王靜文， 張 磊， 蘇儉生

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)教研室，上海 200072）

鈦種植體作為臨床上應(yīng)用最廣泛的材料之一，一直以來都是種植修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。為此，研究人員對(duì)鈦種植體表面改性進(jìn)行了大量研究，以期待保留鈦種植體原有特性的同時(shí)賦予其新功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)早期成骨[2-3]。目前已證實(shí)，鈦表面納米形貌能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和分化[4]。課題組前期通過水熱法成功構(gòu)建載鈣微納結(jié)構(gòu)并驗(yàn)證其對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用[5]。

種植體在植入體內(nèi)后，來自血液和體液中的各種蛋白分子等吸附在其表面，不可避免地會(huì)引起免疫反應(yīng)，其中巨噬細(xì)胞作為主要免疫細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。但巨噬細(xì)胞本身性質(zhì)并不穩(wěn)定，在不同因子的刺激下會(huì)產(chǎn)生不同極化方向，從而影響炎癥因子的表達(dá)。有研究表明，鈦表面不同形貌能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化方向[6]。

因此，本實(shí)驗(yàn)使用水熱法構(gòu)建鈦表面納米形貌，旨在探究其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，及對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 α-MEM培養(yǎng)液、DEME高糖培養(yǎng)液和青霉素-鏈霉素（雙抗）（Hyclone公司，美國(guó)）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco公司，美國(guó)）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline,PBS;Hyclone公司，美國(guó)）；CCK-8試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）；TRIzol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa公司，日本）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免公司，中國(guó)）；掃描電子顯微鏡（SEM；Hitachi公司，日本）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司，瑞士）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料制備及表征 本實(shí)驗(yàn)所用鈦片為機(jī)械加工純鈦片（Φ15 mm×2 mm），丙酮、無水乙醇、去離子水依次用超聲機(jī)清洗后烘干待用。將清洗后的純鈦片記為對(duì)照組（control-Ti組）；將純鈦片放在聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，加入25 mL 0.5 mol/L的NaOH水溶液，180℃下反應(yīng)12 h，取出鈦片后行超聲振蕩清洗，去離子水沖洗、烘干，即可得到表面改性的鈦片，作為納米組（nm-Ti組）。

使用SEM觀察各組鈦片表面結(jié)構(gòu)，使用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量各組鈦片表面的水接觸角，比較不同組鈦片的親水性差異。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選取2～3周齡的雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死后分離其股骨和脛骨，并將其浸泡在含10%雙抗的PBS中，轉(zhuǎn)入無菌操作臺(tái)。用鑷子小心夾持股骨，無菌器械剪剪去兩端骨骺，用1 mL無菌注射器吸取適量培養(yǎng)液（含10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液），將骨髓沖入10 cm培養(yǎng)皿中，用同樣的方法將同一側(cè)脛骨內(nèi)骨髓沖入同一培養(yǎng)皿中，各皿共加入8 mL培養(yǎng)液，將骨髓吹散均勻，放入恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）中培養(yǎng)，每3 d換液，待BMSCs匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用含2.5%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取第2代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，培養(yǎng)液吹打消化后待用。

1.2.3 細(xì)胞黏附 當(dāng)BMSCs匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用含2.5%EDTA的胰酶消化，以1×104個(gè)/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面。培養(yǎng)24 h后，用PBS輕柔沖洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，Triton X-100破膜5 min，使用PBS再次浸泡沖洗3次，以200μL/孔將配制好的鬼筆環(huán)肽加入各組鈦片，室溫避光孵育90 min。PBS浸泡沖洗3次后，以200μL/孔加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染5 min，最后用PBS清洗3次后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞增殖 當(dāng)BMSCs匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用含2.5%EDTA的胰酶消化，以1×104個(gè)/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面，每3 d換液。分別于接種后第1、4、7天棄去孔板中的原培養(yǎng)液，使用CCK-8試劑盒，將CCK-8原液與培養(yǎng)液以1∶10的比例配制成CCK-8工作液，以550μL/孔加入各孔板內(nèi)，37℃避光孵育3 h。使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)試其吸光度值，比較各組鈦片表面細(xì)胞增殖情況。各組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以消除實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)各組鈦片表面BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá) 當(dāng)BMSCs匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用含2.5%EDTA的胰酶消化，以2×104個(gè)/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面，每3 d換液。分別于接種后第3、7天時(shí)棄去原培養(yǎng)液，得到3 d和7 d的BMSCs樣本，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.6 ELISA檢測(cè)各組鈦片表面RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá) 當(dāng)RAW264.7巨噬細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，向培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液沖洗消化，以5×104個(gè)/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面。并分別于接種后24、48 h時(shí)收集各孔上清液，1 000×g離心20 min后取上清液。根據(jù)試劑盒說明設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加入待測(cè)上清液50μL，然后將其密封于室溫下孵育30 min，棄去液體，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，室溫下孵育30 min，然后再次棄去液體，洗板5次，加入顯色液A、B，室溫下顯色10 min，加入終止液，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算各組樣品濃度。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)各組鈦片表面RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá) 當(dāng)RAW264.7巨噬細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，向培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液沖洗消化，以5×104個(gè)/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面。其中一組在培養(yǎng)24 h后，用白細(xì)胞介素-4（IL-4，10 ng/mL）誘導(dǎo)24 h后收樣，作為IL-4/48 h組。并分別于接種后24、48 h時(shí)棄去原培養(yǎng)液，得到正常培養(yǎng)24 h組和48 h組樣本。與1.2.5中的方法一致，通過RT-qPCR測(cè)量RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.8 RAW264.7巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSCs后檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá) 細(xì)胞分組及處理方法同1.2.5和1.2.7，在培養(yǎng)48 h后將48 h組和IL-4/48 h組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，饑餓刺激24 h后，收集各組細(xì)胞上清液，以1 200 r/min離心后吸取上清液。將收集的上清液與完全培養(yǎng)液（含10%FBS和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液）以1∶2的比例制備成條件培養(yǎng)液。對(duì)2組正常培養(yǎng)4 d的BMSCs進(jìn)行條件培養(yǎng)，并在第7天時(shí)收樣，得到正常7 d組（normal組）和條件培養(yǎng)組（+CM組和+IL-4/CM組）。通過RT-qPCR檢測(cè)條件培養(yǎng)后各組鈦片表面BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表征

2.1.1 SEM觀察 各組鈦片表面形貌圖像如圖1所示，對(duì)照組（control-Ti組）表面平坦，無特殊結(jié)構(gòu)；納米組（nm-Ti組）表面為成簇的片狀結(jié)構(gòu)。

圖1 各組鈦片表面SEM圖像Figure 1 SEM images of the surface of different titanium disc samples

2.1.2 水接觸角測(cè)量 各組鈦片表面水接觸角測(cè)量結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組鈦片表面的水接觸角約為87.93°；而納米組鈦片表面的水接觸角約為26.49°，接觸水滴后迅速濕潤(rùn)鋪展，親水性顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖2 各組鈦片表面水接觸角Figure 2 Water contact angles of different titanium disc samples

2.2 細(xì)胞黏附

BMSCs在各組鈦片表面細(xì)胞黏附形態(tài)如圖3所示，24 h時(shí)對(duì)照組和納米組鈦片表面細(xì)胞均得到伸展，且納米組表面細(xì)胞可見明顯的細(xì)長(zhǎng)突觸。

圖3 BMSCs在各組鈦片表面黏附形態(tài)（×400）Figure 3 BMSCs adhesion on the surface of different titanium disc samples(×400)

2.3 細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖結(jié)果如圖4所示，隨時(shí)間增加，BMSCs在各組鈦片表面細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加，且納米組表面細(xì)胞增殖更為活躍，第7天時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖4 BMSCs在各組鈦片表面的增殖情況Figure 4 BMSCs proliferation on the surface of different titanium disc samples

2.4 各組鈦片表面BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)

BMSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果如圖5所示，納米組BMP-2和ALP的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，以第3天時(shí)BMP-2和ALP表達(dá)最高（P＜0.05）。

圖5 成骨相關(guān)基因的表達(dá)Figure 5 Expression of osteogenesis related genes

2.5 各組鈦片表面RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)

ELISA檢測(cè)各組鈦片表面RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌水平，結(jié)果如圖6所示，隨著時(shí)間遞增，對(duì)照組和納米組分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）的水平均有所升高。培養(yǎng)48 h時(shí)，納米組IL-10的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖6 巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的分泌水平Figure 6 Secretion level of macrophage related inflammatory factors

2.6 各組鈦片表面RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)

RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果如圖7所示，各組極化相關(guān)基因表達(dá)均隨著時(shí)間遞增而不斷增多。與正常培養(yǎng)48 h相比，IL-4刺激培養(yǎng)后，對(duì)照組Arg-1和iNOS的表達(dá)均增多，而納米組Arg-1的表達(dá)增多，iNOS的表達(dá)則有所降低，且納米組與對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖7 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)Figure 7 Expression of macrophage polarization related genes

2.7 RAW264.7巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)BMSCs后成骨相關(guān)基因的表達(dá)

BMSCs成骨相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，與正常培養(yǎng)7 d的BMSCs相比，條件培養(yǎng)后，納米組和對(duì)照組BMSCs的BMP-2和ALP表達(dá)量降低；而在加了IL-4刺激巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSCs后，納米組和對(duì)照組BMSCs的BMP-2和ALP的表達(dá)較之前均有所增加，以對(duì)照組BMP-2的增加最為顯著（P＜0.01）。

圖8 成骨相關(guān)基因的表達(dá)Figure 8 Expression of osteogenesis related genes

3 討論

研究證實(shí)，粗糙的鈦表面更有利于細(xì)胞的黏附和增殖。且相比于傳統(tǒng)噴砂酸蝕處理后獲得的粗糙表面，近些年來，學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)鈦表面納米級(jí)粗糙表面不僅有利于細(xì)胞黏附，還具有促進(jìn)成骨的作用[7-8]。然而，一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目前針對(duì)種植體的表面改性，在體內(nèi)成骨方面常常達(dá)不到預(yù)期效果[3]。不少學(xué)者便重新將目光轉(zhuǎn)投到種植體植入體內(nèi)后引起的生物反應(yīng)[9]。種植體植入體內(nèi)后，巨噬細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞參與炎癥調(diào)節(jié)和組織修復(fù)過程。目前，巨噬細(xì)胞的不同極化表型對(duì)骨再生的作用機(jī)制尚未有明確定論，但M2型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)炎癥由損傷轉(zhuǎn)向修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)骨組織再生的結(jié)論得到普遍認(rèn)可[10]。因此，如何改變種植體表面特性，使其具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而促進(jìn)骨組織再生的能力得到越來越多的關(guān)注。

鈦表面形貌不僅對(duì)成骨細(xì)胞有作用，對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)行為也有一定的影響，有學(xué)者通過陽極氧化法制備出不同管徑的二氧化鈦納米管，證明其不僅對(duì)成骨細(xì)胞有促進(jìn)作用，不同管徑的納米管也會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生不同方向的極化，其中30 nm和80 nm納米管分別促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2和M1方向極化，并且從破骨細(xì)胞激活途徑對(duì)此進(jìn)行解釋討論[11-13]。課題組前期通過水熱法同樣成功制備出鈦表面納米結(jié)構(gòu)，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明這種納米結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化等生物學(xué)活性均有顯著的促進(jìn)作用[5]，但其僅局限在某一個(gè)方面的研究，對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及其與成骨細(xì)胞間的相互作用缺乏進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)便在此基礎(chǔ)上，以小鼠來源的RAW264.7巨噬細(xì)胞系和大鼠BMSCs為研究對(duì)象，探究鈦表面納米形貌調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)骨再生修復(fù)的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用水熱法制備出鈦表面納米結(jié)構(gòu)，通過測(cè)量水接觸角和觀察細(xì)胞黏附形態(tài)，證明這種納米結(jié)構(gòu)具有良好的親水性，有利于細(xì)胞的黏附伸展。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，納米組成骨相關(guān)基因BMP-2和ALP表達(dá)顯著增加，表明該納米形貌有利于BMSCs的成骨分化。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨時(shí)間遞增，與對(duì)照組相比，納米組鈦片在48 h時(shí)分泌抗炎因子IL-10顯著增多，而促炎因子TNF-α沒有顯著變化，提示早期納米鈦表面可能以M2方向極化為主。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨時(shí)間遞增，各組材料表面巨噬細(xì)胞Arg-1和iNOS表達(dá)也不斷增多，與對(duì)照組相比，納米組以Arg-1表達(dá)為主，與ELISA結(jié)果趨勢(shì)一致。但在IL-4刺激巨噬細(xì)胞向M2方向極化后，對(duì)照組Arg-1和iNOS表達(dá)水平均明顯增加，又以Arg-1顯著增高為主，這可能與巨噬細(xì)胞極化處于動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，在IL-4的刺激下，巨噬細(xì)胞M1和M2極化都很活躍。而納米組Arg-1表達(dá)顯著增多，iNOS表達(dá)降低，但其變化趨勢(shì)明顯不如對(duì)照組顯著，提示鈦表面納米形貌對(duì)巨噬細(xì)胞極化可能存在一定的調(diào)控機(jī)制。在對(duì)BMSCs的條件培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，加入巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液后，BMSCs的成骨基因BMP-2和ALP表達(dá)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而BMSCs在IL-4刺激后的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后，成骨相關(guān)基因的表達(dá)量又有所提升，說明巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)BMSCs成骨分化具有一定的作用。根據(jù)IL-4刺激后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，納米表面以M2方向極化為主，其條件培養(yǎng)BMSCs后應(yīng)促進(jìn)其成骨分化，而實(shí)際結(jié)果是成骨相關(guān)基因的表達(dá)減少。但在IL-4直接刺激，巨噬細(xì)胞向M2方向極化后，RT-qPCR的結(jié)果表明其成骨相關(guān)基因BMP-2和ALP表達(dá)均明顯增多，與其他相關(guān)的研究結(jié)果一致，說明鈦表面納米形貌介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化對(duì)BMSCs的調(diào)控可能存在更為復(fù)雜的過程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了鈦表面納米形貌，并驗(yàn)證了其對(duì)BMSCs的黏附、增殖和成骨分化均有促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示早期鈦表面納米形貌以促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化為主，且由納米表面介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化會(huì)進(jìn)一步影響B(tài)MSCs的成骨分化。但其具體的作用方向及作用機(jī)制仍需深入研究，下一步將深入檢測(cè)相關(guān)炎癥因子分泌和基因表達(dá)情況，從而通過干預(yù)巨噬細(xì)胞的極化方向，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞行為，以達(dá)到促進(jìn)早期骨整合的目的。