莊婦幼保健院產(chǎn)七科，河北 石家莊 050006；3.河北省第八人民醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050024)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，卵巢癌具有早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)晚，確診時多為中晚期，治療效果不佳，五年生存率低，預(yù)后差等特點[1]。尤其耐藥及復(fù)發(fā)率高這兩個問題一直以來是卵巢癌診治方面面臨的一大課題。研究表明，卵巢癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等機(jī)制是一個多因素參與的復(fù)雜過程[2]。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鞘脂類分子代謝的關(guān)鍵限速酶，位于細(xì)胞質(zhì)，它可以催化細(xì)胞內(nèi)鞘脂類分子代謝，生成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，S1P)[3]。S1P可與細(xì)胞內(nèi)的靶分子結(jié)合，還可以與相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白特異性結(jié)合運(yùn)輸至細(xì)胞外間隙，即腫瘤微環(huán)境，再與S1P受體(sphingosine1-phosphate receptors，S1PRs)特異性結(jié)合，以自分泌或旁分泌的形式促進(jìn)細(xì)胞的活化、增殖和遷移，并抑制其凋亡[3-7]。國內(nèi)外的研究表明，SPHK1在結(jié)直腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌等惡性實體腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)的增高意味著腫瘤惡性程度增高和患者預(yù)后不良。SPHK1基因參與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為，與腫瘤干細(xì)胞的形成有關(guān)，影響腫瘤耐藥性[3-7]。關(guān)于SPHK1在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥中作用方面的研究尚較少。NANOG是一個多能潛化因子，據(jù)報道，在一些腫瘤中，NANOG陽性的細(xì)胞具有很強(qiáng)大分化潛能、自我更新能力以及更強(qiáng)的化療耐藥性[8-12]。NANOG在一些腫瘤當(dāng)中被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。本研究旨在通過體外實驗，探討SPHK1對上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變的作用及其相關(guān)機(jī)制，通過本研究，可為臨床工作中上皮性卵巢癌的早期診斷、耐藥治療、靶向治療等提供新的依據(jù)。

1 材 料 與 方 法

1.1材料及主要試劑 SKOV3，人卵巢漿液性囊腺癌(購自中科院上海細(xì)胞庫)，選用10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce公司，美國)，Pierce ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，SYBRPremix Ex Taq Ⅱ(Takara公司)，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)，Matrigel膠(BD公司，美國)，SPHK1兔抗人單克隆抗體(武漢三鷹)，NANOG兔抗人單克隆抗體(Abcam公司，美國)，E-cadherin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司，美國)，β-actin 鼠抗人多克隆抗體(Servicebio公司，武漢)。引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含鏈霉素100 mg/L、青霉素100 U/mL和10% 胎牛血清)，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的貼壁生長細(xì)胞，常規(guī)0.25%胰蛋白酶+ 0.02% 乙二胺四乙酸消化后可傳代，或收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

SPHK1 siRNA以及陰性對照siRNA(NC siRNA)購自上海吉瑪公司，序列如下：SPHK1-siRNA,sense：5′-GUGCACCCAAACUACUUCU-TT-3′，antisense：5′-AGAAGUAGUUUGGGUGC-ACTT-3′。NC-siRNA，sense：5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACA-CGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染前24 h，制備單細(xì)胞懸液并計數(shù)，將細(xì)胞鋪入六孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到60%，第2天進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為陰性對照組(NC siRNA)、SPHK1 siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染步驟參考lipofectamineTM 2000的試劑說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)然后收集細(xì)胞用于后續(xù)的研究。

1.2.2CCK8(proliferation assay) 在siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h后,將SKOV3細(xì)胞分為2組: SPHK1 siRNA組、NC組。分別將2組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,并將細(xì)胞接種于96孔板中(單位劑量為3×103個/孔),設(shè)置3個復(fù)孔;分別培養(yǎng)24、48 h后,加入10 μL/孔的CCK試劑(終劑量為5 g/L),避光培養(yǎng)4 h，使用多功能酶標(biāo)儀來檢測450 nm波長處的各孔的吸亮度(optical density，OD)值。

1.2.3順鉑對SKOV3細(xì)胞的最大半數(shù)抑制濃度(IC50)測定 為了檢測DDP對SKOV3細(xì)胞增殖的影響,再分別將SPHK1 siRNA組、NC組兩組的對數(shù)生長期細(xì)胞消化制備成細(xì)胞懸液,按照3×103個/孔的單位劑量接種于96孔板,設(shè)置5個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,各組分別加入(0.8、1.5、2、3、4)mg/L的DDP作用24、48、72 h后,吸去培養(yǎng)液,更換為無血清培養(yǎng)基，加入10 μL/孔的CCK8試劑(終劑量為5 g/L),避光培養(yǎng)4 h。按上述方法再次計算SKOV3細(xì)胞在不同劑量DDP的作用下的存活率,應(yīng)用SPSS20.0軟件計算DDP的IC50值。

1.2.4平板克隆形成實驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，1.5 mL胰蛋白酶消化，加入10%FBS完全培養(yǎng)基制作單細(xì)胞懸液。將NC siRNA組以及SPHK1 siRNA組細(xì)胞均勻接種于6孔板，每孔1 000個細(xì)胞，每組設(shè)定3個復(fù)孔。以上細(xì)胞放置于含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，每日觀察細(xì)胞生長情況，間隔2～3 d細(xì)胞換液。終止培養(yǎng)后，甲醛2 mL固定細(xì)胞30 min，PBS清洗2遍后，加適量10% Giemsa染色15 min，空氣干燥。細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞數(shù)≥50個判定為克隆形成，通過光學(xué)顯微鏡觀察和肉眼計數(shù)計算細(xì)胞克隆形成情況，依照公式(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)計算細(xì)胞克隆形成率。

1.2.5Western blot 根據(jù)測定的蛋白樣品的實際濃度，計算不同組別樣品的上樣體積，加入5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液，98 ℃水浴15 min后置于冰中。SDS-PAGE電泳分離上樣蛋白質(zhì)，在凝膠上鋪PVDF膜，并放于兩層濾紙之間，行印跡電泳(恒流200 mA，90 min)蛋白轉(zhuǎn)膜。TBST漂洗PVDF膜(10 min)，置于5%封閉液中37 ℃恒溫2 h。棄封閉液，加1∶500一抗，4 ℃恒溫過夜。TBST洗膜3次，加過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 mL，37 ℃恒溫作用1.5 h，TBST洗膜10 min 3次。PVDF膜加入等體積的均勻混合的化學(xué)發(fā)光試劑A和B，作用1 min(暗室環(huán)境)，Epson V300 Photo凝膠成像系統(tǒng)顯色，AlphaEaseFC 4.0軟件分析條帶灰度，應(yīng)用以下公式計算蛋白相對表達(dá)量：蛋白相對表達(dá)量=待檢樣品蛋白的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.2.6qRT-PCR檢測 常規(guī)提取RNA，并采用分光亮度計測定其濃度及純度，按照說明書步驟應(yīng)用TAKARA 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照takara試劑盒說明配置擴(kuò)增體系。引物序列如下:SPHK1 forward,5′-GTGGTCGCCTTCCGCTTGG-3′，reverse,5′-GCTCCACGCAACCGCTGAC-3′;NANOG forward,5′-GCCTCCAGCAGATGCAA-GAACTC-3′，reverse,5′-CCAGGTCTGGTTGCT-CCACATTG-3′,MDR1 forward,5′-GATTGCT-CACCGCCTGTCCAC-3′，reverse,5′-CGTGCCA-TGCTCCTTGACTC-TG-3′,GADPH forward,5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，reverse,5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′?；虮磉_(dá)采用2-△△Ct公式計算。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗，應(yīng)用Probit分析藥物的IC50。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SPHK1基因轉(zhuǎn)染效率鑒定 qRT-PCR結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SPHK1 siRNA后，較對照組的mRNA下降約71%(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，SPHK1蛋白的表達(dá)在SPHK1 siRNA組較陰性對照組也出現(xiàn)明顯下降(圖1)。上述結(jié)果表明所用SPHK1 siRNA序列可以有效干擾SPHK1的表達(dá)，陰性序列對SPHK1蛋白表達(dá)無明顯影響，因此應(yīng)用可采用該SPHK1 siRNA及NC siRNA完成后續(xù)試驗。

圖1 siRNA干擾SKOV3細(xì)胞中SPHK1基因及蛋白表達(dá)

2.2SPHK1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖能力的影響 CCK8結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染24 h時，SPHK1 siRNA組與NC組的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.953)，而在48 h,SPHK1 siRNA組的增殖活力較對照組出現(xiàn)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021)(圖2)。

圖2 SPHK1基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響

2.3SPHK1對順鉑敏感性影響 分別予以不同濃度(0.8、1.5、2、3、4) mg/L的順鉑作用于SKOV3細(xì)胞24、48、72 h。不同濃度順鉑作用于兩組細(xì)胞后48 h，隨順鉑濃度的增加，對于SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用逐漸加強(qiáng)，隨著作用時間的延長，同一濃度的順鉑對于細(xì)胞生長的抑制作用也逐漸加強(qiáng)，這表明順鉑對于SKOV3細(xì)胞的作用呈時間和濃度依賴性。在下調(diào)SPHK1基因表達(dá)后，順鉑作用24 h，對SKOV3細(xì)胞無明顯抑制作用。在48 h及72 h，SKOV3細(xì)胞對同一時間點同一濃度的順鉑敏感性強(qiáng)于NC組，SPHK1 siRNA組細(xì)胞在順鉑作用48 h和72 h的IC50低于NC組[48 h：(2.53±0.119) mg/Lvs.(3.82±0.127) mg/L，P=0.007；72 h：(0.74±0.059) mg/Lvs.(1.55±0.050) mg/L，P=0.006],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.4SPHK1對卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響 應(yīng)用siRNA干擾SPHK1表達(dá)后，細(xì)胞克隆形成率出現(xiàn)下降，由(26.6±1.08)%降至(17.3±1.16)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。這表明SPHK1基因下調(diào)會引起SKOV3細(xì)胞的克隆形成能力下降(P=0.019)。

圖3 SPHK1基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞鉑耐藥的影響

2.5SPHK1對相關(guān)分子表達(dá)的影響 應(yīng)用siRNA干擾SPHK1表達(dá)后，通過qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，干細(xì)胞相關(guān)因子NANOG表達(dá)下降約30%，(P=0.007)耐藥相關(guān)因子MDR1表達(dá)下降約52%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。同時應(yīng)用Western blot方法進(jìn)行相應(yīng)基因的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)NANOG(P=0.010)、MDR1(P=0.021)的表達(dá)隨SPHK1基因的下調(diào)出現(xiàn)下降，這與mRNA的改變是一致的(圖5)。這表明SPHK1基因的下調(diào)可引起干細(xì)胞相關(guān)因子NANOG及耐藥相關(guān)因子MDR1的下降。

3 討 論

上皮性卵巢癌的發(fā)病率雖不是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤最高者，但其病死率卻居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[13-14]，最根本的原因是該類腫瘤具有發(fā)現(xiàn)晚，且易出現(xiàn)化療耐藥及復(fù)發(fā)等特點。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥是一個多種因素參與的復(fù)雜過程，這些過程中涉及多個信號通路及其相關(guān)因子[15]。鞘脂是調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能中的一項重要的調(diào)控子，可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝等過程。S1P是鞘脂代謝的最終產(chǎn)物，同樣可參與以上各種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，S1P是一種信號分子，通過細(xì)胞內(nèi)外機(jī)制發(fā)揮作用[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SPHK1在某些腫瘤中表達(dá)升高，并且參與腫瘤細(xì)胞的形成，但其在上皮性卵巢癌中的相關(guān)研究還不多見[17]。

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤由不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞構(gòu)成，其中的腫瘤干細(xì)胞指的是一小部分特殊類型的細(xì)胞亞群，它們具有無限自我更新能力、無限增資能力、多潛能分化能力、較高的致瘤性、對放化療耐受能力強(qiáng)[18-19]。不同種類的腫瘤具有不同的干細(xì)胞標(biāo)記物，目前的研究表明上皮性卵巢癌的干細(xì)胞標(biāo)記物可包括CD44、CD133、ALDH、NANOG等。其中NANOG是一個多能潛化因子，其與腫瘤細(xì)胞的自我更新及放化療耐藥密切相關(guān)。

卵巢癌化療一線方案是以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案[20],研究表明鉑耐藥是多因素、多水平、多基因參與的復(fù)雜過程，盡管對腫瘤的耐藥機(jī)制的認(rèn)識在不斷加深，并且隨著化療的規(guī)范，對于藥物的劑量以及應(yīng)用方案的調(diào)整在隨之不斷進(jìn)行，但是鉑類藥物耐藥仍不少見[21],為臨床卵巢癌治療效果造成了負(fù)面作用。多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是晚期上皮性卵巢癌化療失敗的主要原因之一。這種耐藥性與分子活性和藥物泵的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞的異常pH、DNA損傷修復(fù)能力、藥物排毒、凋亡途徑以及許多基因的甲基化有關(guān)[22-24]。MDR可以降低腫瘤細(xì)胞中化療藥物的濃度，從而降低這些腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，在細(xì)胞發(fā)生耐藥性后，能夠?qū)Σ煌瘜W(xué)藥物的各種結(jié)構(gòu)無關(guān)的機(jī)制作出反應(yīng)并表現(xiàn)出交叉耐藥性，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因MDR1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)水平明顯高于交界性腺瘤和良性腺瘤，MDR1基因產(chǎn)物P-糖蛋白(MDR1/P-gp)是引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生多重耐藥的主要機(jī)制之一[25]。MDR1/P-gp作為一種主動轉(zhuǎn)運(yùn)底物的外排泵，其過度表達(dá)可以導(dǎo)致化療藥物從腫瘤細(xì)胞中的外排增強(qiáng)，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效化療藥物的濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物表現(xiàn)出抵抗性。本研究通過siRNA對上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的SPHK1基因進(jìn)行干擾，降低SPHK1基因的表達(dá),對SKOV3細(xì)胞的一些細(xì)胞功能及相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，SPHK1的降低會導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的下降，也會引起腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的降低。應(yīng)用CCK8進(jìn)行細(xì)胞增殖能力試驗，反應(yīng)了細(xì)胞的群體增殖能力，而克隆形成實驗，反應(yīng)的則是獨立細(xì)胞的自我更新及增殖能力。本研究還對下調(diào)SPHK1基因后上皮性卵巢癌的鉑耐藥性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，SPHK1基因的下調(diào)會引起SKOV3細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性增加。除此之外，對SPHK1基因下調(diào)后腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物NANOG以及多重耐藥基因MDR1基因及蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，試圖初步探討其內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明下調(diào)SPHK1基因的表達(dá)會引起腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物NANOG以及多重耐藥基因MDR1的表達(dá)降低。本研究結(jié)果表明，SPHK1基因?qū)τ谏掀ば月殉舶┑膼盒陨飳W(xué)行為起到促進(jìn)作用，其可能通過調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的形成以及通過作用于多重耐藥基因而實現(xiàn)的，SPHK1可能成為上皮性卵巢癌發(fā)展及鉑耐藥的一個預(yù)測因子，也可能作為上皮性卵巢癌治療及鉑耐藥逆轉(zhuǎn)的一個新的靶點。

本研究對SPHK1與卵巢癌細(xì)胞的增殖性、克隆形成能力及耐藥性之間的關(guān)系及其內(nèi)在可能存在的機(jī)制進(jìn)行了初步的探討，但是尚有許多不足之處，如：SPHK1基因與上皮性卵巢癌的侵襲性、遷移性等其他生物學(xué)行為的關(guān)系尚未進(jìn)行探討；SPHK1基因與腫瘤的關(guān)系有待更多的組織學(xué)研究以及體內(nèi)實驗研究；SPHK1基因是如何影響上皮性卵巢癌腫瘤干細(xì)胞形成的，尚需進(jìn)一步探索。