黃梓校， 崔子威， 郭 茹， 周紅麗， 王 濤， 何祥一

（蘭州大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，甘肅 蘭州 730000）

口腔癌位列人類十大常見腫瘤之一，在所有腫瘤的發(fā)病率中占3.8%[1]。世界范圍內(nèi)，每年大約有30～70萬人被診斷為口腔癌，其5年生存率只有約50%[2-4]?？谇话┈F(xiàn)階段主要的治療手段仍然是手術(shù)結(jié)合放化療，而腫瘤組織對(duì)放化療的耐受性極大地影響了患者的治療效果及預(yù)后。研究表明，腫瘤組織對(duì)放化療的耐受性主要源于以下幾點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞的藥物外排、藥物滅活、DNA修復(fù)、抗凋亡因子過表達(dá)[5-7]。凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）是一類具有抑制凋亡作用的蛋白家族，由XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、ILP2、Survivin及Livin組成。Livin是IAPs中最新被發(fā)現(xiàn)的抗凋亡因子，正常情況下，Livin在未分化的組織中呈高表達(dá)，而在成年人的終末分化組織中則很少表達(dá)。多篇文獻(xiàn)表明，Livin在諸多腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如惡性黑色素瘤、腎癌、口腔癌、肺癌等[8-17]，高表達(dá)的Livin也參與了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受[18-20]。對(duì)于降低Livin的表達(dá)是否能增加口腔癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性則少有研究。本研究旨在探索降低Livin的表達(dá)是否會(huì)增加口腔癌細(xì)胞Cal27對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性，并探索其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔黏膜上皮細(xì)胞（human oral mucosal epithelial cells,hOMECs）復(fù)蘇并培養(yǎng)于人表皮角質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液（EpiGROTMHuman Epidermal Keratinocyte Complete Media Kit;Merck Millipore公司，德國(guó)）；牙周膜細(xì)胞 （periodontal ligament cells,PDLCs）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的α-MEM（Gibco公司，美國(guó)）培養(yǎng)液中；hOMECs、PDLCs的獲取和分離如前期研究所述[21-23]；Cal27細(xì)胞、293T細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至約80%時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，用含乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）的胰酶消化數(shù)分鐘，用FBS中止消化，以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min，完全培養(yǎng)液重懸后按1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

針對(duì)Livin基因的shRNA正、反向引物設(shè)計(jì)如表1。pLKO.1載體質(zhì)粒（#24150；Addgene公司，美國(guó)）用AgeI酶（#R0552S；New England Biolabs公司，美國(guó)）、EcoRI酶（#R0101S；New England Biolabs公司，美國(guó)）37℃酶切2 h。正、反向引物經(jīng)退火反應(yīng)后，與酶切后的pLKO.1質(zhì)粒用T4連接酶（#M0202S；New England Biolabs公司，美國(guó)）連接，4℃反應(yīng)過夜。取5μL連接產(chǎn)物加入50μL感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將其涂布于含氨芐西林的LB固態(tài)培養(yǎng)液上，挑選陽(yáng)性亞克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pLV-shLivin，備用。

1.3 慢病毒顆粒的制備

將重組質(zhì)粒pLV-shLivin和空載體質(zhì)粒pLKO.1分別按照轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent（QIAGEN公司，德國(guó)）說明與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、包膜質(zhì)粒psPAX2混合，室溫下孵育15 min，分別加入?yún)R集度為80%的293T細(xì)胞。48 h后收集病毒，以1 250 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液并保存于4℃。

1.4 慢病毒感染Cal27細(xì)胞及篩選

將Cal27細(xì)胞接種于3個(gè)T25培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞匯合至約70%時(shí)換液，分別加入1 mL培養(yǎng)液、pLVshLivin病毒和空載體病毒，作為空白組、實(shí)驗(yàn)組（pLV-shLivin組）和對(duì)照組（pLKO.1組），細(xì)胞培養(yǎng)過夜并換液，24 h后加入10μL潮霉素進(jìn)行篩選。空白組細(xì)胞死亡后，將實(shí)驗(yàn)組篩選出的細(xì)胞集落接種于12孔板，陽(yáng)性克隆擴(kuò)增用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)Livin的表達(dá)

提取口腔癌組織、hOMECs、PDLCs、實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞、對(duì)照組Cal27細(xì)胞的總RNA（Qiagen公司，德國(guó)），用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Rochel公司，美國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA?；蛞镌O(shè)計(jì)如表1。按照Thermo Scientific DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參，基因相對(duì)定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 shRNA引物、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物Table 1 shRNA primers and real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)primers

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平

提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Cal27細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，于含5%脫脂乳的TBST溶液封閉4 h，加入一抗Livin、Caspase 3和β-tublin（1∶1 000稀釋；Proteintech公司，美國(guó)），4℃下過夜；TBST洗滌3次，加入二抗（1∶5 000稀釋；Proteintech公司，美國(guó)）孵育1 h，TBST洗滌3次，使用Bio-Rad系統(tǒng)（Hercules California公司，美國(guó)）進(jìn)行掃描分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率

將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的Cal27細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，每孔分別加入0、20、40、60μmmol/L濃度的5-FU，處理24 h后收集細(xì)胞，1 000×g離心5 min，取5～10×104個(gè)重懸的細(xì)胞，以1 000×g離心5 min，棄上清液，按照AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）加入195μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液并重懸細(xì)胞。加入5μL AnnexinⅤ-FITC、10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，置室溫孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力

將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Cal 27細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔分別加入0、20、40、60μmmol/L的5-FU，24 h后每孔加入10μL的MTT原液，37℃下孵育4 h。每孔加入100μL的SDS-HCl溶液，37℃下孵育4 h。570 nm下讀取每孔的吸光度值。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞中Livin的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

hOMECs、PDLCs、Cal27的RT-qPCR結(jié)果提示，Livin基因在口腔癌細(xì)胞Cal27中的表達(dá)量明顯高于其他正常的口腔細(xì)胞系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001，圖1A）；而其在hOMECs、PDLCs中，Livin少有表達(dá)，兩者之間Livin的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1A）。

2.2 shRNA慢病毒載體質(zhì)粒的測(cè)序及慢病毒篩選

4個(gè)pLV-shRNA重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果符合設(shè)計(jì)（圖2A），深藍(lán)色背景標(biāo)示了相同的堿基。經(jīng)過96 h潮霉素的篩選，空白組Cal27細(xì)胞幾乎全部死亡，細(xì)胞不再貼壁，細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞因折射光呈亮點(diǎn)（圖2B）；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞也有部分細(xì)胞死亡，但仍有貼壁的Cal27細(xì)胞，視野背景中細(xì)胞形態(tài)正常，邊緣清晰、貼壁的細(xì)胞即為慢病毒成功感染的Cal27細(xì)胞（圖2C、D）。

圖2 慢病毒重組質(zhì)粒的測(cè)序和篩選Figure 2 Sequencing and screening results of recombinant lentivirus plasmid

2.3 shRNA降低Cal27細(xì)胞中Livin的表達(dá)

含shRNA重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的慢病毒分別感染Cal27細(xì)胞后，經(jīng)過潮霉素篩選后獲得亞克隆細(xì)胞群，RT-qPCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Livin基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Livin表達(dá)量下降了約70%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義（P＜0.001，圖1B）。經(jīng)過基因沉默后，Western blotting結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組Livin蛋白水平明顯降低,同時(shí)，Caspase3蛋白的條帶在實(shí)驗(yàn)組中比對(duì)照組更濃（圖3）。

圖1 不同細(xì)胞中Livin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Figure 1 Relative mRNA expression of Livin in different cells

圖3 Western blotting檢測(cè)Livin、Caspase 3蛋白在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Cal27細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 3 The expression levels of Livin and Caspase 3 in control and experimental group by Western blotting analysis

2.4 降低Livin表達(dá)增加了Cal27細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性

在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞中分別加入0、20、40、60μmmol/L的5-FU，24 h后用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞經(jīng)20、40、60μmmol/L 5-FU處理后的細(xì)胞凋亡率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01，圖4），且對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率與5-FU濃度呈正相關(guān)（均P＜0.001，圖5）。以上結(jié)果表明，在相同濃度5-FU的處理下，Livin表達(dá)量的降低能顯著增加Cal27細(xì)胞的凋亡率。同樣，MTT實(shí)驗(yàn)也表明，隨著5-FU濃度增加，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Cal27的細(xì)胞活力均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力降低得更加明顯，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力測(cè)試結(jié)果也低于同濃度的對(duì)照組（P＜0.05，圖6）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度5-FU處理的對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞的凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of Cal27 cells treated with 5-FU in control and experimental group by flow cytometry assay

圖5 Cal27細(xì)胞凋亡率與5-FU濃度的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis between Cal27 apoptosis rate and the concentration of 5-FU

圖6 MTT法檢測(cè)不同濃度5-FU處理的對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Cal27細(xì)胞的活力Figure 6 Cell viability of Cal27 cells treated with 5-FU between control and experimental group through MTT assay

3 討論

口腔癌是一種具有侵襲性的惡性腫瘤，術(shù)后常伴有頜面部組織缺損，影響美觀、咀嚼進(jìn)食，降低了生活質(zhì)量?？谇话┏：冒l(fā)于中年人，平均確診年齡為60歲，其預(yù)后不佳，組織學(xué)分類上大多表現(xiàn)為鱗狀細(xì)胞癌，而這一組織學(xué)特征也是口腔癌對(duì)放化療不敏感的原因之一。

腫瘤組織對(duì)化療的耐受性嚴(yán)重影響了手術(shù)治療的預(yù)后，化療耐受涉及藥物外排、藥物滅活、DNA修復(fù)、抗凋亡因子過表達(dá)等環(huán)節(jié)。而抗IAPs是關(guān)鍵，IAPs家族中，Livin是最近被發(fā)現(xiàn)的一種具有賦予細(xì)胞抵抗凋亡能力的蛋白，其主要表達(dá)于人類的未分化組織，而在成人的終末分化細(xì)胞中，Livin則很少表達(dá)[24-25]。在諸多文獻(xiàn)報(bào)道中，Livin高表達(dá)于各類腫瘤組織中，如膀胱癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸癌等，且與患者預(yù)后相關(guān)[8-9,11-12,26-27]。在細(xì)胞層面，本實(shí)驗(yàn)采集并成功培育了hOMECs和PDLCs，并將其與口腔鱗癌細(xì)胞Cal27進(jìn)行對(duì)比，RT-qPCR證明了Livin基因在Cal27細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于其在hOMECs和PDLCs中。

文獻(xiàn)表明，降低Livin表達(dá)能提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性[28]；降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Livin后，替莫唑胺能引發(fā)更多的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3表達(dá)量也會(huì)隨之上升[29]。本研究針對(duì)Cal27的Livin基因設(shè)計(jì)了shRNA，包裝為慢病毒并感染Cal27細(xì)胞后，Cal27細(xì)胞中Livin基因的表達(dá)降低。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Cal27細(xì)胞中加入不同濃度的5-FU后，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明了實(shí)驗(yàn)組Cal27的凋亡率上升，MTT增殖實(shí)驗(yàn)表明了實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力下降，以上證明了降低Livin的表達(dá)能增加Cal27對(duì)5-FU的敏感性。

Livin蛋白含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域進(jìn)化保守，為IAPs家族中所有成員共有。研究表明，BIR結(jié)構(gòu)域通過其與Caspase酶相互作用產(chǎn)生抗凋亡作用[30-31]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)通過細(xì)胞信號(hào)激活下游Caspase酶，最終引發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白水解，造成細(xì)胞DNA不穩(wěn)定、細(xì)胞代謝異常。Livin能作用于多種Caspase酶，尤其是Caspase 3、Caspase 7、Caspase 9，Livin對(duì)Caspase酶的拮抗作用與細(xì)胞背景相關(guān)，Kasof等[24]在Hela細(xì)胞中觀察到Livin與Caspase 3、Caspase 7都能產(chǎn)生蛋白互作，但是Livin對(duì)Caspase酶正常的生物酶活性無明顯影響；Jin等[32]通過替莫唑胺篩選出了抗凋亡的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，檢測(cè)出了Livin的高表達(dá)，同時(shí)觀測(cè)到Caspase 3、Caspase 7、Caspase 9表達(dá)量上升；Yong等[28]通過敲低人膀胱癌細(xì)胞系T24中Livin的表達(dá)，觀察到了Caspase 3與Caspase 9的上升,而Caspase 7的表達(dá)量無明顯變化。

本研究闡明了Cal27細(xì)胞中Livin與Caspase 3之間的關(guān)系。Western blotting結(jié)果表明，對(duì)照組Cal27高表達(dá)Livin，同時(shí)，Caspase 3也有一定的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組通過基因沉默降低了Livin的表達(dá)，Caspase 3表達(dá)量有所升高。如前所述，這可能與Livin高表達(dá)通過BIR結(jié)構(gòu)域抑制了酶原pro-Caspase 3剪切為Caspase 3過程，在分子層面上部分解釋了Livin的抗凋亡機(jī)制。然而，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Cal27細(xì)胞在未經(jīng)5-FU處理時(shí)，2組的凋亡率的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與細(xì)胞內(nèi)源性自噬相關(guān)。在低刺激強(qiáng)度時(shí)，自噬體可促進(jìn)消化錯(cuò)誤折疊蛋白，維持DNA穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞凋亡來延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[33]。而刺激加劇超過閾值后，自噬上調(diào)，可表現(xiàn)為協(xié)同刺激Caspase蛋白，促進(jìn)細(xì)胞死亡[34]。自噬與凋亡交互影響，共同決定細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)歸[35-36]。在后期工作中，本課題組將持續(xù)研究Cal27細(xì)胞中自噬與凋亡是否參與到Livin在腫瘤中的抗細(xì)胞凋亡作用。

腫瘤組織的抗凋亡作用是腫瘤細(xì)胞得以生存、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，也是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感的原因之一。Livin作為IAPs家族的成員，其高表達(dá)能賦予細(xì)胞抵抗凋亡的能力。選擇Livin作為治療靶點(diǎn)，降低它的表達(dá)則能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，解決腫瘤化療耐受的問題。

綜上所述，本研究表明了口腔癌細(xì)胞Cal27與hOMECs和PDLCs相比，Livin的表達(dá)水平明顯升高，證明了降低Livin的表達(dá)可以增加Cal27細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，這一過程與Livin對(duì)Caspase 3的抑制效果有關(guān)。這為解決口腔癌化療耐受的問題提供了新的治療靶點(diǎn)。