鄒尚瀏，劉昌權(quán)，陳祝明，葉親永，李益豐，郭庭余，楊宇寧，劉思景 （廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,廣東湛江 524003）

骨肉瘤是兒童和青少年最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有較高的致殘率和致死率[1]。隨著手術(shù)、新輔助化療和重建材料等技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者總生存率從 20% 顯著提高到70%，且保肢治療已成為骨肉瘤的主要治療策略[1-2]。然而隨著治療周期延長(zhǎng)、藥物毒性及耐藥等情況出現(xiàn)，患者的化療效果受到極大影響。因此尋求一種安全且具有抗骨肉瘤作用的藥物顯得尤為重要。Tagitinin D（1-Acetyltagitinin D）屬倍半萜內(nèi)酯類天然小分子化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等作用[3-5]。目前有關(guān)Tagitinin D 在骨肉瘤中的作用機(jī)制仍未明了，因此，本研究以人骨肉瘤 MG63 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察Tagitinin D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在了解其抑制腫瘤的發(fā)生機(jī)制，為開(kāi)發(fā)并利用Tagitinin D 的藥用價(jià)值提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

人骨肉瘤MG63 細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基和100×青/鏈霉素（Gbico，美國(guó)），Tagitinin D（云南西力生物技術(shù)有限公司，純度 99%），MTS（Promega，美國(guó)），AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD，美國(guó)），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司，PRO-PREP Protein Extraction Solution（iNtRON Biotechnology，韓國(guó)），PVDF 膜（Millipore，美國(guó)）、發(fā)光液（Thermo scientific，美國(guó)），一抗、二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），兔抗Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），二抗羊抗兔及羊抗鼠（Santa Cruz，美國(guó)），BD FACSCanto II 流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），BX51 免疫熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63 細(xì)胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合達(dá)80%后（細(xì)胞數(shù)約1.0×107個(gè)），用不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）處理細(xì)胞24 h，光學(xué)顯微鏡記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 MTS 檢測(cè)Tagitinin D 對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63 細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后（細(xì)胞數(shù)約1.0×105個(gè)），更換含不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）完全培養(yǎng)基，分別處理12、24、48、72 h 后，收取樣本，結(jié)合MTS 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值（492 nm），每一濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[6]，抑制率（IR）=（對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/對(duì)照組吸光值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)PI 染色檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63 細(xì)胞接種于6 孔板中（細(xì)胞數(shù)約2.5×106個(gè)），培養(yǎng)24 h 后，用不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）處理細(xì)胞24 h，離心后加入75%乙醇，消化混勻重懸后，4 ℃固定過(guò)夜。再次離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌后離心，200 μL PBS 重懸混勻細(xì)胞后加入20 μL RNase A Solution，37 °C 水浴孵育30 min，400目篩網(wǎng)過(guò)濾后加入400 μL PI 染色液輕輕混勻，4 °C 避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63 細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞數(shù)約2.5×106個(gè)，培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，用不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）處理，收集上清液，胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心10 min，預(yù)冷PBS 漂洗，Binding Buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，同時(shí)選取100 μL細(xì)胞懸液至流式管中，混勻，加入FITC-Annexin V 和PI 溶液，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)[6]。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 將MG63 細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的12 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，用不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）處理MG63 細(xì)胞24 h 后收集爬片，固定后用0.1% Triton X-100/PBS 搖床透化10 min，滴加DAPI 覆蓋爬片，避光孵育30 min，封片，倒置熒光顯微鏡采集圖像[6]。

1.2.6 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63 細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約1.0×107個(gè)）接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，用不同濃度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）處理MG63 細(xì)胞24 h，收集貼壁和懸浮細(xì)胞，離心10 min 后去上清液，Proprep 蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAG 電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，搖床孵育2 h，加入一抗4 °C 過(guò)夜后，加入二抗，室溫孵育2 h。image J 軟件分析蛋白條帶灰度值[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析及Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tagitinin D 對(duì)MG63 形態(tài)學(xué)的影響

與0 μmol/L Tagitinin D 比較，10、20、40 μmol/L Tagitinin D 細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)胞質(zhì)皺縮，部分細(xì)胞體積縮小、變形和脫落漂?。ㄒ讶コ?，貼壁細(xì)胞間隙變大，且隨Tagitinin D 劑量增加變化越明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度Tagitinin D 處理MG63 細(xì)胞24 h 后形態(tài)變化（×100）

2.2 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值計(jì)算出 Tagitinin D 作用于 MG63 細(xì)胞的IC50 值為（28.33±1.25）μmol/L。同一時(shí)間點(diǎn)，MG63 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨Tagitinin D濃度增加而升高（P＜0.05 或0.01），見(jiàn)表1。

表1 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞增殖的影響 （，n=5 ）

表1 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞增殖的影響 （，n=5 ）

同一時(shí)間點(diǎn)與0 μmol/L Tagitinin D 比較：aP＜0.01，bP＜0.05；與10 μmol/L Tagitinin D 比較：cP＜0.01；與20 μmol/L Tagitinin D 比較：dP＜0.01

2.3 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞周期的影響

隨著Tagitinin D 濃度升高，G0/G1 期細(xì)胞比例下降，G2/M 期和S 期細(xì)胞比例升高（P＜0.05 或0.01）；當(dāng)Tagitinin D 濃度達(dá)40 μmol/L，可同時(shí)阻滯MG63 細(xì)胞G2/M 期和S 期進(jìn)展（P＜0.05 或0.01）。見(jiàn)圖2 和表2。

表2 Tagitinin D 作用MG63 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞周期分布 （，n=5）

表2 Tagitinin D 作用MG63 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞周期分布 （，n=5）

同一時(shí)期與0 μmol/L Tagitinin D 比較：aP＜0.01；與10 μmol/L Tagitinin D 比較：bP＜0.01，cP＜0.05；與20 μmol/L Tagitinin D 比較：dP＜0.01

圖2 PI 單染法檢測(cè)Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞作用24 h 后周期分布

2.4 細(xì)胞免疫熒光染色觀察Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞凋亡的影響

與0 μmol/L Tagitinin D 比較，10、20、40 μmol/L Tagitinin D 處理組中的細(xì)胞稀疏、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞核固縮等，細(xì)胞凋亡比例隨Tagitinin D 濃度的增高而增多，見(jiàn)圖3。

2.5 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞凋亡的影響

隨著Tagitinin D 濃度的增加，促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)降低（P＜0.05 或0.01），見(jiàn)圖4 和表3。

圖4 Tagitinin D 對(duì)MG63 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

表3 調(diào)亡相關(guān)蛋白條帶灰度值比 （，n=5）

表3 調(diào)亡相關(guān)蛋白條帶灰度值比 （，n=5）

與0 μmol/L Tagitinin D 比較：aP＜0.01；與10 μmol/L Tagitinin D 比較：bP＜0.01；與20 μmol/L Tagitinin D 比較：cP＜0.01，dP＜0.05

3 討論

骨肉瘤是一種罕見(jiàn)的高度異質(zhì)性、惡性骨腫瘤，具有侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)。目前，臨床上治療骨肉瘤的方式主要以化療為主同時(shí)輔以其他綜合治療。而在骨肉瘤化療過(guò)程中使用的大劑量化療藥物具有一定的毒副作用，化療周期較長(zhǎng)，并且容易導(dǎo)致細(xì)胞耐藥性增加，影響疾病治愈效果[6-7]。由于抗癌藥物存在的局限性，天然小分子化合物及其衍生物為抗癌新藥的研發(fā)提供了新的思路。有研究表明抗癌藥物中一半來(lái)源于天然產(chǎn)物及其衍生物[8]。因此，研究具有高效且低毒的藥物是治療骨肉瘤的有效途徑之一。本文主要從周期阻滯等方面研究Tagitinin D 誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中，我們首先用MTS 法檢測(cè)Tagitinin D 誘導(dǎo)人骨肉瘤MG63 細(xì)胞活力的情況，結(jié)果提示在同一時(shí)間點(diǎn)，MG63 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨Tagitinin D 濃度的增加而升高，說(shuō)明Tagitinin D 能顯著抑制MG63 細(xì)胞的活力，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增值的可能。

細(xì)胞周期中的每一時(shí)相順利轉(zhuǎn)變是細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的關(guān)鍵。Tagitinin D 在MG63 細(xì)胞中產(chǎn)生了G2/M 期和S 期相停滯，引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Tagitinin D 濃度的升高，MG63 細(xì)胞G2/M 期和S期細(xì)胞比例明顯增加，表明Tagitinin D 可能通過(guò)阻滯MG63 細(xì)胞G2/M 期和S 期進(jìn)展抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序性死亡，主要表現(xiàn)在細(xì)胞染色質(zhì)凝集并邊緣化、細(xì)胞濃縮、凋亡小體產(chǎn)生等[9]。我們通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Tagitinin D 可導(dǎo)致MG63 細(xì)胞核固縮、細(xì)胞間隙變大，提示Tagitinin D 可能誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控機(jī)制，主要通過(guò)外在和內(nèi)在的細(xì)胞凋亡兩種途徑進(jìn)行[10]。第一種途徑是內(nèi)源性或線粒體途徑，其通過(guò)促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 家族介導(dǎo)；第二種途徑是通過(guò)FAS 死亡受體介導(dǎo)的外在細(xì)胞凋亡途徑或細(xì)胞質(zhì)途徑[10-11]。在調(diào)控凋亡基因中，Bcl-2 家族主要引起內(nèi)在細(xì)胞靶向抗凋亡，與凋亡的發(fā)生、發(fā)展最為密切[11]。Westernblot 檢測(cè)結(jié)果分析，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)量呈Tagitinin D 濃度依賴性增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 呈Tagitinin D 濃度依賴性下調(diào)。本研究中我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)Tagitinin D 可能通過(guò)上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果可能進(jìn)一步支持了Tagitinin D 通過(guò)Bcl-2 家族蛋白調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究在細(xì)胞層面證實(shí)了Tagitinin D對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63 的增殖具有明顯的抑制作用，可通過(guò)改變MG63 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的平衡阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，引發(fā)細(xì)胞凋亡。