趙國(guó)杰，楊宏偉，趙鵬飛

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院普外二科，河北 邯鄲 056000；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤一科，河北 邯鄲 056000；3.河北省邯鄲市第七醫(yī)院外四科，河北 邯鄲 056000)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤[1-2]，其發(fā)病率和病死率較高且呈逐漸上升趨勢(shì)[3]。HCC患者早期沒(méi)有明顯的臨床癥狀[4]，后期伴隨病情進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、腹脹、嘔吐、消瘦等臨床癥狀[5-6]。HCC不僅會(huì)導(dǎo)致患者劇烈的疼痛，還可能會(huì)因其導(dǎo)致的食管靜脈曲張的破裂大出血而直接導(dǎo)致死亡，對(duì)人體危害大。因此，提高對(duì)HCC的診斷水平有助于疾病的預(yù)防和治療。近年來(lái)甲胎蛋白被廣泛應(yīng)用于HCC的臨床檢測(cè)，但肝炎、肝硬化等疾病患者的甲胎蛋白也會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，從而影響其用于HCC檢測(cè)的可信度[7]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)通過(guò)編碼蛋白質(zhì)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)參基因的穩(wěn)態(tài)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和糖代謝，參與HCC發(fā)生發(fā)展[8]?？扇苄愿事短鞘荏w(soluble mannose receptor，sMR)是一種新型血清巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志物，由甘露糖受體在細(xì)胞膜上裂解基質(zhì)金屬蛋白酶形成，可以參與維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、識(shí)別病原、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、抗原遞呈等過(guò)程[9]。研究表明，慢性病毒性肝炎患者血清sMR水平呈高表達(dá)并且與病情密切相關(guān)[10]。研究表明，miR-758-3p對(duì)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[11]。上述三種指標(biāo)與HCC有著密切的聯(lián)系，而在國(guó)內(nèi)暫未見(jiàn)三種指標(biāo)聯(lián)合用于HCC診斷的報(bào)道，所以本研究旨在探討HCC患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平變化并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為肝癌患者的臨床診斷與治療提供新思路。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2020年9月—2021年6月來(lái)我院進(jìn)行手術(shù)治療的68例肝癌患者為試驗(yàn)組，另取同時(shí)間段來(lái)我院就診的42例慢性肝炎患者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 68例肝癌患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019 版)》標(biāo)準(zhǔn)[12]；②臨床基本資料完備。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤；②患有自身免疫系統(tǒng)疾病；③妊娠期及哺乳期患者；④患有血液系統(tǒng)疾病。2組性別、年齡、體重指數(shù)(body mass index,BMI)等臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data between two groups

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)HSF1水平 手術(shù)中取肝癌患者癌組織制作切片，慢性肝炎患者取活檢組織只做切片，切片脫蠟，高壓熱修復(fù)抗原，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗HSF1(1∶450)(生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技公司，規(guī)格：100 μg)，4 ℃過(guò)夜，PBS(生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技公司，規(guī)格：250 g)水洗，加二抗(生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技公司，規(guī)格：250 μL)，37 ℃孵育30 min，顯色，蘇木精(生產(chǎn)廠家：賽默飛世爾科技公司，規(guī)格：500 mL)復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中樹(shù)膠封固。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒。每例選6個(gè)視野計(jì)算(400倍)。根據(jù)細(xì)胞染色計(jì)分[13]：無(wú)色：0分；淡黃：1分；棕黃：2分；棕褐：3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：<5%：0分；5%～10%：1分；11%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。二者相乘，<3為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA )檢測(cè)血清sMR水平 抽取患者空腹靜脈血5 mL，以3 500 r/min的速度離心10 min，取上清存于-80 ℃冰箱。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。于450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)量其吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3RT-qPCR法檢測(cè)miR-758-3p表達(dá)水平 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：65 ℃、10 min,37 ℃、60 min,85 ℃、5 min，所得c DNA保存于-20 ℃冰箱備用。cDNA擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算miR-758-3p相對(duì)U6的表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)滿(mǎn)足正態(tài)性分布，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對(duì)象HSF1表達(dá)情況比較 試驗(yàn)組HSF1陽(yáng)性率、血清sMR表達(dá)水平高于對(duì)照組，miR-758-3p表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示試驗(yàn)組HSF1陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3，圖1。

表3 兩組研究對(duì)象HSF1表達(dá)情況比較Table 3 Comparison of HSF1 expression between two groups

圖1 兩組研究對(duì)象HSF1陽(yáng)性表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

2.2HSF1、sMR、miR-758-3p表達(dá)水平在不同臨床病理特征組之間的比較 HSF1、sMR、miR-758-3p表達(dá)水平在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、有無(wú)微血管侵犯組、不同病理分期組、不同AFP水平組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同性別、年齡、BMI組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.3HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的價(jià)值分析 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的截?cái)嘀禐?.500%，82.230 ng/L，0.845，曲線(xiàn)下面積為0.947，0.983，0.787，聯(lián)合HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的曲線(xiàn)下面積為1.000，高于單獨(dú)診斷，見(jiàn)表5，圖2。

表4 HSF1、sMR、miR-758-3p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Relationship between expression levels of HSF1, sMR and miR-758-3p and clinicopathological characteristics

表4 (續(xù))

表5 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的效能分析Table 5 Efficacy analysis of HSF1, sMR and miR-758-3p in the diagnosis of hepatocellular carcinoma

圖2 HSF1、sMR、miR-758-3p診斷肝癌的ROC圖

3 討 論

肝癌的發(fā)病率和病死率都較高，現(xiàn)階段，在全球范圍內(nèi)，每年大約有60萬(wàn)人死于肝癌。由于肝癌患者早期癥狀不明顯，其診斷、治療及預(yù)后面臨著巨大的挑戰(zhàn)，所以找尋肝癌預(yù)測(cè)、診斷、治療的相關(guān)指標(biāo)成為臨床研究的熱點(diǎn)[14-15]。HSF1是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)控制熱休克蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，由529個(gè)氨基酸組成[16]。HSF1通常以無(wú)活性單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到溫度驟增、短時(shí)間內(nèi)缺血、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，HSF1會(huì)被激活，轉(zhuǎn)化為三聚體，經(jīng)過(guò)核膜到達(dá)細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生熱休克蛋白，參與細(xì)胞增殖凋亡等生物學(xué)行為[17]。癌癥的發(fā)生發(fā)展與HSF1密切相關(guān)，其可能在細(xì)胞的病變過(guò)程中被激活。相關(guān)研究表明，子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、胃癌組織中HSF1呈現(xiàn)顯著的高表達(dá)[18]。研究中指出，M2型巨噬細(xì)胞參與癌細(xì)胞的血管生成、免疫抑制等，并且與癌細(xì)胞的增殖凋亡等密切相關(guān)，而甘露糖受體就為其細(xì)胞表面高表達(dá)CD206分子[19]。甘露糖受體與病原體的識(shí)別、吞噬、清除相關(guān)，sMR則由內(nèi)源性細(xì)胞金屬蛋白酶對(duì)膜結(jié)合形式的MR水解切割釋放[20]。研究表明，肝炎患者血清sMR水平異常表達(dá)[21]。研究表明，miR-758-3p可通過(guò)靶向抑制MDM2和mTOR的表達(dá)降低肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，是肝癌治療的潛在分子靶點(diǎn)[22]。所以本研究旨在探討肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平變化并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為肝癌患者的臨床診斷與治療提供新思路。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組HSF1表達(dá)情況，結(jié)果顯示，肝癌患者HSF1陽(yáng)性表達(dá)顯著高與對(duì)照組，這與肖億等[22]在關(guān)于HSF1與肝癌組織中表達(dá)的研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這提示HSF1表達(dá)情況與肝癌的發(fā)生有著一定的聯(lián)系，這可能與HSF1與凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白和激酶互相作用一致腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[23-24]。本研究采用ELISA對(duì)兩組血清sMR水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合研究結(jié)果與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果可證實(shí)，肝癌患者血清中sMR的水平較慢性肝炎患者明顯升高，提示在肝癌患者中sMR高表達(dá)，這可能是sMR在多種癌癥中高表達(dá)，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)[25]。本研究又采用RT-qPCR檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)兩組患者的miR-758-3p水平，分析結(jié)果與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組研究對(duì)象體內(nèi)miR-758-3p水平較對(duì)照組研究對(duì)象顯著下降。

在本研究的最后分析了肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p三個(gè)指標(biāo)與性別、年齡、BMI等臨床病理特征之間的聯(lián)系，結(jié)果表明，HSF1、sMR、miR-758-3p表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、微血管侵犯、病理分期、AFP相關(guān)，其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、微血管侵犯、病理分期屬于Ⅲ期、AFP≥400 μg/L的患者HSF1陽(yáng)性例數(shù)比例相對(duì)較多、血清sMR表達(dá)水平相對(duì)較高、miR-758-3p水平相對(duì)較低。臨床病理特征中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、微血管侵犯、病理分期、AFP等指標(biāo)的情況可分析患者的病情進(jìn)展，而通過(guò)結(jié)果可知，隨著肝癌患者的病情進(jìn)展，肝癌患者HSF1陽(yáng)性表達(dá)增加，血清sMR表達(dá)水平增加，miR-758-3p表達(dá)水平降低，這對(duì)于疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究ROC分析結(jié)果顯示，HSF1、sMR、miR-758-3p聯(lián)合診斷肝癌的效能為1.000，高于單獨(dú)HSF1、sMR、miR-758-3p診斷，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平能為肝癌的診斷提供更為可靠的依據(jù)，有助于疾病預(yù)防、診斷和治療。

綜上所述，將HSF1、sMR、miR-758-3p應(yīng)用于肝癌的早期診斷與治療中可發(fā)揮顯著的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)本研究也有部分不足，一方面是納入研究的病例較少且來(lái)源局限，這就需要擴(kuò)大病例來(lái)源，增加病例數(shù)量進(jìn)行深入探索；另一方面，試驗(yàn)中存在不可避免地不可控因素，可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可信度存在影響，還需臨床納入更多病例進(jìn)行試驗(yàn)以提高可信度并且實(shí)驗(yàn)可以納入肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝臟疾病人群與肝癌患者進(jìn)行分析研究，為其應(yīng)用于臨床提供更加全面的理論與實(shí)驗(yàn)支持。