仝亞坤，趙丹丹，安國靜

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050035；3.河北中石油中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 廊坊 065000)

宮頸癌是全世界女性常見的癌癥，隨著預(yù)防和治療概念和知識的發(fā)展迅速，人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)已被確定為導(dǎo)致宮頸癌的主要因素[1-2]。雖然在大多數(shù)宮頸癌病例中發(fā)現(xiàn)了HPV感染[3]，但疾病進展需要遺傳和表觀遺傳學(xué)改變, DNA甲基化和組蛋白修飾引起的表觀遺傳改變在宮頸癌中已被廣泛研究，非編碼RNA，尤其是microRNA也在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]。MiR-181d是一種對腫瘤具有調(diào)控作用的microRNA，可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(intracellular phosphatidylinositol kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)途徑抑制胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[6]，還可以通過調(diào)節(jié)KNAIN2基因的表達對胰腺癌的發(fā)生起抑制作用[7]，同時也可以通過調(diào)控IGF1/PI3K信號通路對膠質(zhì)瘤細胞周期發(fā)揮干預(yù)作用[8]。由此可見miR-181d是多種腫瘤的分化、增殖、凋亡調(diào)控的重要調(diào)控分子，但其在宮頸癌中的作用尚不清晰。細胞硫?；匏倜?sulfation rate-limiting enzyme，PAPSS2)/蛋白聚糖(proteoglycans，VCAN)是調(diào)控腫瘤細胞遷徙的重要信號通路，PAPSS2基因的甲基化/羥甲基化修飾也與宮頸癌的總體生存率顯著相關(guān)[9], VCAN也可以作為癌癥的獨立風(fēng)險預(yù)測標(biāo)志物[10]， miR-181d是否可以通過PAPSS2/VCAN信號通路對宮頸癌細胞發(fā)揮調(diào)控作用有待深入研究，因此本研究擬通過細胞實驗探究轉(zhuǎn)染miR-181d-5p對宮頸癌增殖、凋亡和侵襲的影響，分析是否會引發(fā)PAPSS2/VCAN表達的變化，并通過裸鼠荷瘤實驗在體內(nèi)證實miR-181d-5p對宮頸癌生長的影響，為miR-181d-5p在宮頸癌細胞中發(fā)揮的作用提供分子機制和理論基礎(chǔ)。

1 材 料 與 方 法

1.1材料 人宮頸癌細胞系Hela購自國家模式與特色實驗細胞資源庫/國家科技資源共享服務(wù)平臺(上海)。8周齡雌性SPF級裸鼠20只，(20±2)g，購于中生北動(北京)科技發(fā)展有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2019-0051，飼養(yǎng)條件為：溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，12 h黑暗/12 h光照，自由飲水飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分組。

1.2主要器材及試劑 MTT Assay試劑盒(Cell Proliferation)(ab211091)、Annexin V-FITC Apoptosis Staining/Detection Kit(ab14085)購于美國abcam公司；Lipofectamine TM 3000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自于美國Thermo Fisher Scientific 公司；miR-181d-5p質(zhì)粒及NC 質(zhì)粒由吉瑪基因有限公司合成；細胞培養(yǎng)皿等試驗耗材購于美國BD公司，倒置顯微鏡購于德國蔡司公司；Western blot電泳儀器購自美國BIO-RAD公司；流式細胞分析儀FACS Calibur購于美國BD公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法 人宮頸癌細胞Hela細胞培養(yǎng)條件:生長培養(yǎng)基DMEM(gibico，貨號:11995040)+10% FBS(gibico 貨號: 16000-044)+1% P/S(gibico，貨號15140-022);培養(yǎng)條件：空氣 95%；CO25%;溫度37 ℃，培養(yǎng)密度：1×106cells/培養(yǎng)皿；換液及傳代：每隔1 d更換培養(yǎng)液，2～3 d傳代，傳代比例為1∶3～4。轉(zhuǎn)染條件：按照LipofectamineTM 3000說明書對細胞進行轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒和miR-181d-5p質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6～8 h后更換完全培養(yǎng)基，CO25%;溫度 37 ℃培養(yǎng)。人宮頸癌細胞Hela細胞分為對照組、NC組和miR-181d-5p組。

1.3.2裸鼠荷瘤 將處于對數(shù)生長期的人宮頸癌細胞Hela以PBS調(diào)整細胞密度為1×107個/mL的細胞懸液。將細胞懸液用1 mL無菌注射器接種于20只裸鼠左側(cè)背部皮下，每只裸鼠注射0.2 mL。隨機分為對照組(n=10)和miR-181d-5p組(n=10)。對照組注射野生型Hela細胞，miR-181d-5p組注射轉(zhuǎn)染miR-181d-5p的Hela細胞，7 d后測量腫瘤體積，建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):皮下瘤塊體積≥0.5 cm3，腫瘤生長達不到標(biāo)準(zhǔn)的進行裸鼠不進入實驗，成瘤后每3 d用游標(biāo)卡尺測量皮下瘤塊的長短徑，計算瘤體積=長徑×短徑×短徑1/2[11]，連續(xù)21 d，繪制2組裸鼠腫瘤生長曲線及每只裸鼠腫瘤生長曲線。

1.3.3MTT實驗 將消化后的細胞用完全培養(yǎng)基重懸，接種于96孔培養(yǎng)板；細胞密度為103～104個/孔，每孔培養(yǎng)基總量200 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。嚴(yán)格按照MTT操作說明進行實驗，加入2 g/L的MTT液(50 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μL/孔)，將培養(yǎng)板置于蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀檢測各孔OD值(波長=570 nm)，每孔設(shè)置3個副孔，進行檢測。

1.3.4細胞凋亡實驗 將各組細胞用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化后， 800 r/min 4 ℃離心5 min收集細胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，800 r/min 4 ℃離心5 min。收集細胞加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。嚴(yán)格按照試劑盒要求加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，輕輕混勻，反應(yīng)條件為：避光、室溫10～15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上；樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.3.5Transwell侵襲實驗 按照Transwell說明在培養(yǎng)板下室加入300 μL完全培養(yǎng)基(含有FBS的培養(yǎng)基)，37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)24 h。擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞，小心取出上室做好標(biāo)記，用棉簽擦去上室面細胞，取2 mL固定液加入孔板，放入Transwell，固定10～15 min，PBS清洗2次，每次5 min；在孔板中加入1 mL染色液，使Transwell浸泡在液體中， 10 min后棄掉染色液，加入1 mL調(diào)色液A，加一滴調(diào)色液B，溫和混勻；用PBS清洗1次，用刀片取下膜，放在載玻片上，加1～2滴封片液，蓋上蓋玻片，隨機選取3個視野進行計數(shù)顯微鏡下觀察。

1.3.6Western blot 檢測蛋白表達 取出生長對數(shù)期的細胞，加入1 mL RIPA提取裂解液制成蛋白提取液，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后，用1.5 mL EP管分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，10 min,分離膠電壓120 V，1.5 h, 轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉。加入特異性一抗PAPSS2(1∶3 000，ab155585，abcam，英國)，VCAN(1∶5 000，ab177480，abcam，英國)，GAPDH(1∶10 000，ab16663，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進行半定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞活力的影響 與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組細胞增殖受到顯著抑制，并且隨著時間的增加抑制作用進一步增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞活力的影響Table 1 Effect of miR-181d-a-5p on the viability of human cervical cancer Hela cells

2.2miR-181d-5p對人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響 miR-181d-5p對人宮頸癌Hela細胞具有顯著的促進凋亡作用，流式結(jié)果表明,與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組細胞凋亡顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表2。

表2 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞凋亡的影響Table 2 Effect of miR-181d-5p on apoptosis of human cervical cancer Hela cells

圖1 miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞凋亡的影響

2.3miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela遷移和侵襲能力的影響 Transwell 結(jié)果表明，miR-181d-5p對宮頸癌細胞侵襲具有顯著的抑制作用，與對照組和NC組比較, miR-181d-5p組細胞侵襲數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)， NC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela侵襲能力的影響

表3 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞侵襲數(shù)量的影響Table 3 Effect of miR-181d-a-5p on the invasion number of human cervical cancer Hela cells

2.4miR-181d-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞PAPSS2/VCAN信號通路的影響 與對照組和NC組比較，miR-181d-5p組PAPSS2和VCAN蛋白表達均有降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3，表4。

2.5miR-181d-5p對裸鼠腫瘤生長的影響 兩組裸鼠荷瘤后精神狀態(tài)均較好、活動頻繁、飲食飲水量正常。荷瘤第7天對小鼠進行篩選，各組有5只裸鼠腫瘤體積≥0.5 cm3且大小均一，超腫瘤體積未達到實驗標(biāo)準(zhǔn)者未入組本試驗。miR-181d-5p組裸鼠腫瘤體積顯著低于對照組裸鼠，miR-181d-5p組裸鼠平均生長受到顯著抑制，在第21天時腫瘤質(zhì)量顯著低于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

圖3 miR-181d-5p對Hela細胞PAPSS2/VCAN蛋白的影響

表4 miR-181d-a-5p對人宮頸癌細胞Hela細胞PAPSS2/VCAN信號通路蛋白的影響Table 4 Effect of miR-181d-a-5p on PAPSS2/VCAN signaling pathway proteins of human cervical cancer Hela cells

表5 miR-181d-5p對裸鼠腫瘤生長的影響Table 5 Effect of miR-181d-5p on tumor growth in nude mice

3 討 論

子宮頸癌是女性癌癥死亡的主要原因之一。在世界范圍內(nèi)，子宮頸癌是女性第四常見的惡性腫瘤，估計每年新增53萬例，死亡27萬例,全世界約85%的宮頸癌死亡發(fā)生在不發(fā)達國家或發(fā)展中國家，低收入和中等收入國家的病死率是發(fā)達國家的18倍[12-13]。HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因。高危型HPV感染和HPV基因組整合到宮頸上皮細胞的宿主染色體是宮頸病變腫瘤進展的關(guān)鍵早期事件[14]。高浸潤性宮頸癌發(fā)生發(fā)展中伴隨這基因組和表觀基因組的調(diào)控，是由高危型HPV引起的，通常先于上皮內(nèi)瘤變的一個長階段。在侵襲之前，HPV宿主細胞中發(fā)生表觀基因組改變，如microRNA表達失調(diào)，在肝癌中經(jīng)常被觀察到[15]， MiR-181d-5p在多種組織中具有調(diào)控作用，如可通過PI3K/AKT途徑促進PC12細胞的神經(jīng)軸突生長[16], 同時miR-181d-5p和miR-409-3p在膠質(zhì)母細胞瘤中的協(xié)同調(diào)控作用[17],miR-181d-5p可以通過調(diào)控骨保護素抑制破骨細胞的生成[18]，但MiR-181d-5p在宮頸癌發(fā)生中的機制和作用方式仍不完全清楚。本研究通過人子宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染MiR-181d-5p證實，MiR-181d-5p可以抑制子宮頸癌細胞的增殖能力，增加細胞凋亡比例，提示MiR-181d-5p對腫瘤細胞的增殖發(fā)生干預(yù)和調(diào)控作用。

本研究通過Transwell實驗證實MiR-181d-5p可以顯著抑制腫瘤細胞的侵襲，因此關(guān)注了腫瘤細胞侵襲相關(guān)的重要信號通路PAPSS2/VACN信號通路在此過程中的變化。PAPSS2在腫瘤細胞的侵襲中發(fā)揮重要作用，PAPSS2的升高導(dǎo)致細胞中硫酸化修飾增加，破壞細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的內(nèi)穩(wěn)定性。不平衡的ECM觸發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化程序并促進細胞遷移和轉(zhuǎn)移[19]。VCAN屬于硫酸軟骨素蛋白多糖組，是細胞外基質(zhì)的主要成分之一，通過直接或間接與細胞和分子相互作用，與細胞因子、生長因子、細胞表面和基質(zhì)蛋白及其蛋白核心形成合適的細胞外微環(huán)境，從而誘導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,在細胞黏附、存活、增殖、遷移和ECM組裝中發(fā)揮重要作用[20]。本研究通過Western blot 實驗證實，轉(zhuǎn)染miR-181d-5p的細胞 PAPSS2蛋白和VCAN蛋白的表達水平顯著降低，提示出宮頸癌胞外基質(zhì)功能的紊亂，干預(yù)了細胞黏附相關(guān)的信號通路，從而抑制了腫瘤細胞的侵襲能力。同時通過建立裸鼠荷瘤模型進一步證實了MiR-181d-5p在體內(nèi)的作用，MiR-181d-5p組小鼠的腫瘤生長顯著受到抑制，生長曲線顯著低于對照組，并且腫瘤質(zhì)量降低，提示出MiR-181d-5p對腫瘤生長具有顯著的抑制作用，進一步驗證了細胞學(xué)實驗的結(jié)論。

綜上所述，miR-181d-5p具有抑制子宮頸癌細胞增殖、促進子抑制宮頸癌細胞凋亡及并抑制侵襲的作用，其機制可能與抑制PAPSS2/VCAN信號通路活性相關(guān)，本研究將進一步通過臨床樣本進行驗證，探究PAPSS2/VACN蛋白在子宮頸癌組織和癌旁組織的表達，從原位上證實miR-181d-5p對宮頸癌的調(diào)控作用，而為臨床診斷提供理論基礎(chǔ)。