李璐，王凡，姚小艷，劉珍，

1 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院檢驗(yàn)科，上海 200092；2 上海市浦東醫(yī)院/復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科

非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）是呼吸系統(tǒng)最常見的腫瘤，近年來(lái)由于早期手術(shù)、靶向藥物及免疫療法等綜合療法的應(yīng)用，患者預(yù)后有一定改善，但其在惡性腫瘤中的死亡率仍居第一位［1］。腫瘤細(xì)胞早期侵襲和轉(zhuǎn)移是影響NSCLC預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此探索NSCLC 發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。同源性磷酸酶張力蛋白（Phosphatase and Tensinhomology，PTEN）作為抑癌基因，其在多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，且與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］?；|(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix MetalloProteinase-2，MMP-2）可依賴鋅離子降解基底膜及結(jié)締組織等細(xì)胞外間質(zhì)，為腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移打開缺口［3］。研究［4］報(bào)道，MMP-2在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，且與臨床分期、病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。TIAN等［5］在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTEN 可抑制MMP-2 的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們認(rèn)為有必要開展PTEN 與MMP-2 在NSCLC 淋巴結(jié)侵襲中的作用與分子機(jī)制的研究。2021 年3 月1 日—2022 年3 月5 日，本研究觀察了PTEN、MMP-2 在淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 細(xì)胞株H1299 中的表達(dá)變化，并探討其分子調(diào)控機(jī)制，為研究NSCLC 發(fā)生淋巴結(jié)侵襲提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NSCLC 細(xì)胞株、試劑及儀器 淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 細(xì)胞株H1299、淋巴結(jié)非侵襲性NSCLC 細(xì)胞株A549 及人胚腎細(xì)胞293T 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640 及DNEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Ⅰ試劑盒均購(gòu)自日本Ta-KaRa 公司；MMP-2、Akt、p-Akt、PTEN 抗體購(gòu)于美國(guó)CST 公司，GAPDH 抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自上海愛必信（上海）生物科技有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液（中）、Dual-LumiTM雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、PMSF 及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；PTEN、MMP-2 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司，質(zhì)粒psin-PTEN（過(guò)表達(dá)PTEN）、質(zhì)粒psin-vector（空載對(duì)照）、包裝質(zhì)粒psPAX2 及pMD2. G、pGL4.27［1uc2P/NFκb-RE/Hygro］質(zhì)粒（pGL4.27-NF-κb）購(gòu)于美國(guó)Addgene 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，生物安全柜購(gòu)自海爾公司，垂直電泳儀/轉(zhuǎn)印儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，F(xiàn)usion FX7 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)Vilber-Lourmat公司，微量移液器購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Light Cycler480 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）系統(tǒng)購(gòu)自瑞士羅氏公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，美國(guó)普通顯微鏡、熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，ND2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 H1299 細(xì) 胞 和A549 細(xì) 胞 中PTEN、MMP-2 mRNA及蛋白檢測(cè)

1.2.1 H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中PTEN、MMP-2 mRNA 檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。取H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，采用PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒及特異性引物，按照說(shuō)明書要求在冰上于八連管中配制10μL 體系反應(yīng)混合液，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）5 μL、PCR 前 后 引 物（終 濃 度 為0.4μmol/L）各0.4μL、去RNA 酶的雙蒸水3.2μL、cDNA 模板（＜100 ng）1 μL。PTEN 正向引物序列為5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′，反向引物序 列 為5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′；MMP-2 正 向 引 物 序 列 為 5′-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3′，反 向 引 物 序 列 為 5′-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3′；β-actin 正向引物 序 列 為5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，反 向 引 物 序 列 為5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。設(shè)置Light Cycler480 System兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，反應(yīng)結(jié)束后拷貝溶解曲線、擴(kuò) 增 曲 線 及Ct 值，以2-ΔΔCt表 示 細(xì) 胞 中 目 的 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中PTEN、MMP-2 蛋白檢測(cè) 采用Western Blotting 法。取H1299細(xì)胞和A549 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，1×PBS 洗細(xì)胞兩次，冰上操作，加入PIPA 細(xì)胞裂解液（加入PMSF）充分裂解，采用BCA 法對(duì)蛋白定量，分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?。取等量蛋白樣品?0μg）進(jìn)行100 ℃加熱5 min，于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳（恒壓80 V、20 min，120 V、90 min），結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至0.4μm硝酸纖維素膜上（100 V，90 min）；5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 漂洗3 次后，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，TBST 漂洗3 次后，室溫孵育二抗2 h，其中抗體用含5% BSA 的TBST 溶液配制，體積比為1：1 000，TBST漂洗3 次后配制化學(xué)發(fā)光液，等量A 液和B 液在EP管中混勻，避光，將顯影液均勻滴加在膜上，在化學(xué)發(fā)光儀上選擇自動(dòng)曝光或手動(dòng)曝光顯影，保存圖像結(jié)果為JEPG 格式。以GAPDH 作為內(nèi)參，通過(guò)Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 采用慢病毒介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。取過(guò)表達(dá)PTEN 的質(zhì)粒psin-PTEN、空載對(duì)照質(zhì)粒psin-vector 及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G，擴(kuò)增抽提后接種293T細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書要求，將質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、Lipo3000 及Opti-MEN 按照特定比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后收集病毒上清過(guò)濾后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。取H1299 細(xì)胞，按每孔4×105個(gè)接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入3 mL病毒上清、1 mL完全培養(yǎng)基、4μL Polybrene（終濃度5 ng/mL），混勻后置培養(yǎng)箱中，孵育12 h 后更換新鮮完全培養(yǎng)基4 mL 繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用熒光顯微鏡及Western blotting 法驗(yàn)證其過(guò)表達(dá)效果，建立過(guò)表達(dá)PTEN 的H1299 細(xì)胞，記為PTEN 過(guò)表達(dá)組，以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的H1299細(xì)胞為對(duì)照，記為對(duì)照組。

1.4 兩組細(xì)胞中PTEN 蛋白、MMP-2 mRNA 及蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白檢測(cè) 兩組細(xì)胞中MMP-2 mRNA 檢測(cè)方法同“1.2.1”。兩組細(xì)胞中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白檢測(cè)方法同“1.2.2”。

1.5 兩組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κb 檢測(cè) 采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。取兩組細(xì)胞懸液接種至96孔 板 中，繼 續(xù) 培 養(yǎng)24 h，將pGL4.27-NF-κb 質(zhì)粒、Lipo3000 及Opti-MEN 按照特定比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4 h 后換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求配制檢測(cè)工作液，與96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻后室溫孵育10 min，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度，以熒光素酶的熒光強(qiáng)度表示轉(zhuǎn)錄因子NF-κb活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0 軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較用t檢驗(yàn)；P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H1299 細(xì) 胞 和A549 細(xì) 胞 中PTEN、MMP-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.1.1 H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 H1299 細(xì)胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為0.69 ± 0.10、5.88±0.79，A549細(xì)胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.01、1.00±0.02，兩者相比，P均＜0.01。

2.1.2 H1299 細(xì)胞和A549 細(xì)胞中PTEN、MMP-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 H1299細(xì)胞中PTEN、MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.62 ± 0.03、1.23 ± 0.09，A549細(xì)胞細(xì)胞中PTEN、MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.81±0.16、0.67±0.05，兩者相比，P均＜0.01。

2.2 兩組細(xì)胞中PTEN 蛋白、MMP-2 mRNA 及蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 PTEN 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.14 ± 0.31、0.54 ±0.04、2.04 ± 0.21、0.21 ± 0.01，對(duì) 照 組 細(xì) 胞 中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、AKT 蛋白、p-Akt 蛋白相對(duì)表 達(dá) 量 分 別 為0.60 ± 0.01、0.81 ± 0.02、1.99 ±0.12、0.74 ± 0.03，與對(duì)照組相比，PTEN 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.01），MMP-2 蛋白及p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P均＜0.01）。PTEN 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中MMP-2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.63 ± 0.01，對(duì)照組細(xì)胞中MMP-2的mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1.00 ± 0.01，兩組相比，P＜0.01。

2.3 兩組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κb 活性比較 PTEN過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中NF-κb 活性為0.05 ± 0.01，對(duì)照組細(xì)胞中NF-κb 活性為1.00 ± 0.02，兩組相比，P＜0.01。

3 討論

淋巴結(jié)侵襲是NSCLC 最常見的轉(zhuǎn)移途徑，既往研究［6］發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)侵襲的NSCLC 患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)淋巴結(jié)侵襲患者的兩倍，淋巴結(jié)侵襲的NSCLC患者5年生存率及總生存率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)侵襲患者。由此可見，深入研究影響NSCLC 細(xì)胞發(fā)生侵襲的因素對(duì)改善NSCLC 預(yù)后及提高患者生存率有十分重要的意義。

PTEN 是第一個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，在結(jié)直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，PTEN 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7-8］。MMP-2 是分布最廣的基質(zhì)金屬蛋白酶之一，可降解細(xì)胞外基質(zhì)獲得向周邊組織侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)常伴有MMP-2的表達(dá)增強(qiáng)。多項(xiàng)研究［9-11］結(jié)果顯示，MMP-2與腫瘤的新血管形成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。基于既往研究，我們探索NSCLC 中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)PTEN 對(duì)MMP-2 表達(dá)的調(diào)控。我們?cè)诩?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 細(xì)胞株H1299 與淋巴結(jié)非侵襲性細(xì)胞株A549 相比較，PTENmRNA 及蛋白呈低表達(dá)，而MMP-2 呈高表達(dá)；而當(dāng)H1299 細(xì)胞中PTEN 被過(guò)表達(dá)時(shí)，MMP-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)則降低，這些結(jié)果均表明NSCLC 中PTEN 可負(fù)向調(diào)控MMP-2。

PI3K/PTEN/AKT 信號(hào)通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）作為一種磷脂酰肌醇激酶，可特異性磷酸化細(xì)胞膜的磷脂酰肌醇成分，生成磷脂酰肌醇2磷酸［phosphatidylinositol（4，5）bisphosphate，PIP2］和磷脂酰肌醇3 磷酸［phosphatidylinositol（3，4，5）bisphosphate，PIP3］，PTEN 蛋白通過(guò)使PIP3 去磷酸化形成PIP2 失去信使功能阻斷PI3K 對(duì)AKT 的活化進(jìn)程，從而下調(diào)通路活性，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［12］。陳翔等［13］發(fā)現(xiàn)，PTEN 可以通過(guò)抑制AKT調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移。我們通過(guò)Western Blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PTEN 高表達(dá)的H1299 細(xì)胞中p-Akt 及MMP-2 的表達(dá)降低。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)研究一致，提示淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 細(xì)胞中Akt 信號(hào)通路活化參與PTEN蛋白負(fù)調(diào)控MMP-2的表達(dá)。

NF-κb 是一種廣泛存在的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，PI3K/AKT/NF-κb 信號(hào)通路不僅可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，其異?；罨€與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中NF-κb 活性明顯增強(qiáng)［14］。在典型的NF-κb 活化途徑中，細(xì)胞受外界信號(hào)或致癌因素刺激時(shí)，特定位點(diǎn)上的絲氨酸殘基被磷酸化，隨后釋放出大量NF-κb，NF-κb 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核與特定序列DNA 結(jié)合并啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，活化的NF-κb 可有效介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲隨之增加［15］。我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)侵襲性NSCLC 細(xì)胞H1299中PTEN 被過(guò)表達(dá)時(shí)NF-κb 的活性，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)侵襲性NSCLC細(xì)胞中PTEN可以抑制NF-κb的活性。

本研究尚存在一定的不足。首先，PTEN 負(fù)調(diào)控MMP-2 后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)仍需進(jìn)一步求證；其次，當(dāng)NSCLC 發(fā)生淋巴結(jié)侵襲時(shí)PTEN 所受的表達(dá)調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。因此，我們將來(lái)會(huì)進(jìn)一步探索淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 中PTEN 上游的調(diào)控機(jī)制及其負(fù)調(diào)控MMP-2后的效應(yīng)。

綜上所述，淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 細(xì)胞株H1299中PTEN 表達(dá)降低、MMP-2 表達(dá)升高，過(guò)表達(dá)PTEN可能是通過(guò)Akt/NF-κb 信號(hào)通路抑制MMP-2 的表達(dá)，這為進(jìn)一步深入研究淋巴結(jié)侵襲性NSCLC 的分子靶標(biāo)及效應(yīng)提供了一定的理論依據(jù)。