石海燕 陳美 張麗 孫毅 曾同祥 柳兵 張秋秋

(1.長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科，荊州 434100; 2.長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨關(guān)節(jié)科，荊州 434100)

青霉菌屬(Penicillium)在我們的生活環(huán)境中雖無處不在，但極少引起人類疾病[1]。我科發(fā)現(xiàn)1例以單發(fā)皮膚斑塊、結(jié)節(jié)，少許破潰、結(jié)痂為表現(xiàn)的患者。經(jīng)熒光鏡檢、組織病理、活檢組織培養(yǎng)菌落菌種及來自蠟塊組織的分子鑒定，最終確診為桔青霉引起的透明絲孢霉病，匯報如下。

1 臨床資料

1.1 臨床病史

患者，女，55歲，因左手前臂處斑塊結(jié)節(jié)4個月余來我院門診就診。4個月余前患者無明顯誘因左手前臂處出現(xiàn)綠豆大小暗紅色斑塊，后逐漸增大，出現(xiàn)破潰、結(jié)痂。在此期間曾至多家醫(yī)院就診，按“濕疹”治療，未見明顯療效。偶伴瘙癢、疼痛不適。既往無特殊病史，未飼養(yǎng)寵物。體檢檢查：生命體征平穩(wěn)，系統(tǒng)查體未見特殊。皮膚科?？茩z查：左手前臂處可見大小約1 cm×3 cm暗紅色斑塊、結(jié)節(jié)，少許破潰、結(jié)痂(見圖1A)。真菌鏡檢：取皮膚表面組織直接顯微鏡下熒光染色，可見少許熒光染色陽性的菌絲(見圖2A)；手術(shù)取活檢組織，同時病理檢查、細(xì)菌培養(yǎng)及真菌培養(yǎng)。

1.2 組織病理

鏡下見被覆鱗狀上皮增生，上皮腳延長，真皮內(nèi)及血管周圍大量中性粒細(xì)胞浸潤、淋巴細(xì)胞及組織細(xì)胞，少許嗜酸性粒細(xì)胞，個別多核巨細(xì)胞吞噬異物，10倍鏡下HE染色可見清晰的菌絲樣成分；4倍鏡及10倍鏡下的PAS染色可見大量真菌菌絲，偶見分枝狀(見圖3)。

1.3 菌種鑒定

源自活檢組織培養(yǎng)后的真菌DNA提取及測序 取活檢組織接種于沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，含卡那霉素100 μg/mL)中，放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，挑取長出的菌落接種至SDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察：觀察菌落形態(tài)，考慮青霉屬真菌(見圖2B)；同時利用Omega D3390-02 Fungal DNA Kit真菌DNA小量提取試劑盒(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)提取DNA，利用引物ITS1和ITS4對其真菌DNA的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：反應(yīng)體系50 μL，模板DNA 11 μL，上下游引物各2 μL，2×Hieff?PCR Master MIX 25 μL,添加滅菌注射用水補(bǔ)足至50 μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min 30 s,94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 共30個循環(huán)，后72℃延伸10 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至上海生工武漢分公司測序，測序結(jié)果登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行Blast比對，結(jié)果與桔青霉(P.citrinumstrain SCSAAF0015)的DNA序列一致度為99%(見圖4)。

源自福爾馬林固定后石蠟包埋的組織(FFPE)DNA提取鑒定 將蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片處理后，置于1.5 mL的無菌EP管中；采用QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen；Hilden，德國)提取總DNA。選用真菌通用引物12F和13R對上述所提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增[2]，擴(kuò)增體系如下：反應(yīng)體系為25 μL，模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μL，金牌MIX補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性4 min,98℃變性1 min，退火52℃ 1 min，延伸72℃ 1 min 共40個循環(huán)，后延伸72℃ 2 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)有限公司測序。測序所得結(jié)果確為桔青霉(P.citrinum)(見圖5)，與病變組織培養(yǎng)出來的真菌測序比對結(jié)果一致。

1.4 藥物敏感性試驗

參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)M38-A2方案[3]，配制RPMI 1 640液體培養(yǎng)基，過濾滅菌后備用。近平滑念珠菌(ATCC22019)作為本試驗的質(zhì)控菌株。將受試桔青霉接種至SDA培養(yǎng)基上，放置35℃溫箱培養(yǎng)3 d后收集孢子重懸于用生理鹽水中，再用血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整孢子量為(2～4)×106CFU/mL；然后用RPMI 1 640液體培養(yǎng)基將調(diào)整好的菌懸液稀釋100倍使其終濃度為(2～4)×104CFU/mL。將所用的實驗藥物伊曲康唑倍比稀釋成2倍于終濃度后加入96孔板中，藥物濃度范圍為0.03～4 μg/mL，每孔加入100 μL，再加入100 μL稀釋后的菌懸液。H1孔為生長對照(無藥物孔)和H10孔為空白對照(無菌孔)。放置35℃溫箱孵育48 h。然后肉眼觀察判讀結(jié)果，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)讀取肉眼觀察到的真菌生長100%受抑制的最低藥物濃度。

1.5 診斷與治療

診斷 桔青霉所致的透明絲胞霉病。經(jīng)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定，分離菌種鑒定為桔青霉。

治療 微量液基稀釋法測得伊曲康唑?qū)Υ私矍嗝沟腗IC值為0.5 μg/mL。根據(jù)臨床經(jīng)驗及實驗結(jié)果抗真菌治療予伊曲康唑200 mg/d口服治療。治療1個月后復(fù)診，皮疹較前明顯好轉(zhuǎn)，皮疹范圍明顯縮小，斑塊結(jié)節(jié)變小，破潰糜爛面愈合(見圖1B)。

2 討 論

桔青霉(P.citrinum)極少引起人類感染，屬于一種條件致病菌[4]，可引起角膜炎、皮膚感染、肺炎。在我們的病例中，患者皮損處的皮屑直接熒光鏡檢陽性，手術(shù)取得活檢組織切除后進(jìn)行組織病理檢查提示真菌感染，與此同時發(fā)現(xiàn)活檢組織培養(yǎng)陽性，我們提取了來自活檢組織培養(yǎng)后的真菌DNA，并對其DNA進(jìn)行擴(kuò)增并送測序，測序結(jié)果提示桔青霉，為進(jìn)一步明確菌種，我們又對蠟塊組織的真菌DNA進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定(由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科宋營改博士輔助完成)，比對了來自活檢組織培養(yǎng)出來的真菌DNA和來自蠟塊組織的真菌DNA序列，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果均為桔青霉，最終確診為桔青霉所致的透明絲胞霉病，可排除實驗室污染的可能。我們檢索到6例人類桔青霉感染的報道，均發(fā)生在免疫受損的患者，其中4例引起嚴(yán)重的肺部疾病[5-7]，1例在白內(nèi)障術(shù)后導(dǎo)致眼內(nèi)炎[8]，另1例在急性白血病患兒導(dǎo)致皮膚的感染[9]。均通過微生物學(xué)及組織病理學(xué)確診。其中3例均發(fā)生在接受強(qiáng)化化療的白血病患者中，肺部感染患者在接受甲強(qiáng)龍抗炎治療的同時給予抗真菌藥物(兩性霉素B、卡泊芬凈、氟康唑、泊沙康唑或伊曲康唑)治療。導(dǎo)致眼內(nèi)炎的患者玻璃體腔內(nèi)注射兩性霉素B，口服氟康唑，但最終療效欠佳摘除眼球；而在我們的病例中，患者自述既往無特殊病史，門診檢查血糖值正常，且未發(fā)現(xiàn)患者有其他免疫系統(tǒng)受損疾病，因此筆者推測可能由外傷引起的真菌感染。雖然針對桔青霉引起的透明絲孢霉病目前國際上沒有標(biāo)準(zhǔn)的診療指南，但是根據(jù)美國德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心(University of Texas Health Science Center at Houston)的真菌檢測實驗室對10株桔青霉抗真菌藥物敏感性試驗報告，兩性霉素B MIC≤1 μg/mL，卡泊芬凈MIC≤0.125 μg/mL，米卡芬凈MIC≤0.25 μg/mL，伊曲康唑MIC≤4 μg/mL，泊沙康唑為MIC≤2 μg/mL，伏立康唑MIC>16 μg/mL[10]，伏立康唑的最低抑制濃度很高(MIC>16 μg/mL)，而其他三唑類和其他類型的抗真菌劑的MIC均小于或等于4 μg/mL，因此伏立康唑不能作為桔青霉感染抗真菌治療的一線用藥。另外有研究證實兩性霉素B和伊曲康唑常用于治療青霉菌感染引起的真菌病，但因兩性霉素B不良反應(yīng)較大、成本較高等弊端，大多情況下我們用廣譜抗真菌藥伊曲康唑代替兩性霉素B治療[11]。因此我們在對其進(jìn)行分子鑒定的同時根據(jù)病理及傳統(tǒng)的真菌學(xué)檢查結(jié)果給予伊曲康唑200 mg/d口服治療1個月后，患者病情取得良好的改善。

致 謝

感謝北京大學(xué)第一醫(yī)院李若瑜教授對本例患者診治過程中給予的幫助和指導(dǎo)。