張偉東，張偉威，閻 彥，周靜芳，程業(yè)童，王 娜

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 秦皇島 066000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重威脅患者生命的安全，易導(dǎo)致重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(intensive care unit,ICU)患者死亡。因此，有效控制感染是降低ICU膿毒癥患者病死率的關(guān)鍵。美羅培南具有抗菌譜廣、殺菌作用強(qiáng)、對(duì)絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定等特點(diǎn)，是治療重癥感染的一線(xiàn)藥物。早期的美羅培南經(jīng)驗(yàn)性治療對(duì)改善膿毒癥患者的臨床癥狀、降低病死率具有重要意義。隨著美羅培南在臨床上的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多[1-2]。2014—2019年，全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：鮑不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南的耐藥率逐年上升[3-4]。ICU膿毒癥患者多存在基礎(chǔ)疾病，易出現(xiàn)多重細(xì)菌感染，導(dǎo)致其生理、病理狀態(tài)迅速改變，使得美羅培南在其體內(nèi)的表觀分布容積、藥物清除率等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與健康受試者存在較大差異。因此，開(kāi)展美羅培南治療藥物臨床監(jiān)測(cè)對(duì)促進(jìn)合理用藥、減少耐藥菌的產(chǎn)生具有重大意義。目前，人血漿中美羅培南濃度的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[10-11]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)等[12]。但HPLC法分析時(shí)間較長(zhǎng)，劉炎等[8]采用HPLC法結(jié)合截尾技術(shù)測(cè)定美羅培南血藥濃度，樣品分析時(shí)間為7 min；陳玲等[9]采用HPLC法檢測(cè)人血漿中美羅培南濃度，樣品分析時(shí)間約為5.6 min；劉洪川等[11]采用雙內(nèi)標(biāo)LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中美羅培南濃度，樣品分析時(shí)間為4 min；王曉雪等[12]采用UPLC-MS/MS法進(jìn)行美羅培南和亞胺培南治療藥物監(jiān)測(cè)，單次樣品分析時(shí)間大于4 min。本文將建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的LC-MS/MS法，并將該方法用于ICU膿毒癥患者美羅培南治療藥物的臨床監(jiān)測(cè)，為科學(xué)合理的個(gè)體化給藥方案的制定提供技術(shù)支持。

1 材 料 與 方 法

1.1藥品 美羅培南(批號(hào)：130506-201403；純度：87%)，內(nèi)標(biāo)：卡馬西平(批號(hào)：100142-201706；純度：100%)，均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。健康人空白血漿購(gòu)自于秦皇島市第一醫(yī)院血液中心。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購(gòu)自于德國(guó)默克公司；水為超純水(18 Ω/cm2)。

1.2儀器 LC-30AD高效液相色譜儀(日本島津公司)，由中央控制器、自動(dòng)進(jìn)樣器(帶制冷功能)、在線(xiàn)脫氣機(jī)、二元高壓輸液泵、柱溫箱組等成； ATRAP 6500質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)，配電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)；XS105DU十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)METTLER TOLED公司)；超純水Milli-Q系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.3色譜條件 色譜柱：Kinetex-C18 100A(2.6 μm,50 mm× 4 mm)；流動(dòng)相：甲醇-1‰甲酸水溶液(60∶40,v/v)；流速：0.4 mL/min，等度洗脫；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

1.4質(zhì)譜條件 ESI，正離子模式檢測(cè)、多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring, MRM)模式定量。ESI源噴霧電壓為4 500 V；離子源溫度為500 ℃；碰撞能量(collision energy, CE)分別為19,22 eV；用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 384→141(美羅培南)、m/z 237→194(內(nèi)標(biāo)：卡馬西平)。

1.5溶液制備 美羅培南對(duì)照品溶液：取美羅培南對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加水溶解、定容，得到0.87 g/L美羅培南儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中避光保存。分別精密量取一定量的儲(chǔ)備液適量，置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L美羅培南標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液。美羅培南低、中、高3個(gè)質(zhì)控工作液濃度分別為0.2、7、20 mg/L。內(nèi)標(biāo)工作溶液制備：取卡馬西平對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容，配置成1.00 g/L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存、備用。精密量取卡馬西平儲(chǔ)備液6 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋、定容，配制成0.6 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃冰箱中避光保存、備用。

1.6含藥血漿制備 取不同濃度美羅培南對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用空白血漿稀釋得0.02、1、2、5、10、15、20、30 mg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)試液，渦旋30 s，-20 ℃冰箱備用。另取不同濃度美羅培南對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加空白血漿，配制濃度為0.2、7、20 mg/L的美羅培南低、中、高質(zhì)控樣品，-20 ℃冰箱備用。

1.7樣本處理 取血漿樣品100 μL，置于2 mL 離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋混勻30 s，再加水100 μL，渦旋混勻1 min后，加蛋白沉淀劑乙腈1 mL，渦旋混勻1 min?；靹蚝笾糜? ℃離心機(jī)中，1×104r/min離心10 min。取上清液100 μL加純水900 μL混勻，取100 μL置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣3 μL分析。

1.8方法學(xué)考察

1.8.1專(zhuān)屬性 按1.7樣本處理方法，分別取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿, 加甲醇(代替內(nèi)標(biāo)工作液)，得空白血漿色譜圖；另取空白血漿，分別測(cè)定：空白血漿+卡馬西平、空白血漿+美羅培南+卡馬西平、患者血漿+卡馬西平。

1.8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量下限 取含藥標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)血漿樣品按 “1.7樣本處理”方法操作，以美羅培南濃度(x)為橫坐標(biāo)，美羅培南與內(nèi)標(biāo)卡馬西平的峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法(加權(quán)系數(shù)為1/x2)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低濃度點(diǎn)為定量下限。

1.8.3精密度與回收率 分別取美羅培南血漿質(zhì)控樣品(0.2、7、20 mg/L)各6份，按“1.7樣本處理”方法處理后，進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定3 d，得日內(nèi)和日間精密度；分別配制低、中、高3個(gè)濃度的美羅培南質(zhì)控樣品各12份，6份用于提取前加入工作液和內(nèi)標(biāo)，6份用于提取后加入工作液和內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率。

1.8.4穩(wěn)定性 考察美羅培南儲(chǔ)備液在室溫(20 ℃)放置2、4 h，4 ℃冰箱中放置4、6 h，-20 ℃冷凍保存21 d條件下的穩(wěn)定性?？疾烀懒_培南的低、中、高濃度的血漿質(zhì)控樣品在室溫放置2、4 h，樣品處理后室溫放置(2、4 h)、4 ℃樣品托盤(pán)(4、6 h)、-20 ℃冷凍保存(12、24 h)，-20 ℃冰箱中循環(huán)凍融3次及-20 ℃長(zhǎng)期冷凍保存21 d條件下的穩(wěn)定性。

1.8.5基質(zhì)效應(yīng) 分別取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿100 μL，加乙腈1 000 μL渦旋混合后得空白基質(zhì)，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品100 μL和內(nèi)標(biāo)100 μL，進(jìn)樣分析，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)1。以純水代替空白血漿，同法操作，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值 A2。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%。

2 結(jié) 果

2.1方法學(xué)評(píng)價(jià)

圖1 LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中美羅培南典型色譜圖

2.1.1專(zhuān)屬性 方法專(zhuān)屬性結(jié)果見(jiàn)圖1。美羅培南和內(nèi)標(biāo)的可完全分離，峰形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間分別為1.12 min和2.50 min。空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測(cè)定。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和定量下限 血漿中美羅培南濃度在0.02～30 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=4.934×10-5x+2.083×10-2(r=0.999 9)，定量下限為0.02 mg/L。

2.1.3精密度與回收率 美羅培南的日內(nèi)、日間RSD<3%，回收率在91.96%～100.97%之間，見(jiàn)表1。

表1 人血漿中美羅培南精密度和回收率Table 1 Precision and extraction recovery of meropenem in human plasma (n=6)

2.1.4穩(wěn)定性 美羅培南儲(chǔ)備液在室溫(20 ℃)放置4 h，4 ℃冰箱中放置6 h，-20 ℃冷凍保存21 d穩(wěn)定。美羅培南血漿質(zhì)控樣品在室溫放置4 h，樣品處理后室溫放置4 h、4 ℃樣品托盤(pán)放置6 h、-20 ℃冷凍保存24 h、-20 ℃冰箱中循環(huán)凍融3次及-20 ℃長(zhǎng)期冷凍保存21 d穩(wěn)定。

2.1.5基質(zhì)效應(yīng) 美羅培南低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)在93.24%～98.56%，內(nèi)標(biāo)卡馬西平的歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子為97.82%。結(jié)果表明：美羅培南和內(nèi)標(biāo)測(cè)定不受基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.2方法應(yīng)用 結(jié)合我院美羅培南細(xì)菌耐藥檢測(cè)結(jié)果，將美羅培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)1 mg/L作為有效血藥濃度范圍下限，目標(biāo)濃度范圍為1～30 mg/L。197例次膿毒癥患者美羅培南血藥濃度范圍監(jiān)測(cè)結(jié)果為0～16.33 mg/L。見(jiàn)表2。

表2 197例次膿毒癥患者美羅培南血藥濃度Table 2 Plasma concentration of meropenem in 197 sepsis patients

3 討 論

本研究建立了LC-MS/MS法測(cè)定膿毒癥患者血漿中美羅培南濃度，該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，樣品分析時(shí)間為3 min，大大縮短了樣品檢測(cè)時(shí)間，能夠滿(mǎn)足臨床監(jiān)測(cè)需求。

在臨床實(shí)際采樣過(guò)程中，血液樣本常伴有溶血和乳糜血現(xiàn)象，分別考察了輕、中、重度溶血和脂血癥對(duì)美羅培南檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：輕、中、重度溶血和脂血癥不影響血漿中美羅培南結(jié)果測(cè)定，但重度脂血癥血液樣本會(huì)給樣品前處理帶來(lái)一定困難。因此，在處理重度脂血癥樣本時(shí)，應(yīng)給予充分離心和渦旋振蕩。同時(shí)，考察了枸櫞酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑對(duì)美羅培南測(cè)定的影響。結(jié)果表明：枸櫞酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉不影響美羅培南和卡馬西平測(cè)定。

美羅培南血漿蛋白結(jié)合率低，主要通過(guò)腎臟以原型排泄，患者肌酐清除率顯著影響美羅培南的清除率[13]。由于膿毒癥患者肝、腎功能的改變，同時(shí)伴有多器官功能障礙，使美羅培南在膿毒癥患者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與健康受試者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在較大差異從而影響到臨床療效[14-15]，所以應(yīng)對(duì)膿毒癥患者體內(nèi)美羅培南血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行給藥方案調(diào)整。197例次膿毒癥患者中，美羅培南血藥濃度低于1 mg/L占比為67.0%。因此，膿毒癥患者在采用美羅培南治療過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)治療藥物監(jiān)測(cè)結(jié)果，結(jié)合患者性別、年齡、體重、肝腎功能等實(shí)際情況給予適當(dāng)?shù)慕o藥方案調(diào)整，以期達(dá)到最佳治療效果。研究表明：美羅培南全血樣本在2～6 ℃和室溫下放置6 h開(kāi)始降解，血漿樣品處理后3 h穩(wěn)定[7,10]。本研究穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明美羅培南血液樣本室溫放置4 h、樣品處理后4 ℃放置6 h穩(wěn)定，但美羅培南穩(wěn)定性差，應(yīng)在樣本采集后盡快完成樣本處理、檢測(cè)，如不能在第一時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)將美羅培南血液樣本離心后，-20 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)化的美羅培南血液樣本采樣流程直接影響美羅培南檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立了《臨床樣本采樣流程》，并對(duì)臨床醫(yī)師和護(hù)師進(jìn)行培訓(xùn)，保證樣品采集、存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而保證美羅培南血藥濃度檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高美羅培南治療膿毒癥的有效性，實(shí)現(xiàn)從經(jīng)驗(yàn)治療到個(gè)體化精準(zhǔn)治療的轉(zhuǎn)變。本試驗(yàn)建立了敏感、準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)便、快速的美羅培南檢測(cè)方法，為美羅培南藥物的臨床監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。根據(jù)美羅培南血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了臨床治療方案從經(jīng)驗(yàn)治療模式向精準(zhǔn)的個(gè)體化治療的轉(zhuǎn)變，對(duì)提高美羅培南治療的有效性、有效控制細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生均有重要意義。