羅志中，馮 凱，羅雅琪

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)，河北 唐山 063000；3.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，河北 承德 067000)

腦梗死是人類死亡的主要原因，由中風(fēng)引起的后遺癥相關(guān)殘疾也是該病危害人類的重要因素[1]。約80%的腦梗死患者是由大腦動脈阻塞引起的缺血性腦梗死，其導(dǎo)致缺血腦部的功能障礙和細(xì)胞死亡[2]。當(dāng)然通過再灌注可恢復(fù)血液拯救缺血組織，但再灌注本身會導(dǎo)致組織損傷，即腦缺血再灌注損傷[3]。近年來，隨著缺血性腦梗死血管內(nèi)治療的進(jìn)展，腦缺血再灌注損傷相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)策略日益嚴(yán)峻。腦缺血再灌注損傷的生理病理過程包括氧化應(yīng)激、炎癥及神經(jīng)元凋亡等[4-5]。甘露醇作為降低顱內(nèi)壓的常用藥物，在臨床應(yīng)用中已得到認(rèn)可。據(jù)報道，甘露醇對腦損傷患者的視神經(jīng)也具有保護(hù)作用[6]。本研究旨在探究甘露醇對缺血再灌注腦損傷大鼠神經(jīng)缺損、炎癥氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡的調(diào)控及潛在機(jī)制。

1 材 料 與 方 法

1.1一般資料

1.1.1實驗動物來源 60只雌性SD大鼠(6～7 周)，(250±30) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。在 23～25 ℃、光照黑夜各半、50%濕度的環(huán)境下飼養(yǎng)。手術(shù)前大鼠禁食12 h。

1.1.2藥物、試劑及儀器 20%甘露醇注射液(國藥準(zhǔn)字H32025228)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbentassy，ELISA)檢測試劑盒、鼠白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA 檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；MAPK信號通路激活劑鹽酸二甲雙胍(S1950)購自美國Selleck公司；TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1模型大鼠的建立 戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，頸部中線切開，剝離頸部總、外、內(nèi)動脈。在近心端的總動脈做切口，塞入尼龍線栓，穿入頸內(nèi)動脈，阻斷大腦動脈供血2 h。拉出栓塞線，恢復(fù)血流，制作腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠僅做分離頸總、外、內(nèi)動脈分離，不做血管栓塞處理。待大鼠麻醉蘇醒后，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。

1.2.2大鼠分組與處理 將60只大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，設(shè)為假手術(shù)組、模型組、甘露醇組、甘露醇+二甲雙胍組。假手術(shù)組、模型組大鼠的處理同方法部分1.2.1。除假手術(shù)組外，其余大鼠均需進(jìn)行造模。甘露醇組：大鼠在造模后，尾靜脈注射15 mL/kg的20%甘露醇，6 h/次，給藥24 h，4次。甘露醇+二甲雙胍組：甘露醇尾靜脈注射給藥的基礎(chǔ)上，給予二甲雙胍腹腔注射250 mg/kg，1次/d。假手術(shù)組、模型組大鼠：尾靜脈注射等量的生理鹽水。24 h后，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損檢測。結(jié)束后，眼眶后靜脈叢采血，3 000 r/min，取血清，-20 ℃保存。

1.2.3指標(biāo)的測定

1.2.3.1大鼠神經(jīng)功能缺損評分 依照Zea-Longa 5分評分標(biāo)準(zhǔn)[7]對大鼠神經(jīng)缺損程度進(jìn)行評分，分值越高缺損越嚴(yán)重。

1.2.3.2腦組織含水量檢測 斷頭法處死大鼠，摘取腦組織，稱重(g)，記錄為腦濕重。110 ℃烘烤48 h，稱重，記錄為腦干重。腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.2.3.3腦組織梗死率測定 斷頭法處死大鼠，快速摘取腦組織，置于預(yù)冷的PBS中，-20 ℃冰箱保存30 min，剔除嗅球、小腦。切成2 mm的切片組織，進(jìn)行1%TTC染色，37 ℃避光5 min。肉眼可見白色梗死區(qū)，再用4%多聚甲醛固定。Image J測量梗死面積、大腦總面積。腦梗死率(%)=梗死面積/總面積×100%。

1.2.3.4海馬組織HE染色 取甲醛固定的海馬組織，制作石蠟切片。操作步驟按照HE染色試劑盒說明書要求操作，染色、固定、封片，200倍顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元變化。

1.2.3.5ELISA實驗檢測血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA 按照鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒、鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒的說明書要求操作，檢測血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA。

1.2.3.6TUNEL檢測腦組織神經(jīng)元凋亡率 按照一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書中的石蠟切片處理腦組織。末端轉(zhuǎn)移酶：生物素-dUTP按照1∶10的比例配置生物素標(biāo)記液。用生物素標(biāo)記液標(biāo)記組織切片，37 ℃避光孵育1 h。洗滌后，進(jìn)行顯色。鏈霉親和素工作液孵育30 min，洗滌，DAB顯色液。洗滌，用蘇木素染色液進(jìn)行核染，洗滌。最后用乙醇脫水，二甲苯透明，封片。400倍顯微鏡下觀察神經(jīng)元的凋亡情況，拍照。陽性的凋亡神經(jīng)元為棕黃色，使用Image J圖像分析軟件計算陽性細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)，取平均值。總凋亡率(%)=腦組織凋亡率-陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3.7WB實驗檢測腦組織p-p38、p-ERK1/2、p38、ERK1/2蛋白表達(dá) RIPA裂解液充分裂解研磨的腦組織，提取總蛋白，并BCA定量，沸水變性。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒展開蛋白電泳。配置10%的分離膠，8.2%的濃縮膠，灌膠。用變性蛋白上清上樣，45 V電泳2.5～3 h，蛋白條帶至濃縮膠下緣，調(diào)整電壓至120 V電泳1～2 h至條帶跑到分離膠下緣1 cm處。0 ℃預(yù)冷轉(zhuǎn)膜儀，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，期間維持系統(tǒng)在0 ℃。結(jié)束后，將膜用封閉液37 ℃封閉處理2 h。用電泳液漂去浮沫，浸入一抗溶液，4 ℃孵育過夜。漂洗后，轉(zhuǎn)入二抗溶液，37 ℃孵育1.5 h。漂洗，電化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影，曝光。Image J軟件分析條帶的灰度，用蛋白條帶的相對灰度值表示蛋白的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗和獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1四組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損顯著升高，腦組織含水量顯著升高，腦梗死率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能缺損及腦梗死情況Table 1 Neurological deficit and cerebral stroke in rats

2.2四組大鼠海馬組織病理變化 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元排列整齊，緊致，結(jié)構(gòu)完整，而模型組神經(jīng)元之間間隙增大，排列疏松、神經(jīng)元變形，核仁殘缺。與模型組相比，甘露醇組大鼠神經(jīng)元有明顯恢復(fù)，核仁染色有明顯恢復(fù)，細(xì)胞間排列明顯緊致。與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組神經(jīng)元的上述病理變化明顯嚴(yán)重。見圖1。

圖1 大鼠海馬組織(HE染色 ×100)

2.3四組大鼠血清炎癥、氧化應(yīng)激因子的變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均顯著升高，SOD顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均顯著降低，SOD顯著升高(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠血清TNF-α、IL-6、MDA均升高，SOD降低(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清炎癥、氧化應(yīng)激因子變化Table 2 Changes of serum inflammatory and oxidative stress factors in rats

圖2 大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡情況

2.4四組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.05)，見圖2。

2.5四組大鼠腦組織MAPK信號通路活性變化 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘露醇組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與甘露醇組相比，甘露醇+二甲雙胍組大鼠腦組織p-p38、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 大鼠腦組織MAPK信號通路活性Table 3 Activity of MAPK signaling pathway in rat brain tissue

圖3 MAPK信號通路關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)

3 討 論

甘露醇在臨床治療中多用于降低顱腦血壓，但是也有學(xué)者認(rèn)為過量使用會加重患者的顱內(nèi)壓及腦損傷[8-9]。Huang等[10]在創(chuàng)傷性腦損傷患者的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，20%甘露醇、10%高滲鹽水可降低創(chuàng)傷性腦損傷的顱內(nèi)壓、升高血清鈉含量，升高血清滲透壓。Patil等[11]報道，20%甘露醇、3%高滲鹽水、10%甘露醇混合10%甘油組、對創(chuàng)傷性腦損傷患者的低血容量、低鈉血癥或腎功能衰竭均有療效，但是，在神經(jīng)功能方面僅20%甘露醇有效。王琴等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，甘露醇聯(lián)合丁苯酞治療能夠降低急性腦梗死患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。因此本研究猜測甘露醇可能對腦損傷引起的神經(jīng)功能障礙具有一定的作用。本研究建立了缺血再灌注腦損傷大鼠模型，模型大鼠的神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均升高，血清TNF-α、IL-6、MDA升高，SOD降低，腦組織神經(jīng)元凋亡率升高，說明缺血再灌注腦損傷大鼠模型制造成功。20%甘露醇治療的大鼠神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率均明顯下降，炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)也受到抑制，神經(jīng)元凋亡情況得到改善，這些實驗說明甘露醇對缺血再灌注腦損傷的具有保護(hù)作用。

近兩年，國內(nèi)外很多研究均報道，MAPK信號通路的抑制在腦損傷后大腦的抗炎、抗氧化應(yīng)激及自我修改中發(fā)揮積極的有益功能[13-14]。王明程等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷小鼠腦組織內(nèi)MAPK信號通路關(guān)鍵基因p-JNK、p-ERK1/2、p-p38的蛋白表達(dá)上調(diào)，該通路被異常激活；異丙酚處理后的模型小鼠腦組織p-JNK、p-ERK1/2、p-p38的表達(dá)受到抑制，小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力得到恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路基因p-p38、p-ERK1/2在缺血再灌注腦損傷大鼠腦組織中表達(dá)升高，這與該通路在腦部損傷相關(guān)疾病中異常激活的實驗結(jié)果相吻合。甘露醇治療后，大鼠腦組織中p-p38、p-ERK1/2的表達(dá)明顯受到抑制，而二甲雙胍能夠明顯減弱甘露醇對p-p38、p-ERK1/2的抑制作用，上調(diào)MAPK信號通路的活性。此研究結(jié)果說明甘露醇可抑制缺血再灌注大鼠腦組織MAPK信號通路的活性，二甲雙胍作為MAPK信號通路激活劑可再次激活缺血再灌注大鼠MAPK信號通路。重要的是，二甲雙胍再次激活MAPK信號通路后，甘露醇治療的模型大鼠神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、腦梗死率又明顯加重，炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)也升高，神經(jīng)元凋亡再次升高，這說明了MAPK信號通路在甘露醇保護(hù)缺血再灌注大鼠腦損傷中的重要性。

綜上所述，甘露醇可減輕缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)功能缺損、腦組織的水腫、梗死及炎癥氧化應(yīng)激和神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)腦損傷，這種作用與抑制MAPK信號通路有關(guān)，為腦血管損傷疾病的臨床治療提供參考。