魏天琦 劉沐桑

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所， 南京 210042)

生物膜的形成對臨床感染的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響[1]。真菌生物膜是由真菌細胞和菌絲以及胞外基質(zhì)包裹形成的復(fù)雜群落，能夠表現(xiàn)出比游離真菌更強的致病性和耐藥性[2]。隨著激素、免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用和各種人工植入物的使用，真菌感染的發(fā)病率顯著上升，生物膜相關(guān)的感染及其耐藥帶來的治療困難已成為嚴重的臨床問題[3]。幾乎所有致病真菌均能夠形成生物膜和胞外基質(zhì)，尤其在侵襲性真菌病中更為常見，目前關(guān)于生物膜的研究大多集中在白念珠菌和其他念珠菌屬以及煙曲霉等致病真菌[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在大規(guī)模水平上分離和鑒定蛋白質(zhì)，近年來隨著技術(shù)不斷進步發(fā)展，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為重要的研究手段之一[4]。目前在生物膜研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)不僅分離鑒定出了相關(guān)特征性蛋白，還證明了真菌生物膜耐藥性可能與其生長過程中的某些與能量和代謝相關(guān)酶的表達上調(diào)或下調(diào)有關(guān)，例如增強了對表面相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，活性氧的積累，氧化應(yīng)激反應(yīng)的上調(diào)等，但具體機制尚未完全闡明[5-6]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)通過提供真菌生物膜蛋白質(zhì)全面和系統(tǒng)的描述，為研究其耐藥相關(guān)蛋白提供了新的思路。本文將綜述蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究進展及其在真菌生物膜中的應(yīng)用。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，是生物結(jié)構(gòu)和功能的主要載體。蛋白質(zhì)組學(xué)則是在大規(guī)模水平上對所有蛋白質(zhì)進行分離和鑒定，分析蛋白質(zhì)表達、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用等[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究包括對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析，主要基于電泳(electrophoresis)和質(zhì)譜(mass spectroscopy，MS)技術(shù)。隨著研究范圍和研究樣本的不斷擴大，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，目前的研究重點已從最初的定性分析轉(zhuǎn)移到高通量和高分辨率的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，并得到廣泛應(yīng)用。

1.1 基于電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

二維凝膠電泳(2-DE)結(jié)合質(zhì)譜分析是傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離鑒定方法，但是存在檢測的靈敏度低、低豐度蛋白質(zhì)無法鑒定、極性蛋白無法回收等問題。隨后，利用熒光標記標示的二維相差凝膠電泳(two-dimensional difference in-gel electrophoresis，2-D DIGE)的出現(xiàn)提高了蛋白質(zhì)分離結(jié)果的重復(fù)性、可靠性和準確性，不過2-D DIGE缺點在于所需技術(shù)和設(shè)備復(fù)雜，自動化程度低，熒光染劑對小分子量蛋白不能完全標定等[8]?；陔娪镜牡鞍踪|(zhì)分離技術(shù)存在一定局限性，容易受外界環(huán)境的干擾，對一些特殊性質(zhì)的蛋白質(zhì)不能很好地分離，并且操作繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，靈敏度低，因此應(yīng)用范圍也受到一定限制[9]。

1.2 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

質(zhì)譜是鑒定蛋白質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)，隨著研究不斷深入，高通量質(zhì)譜技術(shù)成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)的重要工具[10]。在微生物領(lǐng)域，質(zhì)譜已經(jīng)開始用于臨床真菌和細菌的檢測，展示出臨床診斷應(yīng)用的巨大潛力[11]。質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)和多肽需要將樣品進行離子化，目前主要應(yīng)用的有基質(zhì)輔助激光解吸離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)和電噴霧離子化(electrospray，ESI)兩種模式。一級質(zhì)譜檢測所有帶電離子的質(zhì)荷比和強度，形成一級譜圖；二級質(zhì)譜按照一定方式選擇一級圖譜中的母離子肽段，將其進一步解離，分析所形成的子離子的質(zhì)荷比和強度[12]。相比于單一的相對分子量信息進行蛋白和多肽測定，通過二級質(zhì)譜分析，其靈敏度和準確度均得到了提高。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)對蛋白質(zhì)進行相對定量研究和絕對定量研究。相對定量技術(shù)分為體內(nèi)標記的穩(wěn)定同位素標記(SILAC)，體外標記的同位素編碼的親和標記(ICAT)、同位素交換以及用于相對和絕對定量(iTRAQ)/串聯(lián)質(zhì)量標簽(TMT)，還有無標記定量的同量異位標簽技術(shù)[13-14]。近年來，離子淌度功能(ion mobility)的引入實現(xiàn)了保留時間、質(zhì)荷比、離子強度和離子淌度的四維數(shù)據(jù)采集，使得蛋白質(zhì)組學(xué)進入4D時代[15-16]。離子淌度質(zhì)譜讓數(shù)據(jù)采集的速度和靈敏度都有了大幅度的提升，為高通量蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更強大的技術(shù)支持[17]。同時，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集技術(shù)也在不斷革新和發(fā)展，傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴型(DDA)采集模式隨機性、數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差[18]。新的數(shù)據(jù)非依賴型(DIA)的質(zhì)譜采集模式通量高、重現(xiàn)性好、定量準，通過全掃描對所有母離子進行碎裂檢測，以獲得所有碎片離子信息，已成為當(dāng)前最熱門的質(zhì)譜技術(shù)之一[19]。上述這些特征對于高通量蛋白質(zhì)組的定量分析具有顯著優(yōu)勢。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)獲得海量的數(shù)據(jù)，建立了面向不同層次的不同需求的數(shù)據(jù)庫，如包含原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)資源的PRIDE、PASSEL、Chorus數(shù)據(jù)庫，肽段/蛋白質(zhì)鑒定及定量的結(jié)果資源GPMDB、ProteomicsDB、MaxQB等以及蛋白質(zhì)知識庫UniProt系列數(shù)據(jù)庫[20]。通過對上述數(shù)據(jù)進行整合、挖掘、利用，能夠多角度、多途徑地分析生物標本蛋白質(zhì)，從而探究疾病的發(fā)生和發(fā)展，鑒定疾病相關(guān)的抗原/抗體、篩選診斷相關(guān)標志物、發(fā)現(xiàn)有效治療靶點及評估臨床療效等。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在真菌生物膜中的應(yīng)用

隨著生物膜相關(guān)的侵襲性真菌感染的發(fā)病率上升，與生物膜致病性和耐藥性相關(guān)蛋白和分子機制的探討已經(jīng)成為近年來研究的熱點。生物膜的形成參與了侵襲性真菌感染的致病過程，因此被認為是一種重要的毒力因子[1]。此外，真菌生物膜的一個顯著特性就是對各種抗真菌藥物的高度耐藥性[3]。真菌生物膜耐藥性形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括持留菌(persisters)在底物的附著和胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的產(chǎn)生[21]。雖然不同真菌所形成的生物膜基質(zhì)成分不盡相同，但是均與耐藥機制相關(guān)，并參與形成生物膜細胞耐藥的表型[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了有關(guān)持留菌和胞外基質(zhì)等生物膜中的蛋白質(zhì)成分的定性、定量和功能信息，為深入探索生物膜相關(guān)真菌耐藥機制提供了新思路。

2.1 在念珠菌生物膜中的應(yīng)用

白念珠菌是一種常見的機會性致病菌，可引起侵襲性念珠菌病，在宿主和醫(yī)療植入物表面形成生物膜[21]。研究表明，白念珠菌在體內(nèi)誘導(dǎo)的獲得性耐藥過程中，其形成生物膜的能力也有較大差異[22]。白念珠菌是最早開始用于生物膜胞外基質(zhì)研究的真菌，也是醫(yī)學(xué)真菌生物膜耐藥機制研究的中心，其蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果最為豐富[23]。早期Thomas等[24]基于2D-PAGE的蛋白質(zhì)組學(xué)提出白念珠菌浮游真菌和生物膜提取物的蛋白質(zhì)圖譜具有高度的相似性。隨后Martínez等[25]使用2-D DIGE和基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)比較了浮游細胞、菌絲和生物膜的胞質(zhì)蛋白和表面蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示酵母細胞和菌絲具有獨特的蛋白質(zhì)譜。對胞質(zhì)蛋白的比較分析顯示，酵母細胞表現(xiàn)出較大差異；而在表面蛋白的比較分析中，生物膜則表現(xiàn)出較大差異。這些差異蛋白分別與呼吸、糖酵解和葡萄糖代謝、葉酸相互轉(zhuǎn)化、氧化和應(yīng)激反應(yīng)以及多生物體相互作用有關(guān)。

Zarnowski等[26]較為全面地分析了組成白念珠菌生物膜基質(zhì)的四類大分子物質(zhì)，按干重計算，它們包含55%的蛋白質(zhì)、25%的碳水化合物、15%的脂質(zhì)和5%的核酸。隨后他們對蛋白質(zhì)成分進行了組學(xué)分析，結(jié)果表明白念珠菌生物膜基質(zhì)中蛋白質(zhì)的相對豐度遠高于之前Thomas等的報道[24,27]，其中458個蛋白具有獨特性，許多與碳水化合物和氨基酸代謝有關(guān)，這些與Faria-Oliveira等[28]鑒定出的蛋白質(zhì)類別是相似的。Gil-Bona等[29]則通過蛋白質(zhì)組學(xué)以及對所選突變菌株的功能分析，鑒定出了白念珠菌生物膜相關(guān)的蛋白，研究提示它們與細胞壁維持、滲透和對抗氧化應(yīng)激有關(guān)。最近的一項定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究通過LC-MS比較鑒定了白念珠菌浮游細胞和生物膜的差異蛋白質(zhì)，Munusamy 等[30]指出葉酸代謝、脂肪酸代謝和氨基酸(賴氨酸、絲氨酸和甘氨酸)的生物合成與生物膜相關(guān)途徑密切相關(guān)，同時研究提出了白念珠菌生物膜蛋白與兩個主要生物過程有關(guān)，即細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運。

Li等[31]通過LC-MS分析白念珠菌生物膜的持留菌蛋白質(zhì)組，探究持留菌耐藥機制，白念珠菌生物膜持留菌表現(xiàn)出特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，鑒定到205種差異表達的蛋白質(zhì)。其中參與糖酵解、三羧酸循環(huán)和蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶明顯下調(diào)，而許多與念珠菌生長、毒力和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的重要蛋白質(zhì)被大大上調(diào)。研究中還發(fā)現(xiàn)盡管存在高度誘導(dǎo)的細胞內(nèi)超氧化物歧化酶，持留菌卻對氧化應(yīng)激具有耐受性。Truong 等[32]通過iTRAQ比較了單倍體和二倍體白念珠菌形成的生物膜持留菌蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示細胞壁過氧化物酶(alkyl hydroperoxide reductase 1，AHP1)在兩性霉素B耐藥性更弱的單倍體生物膜中表達較少，提示AHP1是決定白念珠菌生物膜持留菌抗兩性霉素B 的關(guān)鍵性因素，揭示了AHP1可能通過維持持留菌的抗氧化能力，從而達到生物膜對兩性霉素B抗性作用的新機制。這些研究結(jié)果表明，精細的代謝控制和協(xié)調(diào)的應(yīng)激反應(yīng)可能在介導(dǎo)念珠菌生物膜持留菌的存活和抗真菌耐受性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

除了白念珠菌，其他念珠菌屬真菌也能夠形成生物膜，引起血行感染和導(dǎo)管或植入器械相關(guān)感染的念珠菌病，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌等[3]。Seneviratne等[33]應(yīng)用2D DIGE和MALDI-TOF-MS比較浮游細胞和生物膜狀態(tài)下光滑念珠菌的差異蛋白質(zhì)組譜，結(jié)果表明生物膜蛋白質(zhì)組應(yīng)激反應(yīng)蛋白上調(diào)，糖酵解酶下調(diào)，而且在轉(zhuǎn)錄水平上也可以觀察到類似的趨勢。這一發(fā)現(xiàn)提示光滑念珠菌生物膜可能通過表達更多的應(yīng)激反應(yīng)蛋白來增強自身的抗真菌耐藥性。

上述蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果使我們對念珠菌生物膜生長方式、耐藥機制有了更深入的認識，也為研究抗真菌藥物對生物膜的影響和未來尋找新的潛在藥物靶點提供了方向。

2.2 在煙曲霉生物膜中的應(yīng)用

煙曲霉感染免疫受損人群可以導(dǎo)致嚴重的侵襲性曲霉病，近年來其發(fā)病率逐漸上升，因其高致死率而被廣泛關(guān)注[34]。煙曲霉在體內(nèi)和體外均能形成生物膜，并表現(xiàn)出更高的致病性和耐藥性[35]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究煙曲霉生物膜形成導(dǎo)致的細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)成分變化，分析特征性蛋白質(zhì)功能及其參與的代謝調(diào)控途徑。Reichhardt等[36]研究分析了煙曲霉生物膜ECM的組成成分，數(shù)據(jù)表明ECM含有約40%的蛋白質(zhì)、43%的多糖、3%的芳香族成分和高達14%的脂質(zhì)。同時他們應(yīng)用SDS-PAGE和MS技術(shù)鑒定了ECM蛋白質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)其兩種獨特的蛋白質(zhì)，過氧化氫酶B(catalase B)和Asp f2，其中Asp f2已經(jīng)被證明是主要的過敏原。這兩種蛋白質(zhì)通常都是由細胞分泌出來的，并且都存在于煙曲霉的細胞表面或細胞外。而對于煙曲霉生物膜形成過程中的基因表達特點，Bruns等[37]對蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究表明，生物膜在形成早期需要能量，而在晚期成熟時則表現(xiàn)出能量代謝的減弱。在蛋白質(zhì)組水平上，參與氨基酸生物合成、蛋白質(zhì)降解和三羧酸(TCA)循環(huán)的蛋白質(zhì)在生物膜菌絲中表現(xiàn)出差異調(diào)節(jié)。在生物膜成熟期間，糖酵解、檸檬酸循環(huán)三磷酸腺苷(ATP)合成酶水平隨著時間的推移而降低，而乙醛脫氫酶的表達則顯著上調(diào)。此外，參與次級代謝產(chǎn)物生物合成的蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，隨后的定量檢測證明，其中膠質(zhì)毒素的產(chǎn)生增多。這暗示了在體內(nèi)條件下，煙曲霉生物膜膠質(zhì)毒素的產(chǎn)生增加可能保護其免受宿主免疫系統(tǒng)的傷害，從而使之在慢性肺部感染中持續(xù)存在。此外，在煙曲霉生物膜耐藥機制方面，Ranjith等[38]通過對伏立康唑處理的煙曲霉中外排泵的相位依賴性表達和活性的研究表明，外排泵(efflux pump)在煙曲霉生物膜中表達，并且提高其對唑類的耐藥性。不僅如此，用伏立康唑處理煙曲霉還可以誘導(dǎo)外排泵表達。這些為曲霉病臨床病例中的唑類抗真菌藥的治療失敗提供依據(jù)。

目前的蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示了煙曲霉生物膜形成過程中某些蛋白質(zhì)表達的變化，已經(jīng)鑒定的功能蛋白的差異調(diào)節(jié)大多與能量代謝及氧化應(yīng)激有關(guān)，這與念珠菌生物膜中的發(fā)現(xiàn)具有相似性，對進一步探究相關(guān)分子機制具有重要意義。

2.3 在其他病原真菌生物膜中的應(yīng)用

除了上述提到的常見的生物膜相關(guān)致病真菌，其他酵母和絲狀真菌也能引起生物膜相關(guān)感染，包括新生隱球菌、厚皮馬拉色菌、毛孢子菌等病原真菌[3]。Santi 等[39]利用鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)比較了新生隱球菌生物膜和浮游細胞之間蛋白質(zhì)豐度的差異，結(jié)果在生物膜生長模式下50種蛋白質(zhì)上調(diào)和81種蛋白質(zhì)下調(diào)。其中上調(diào)2倍以上的蛋白質(zhì)包括與氧化還原、蛋白水解和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)，如氧化還原酶、肽酶、過氧化氫酶、谷硫二硫還原酶、HSP70等。Yang等[40]使用TMT結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析了兩株毛孢子菌的蛋白質(zhì)組，分別來自初發(fā)和復(fù)發(fā)的系統(tǒng)性播散性毛孢子菌病的患者，共鑒定到597個差異表達蛋白，其中在復(fù)發(fā)性患者來源菌株中2種熱休克蛋白顯著上調(diào)，提示可能與生物膜形成相關(guān)。

這些研究證據(jù)提示不同真菌在生物膜形成時可能具有相似的蛋白質(zhì)組變化趨勢，暗示可能與某些共同的分子途徑相關(guān)，并在致病過程中發(fā)揮作用，參與宿主相互作用或形成耐藥趨勢，這對發(fā)現(xiàn)不同真菌共同的致病機制和對同類抗真菌藥的耐藥機制具有重要意義。

3 真菌生物膜與固有免疫識別

生物膜中的多糖成分不僅構(gòu)成細胞壁的重要組分，也存在于生物膜ECM中[23]。Beauvais等[41]對曲霉生物膜基質(zhì)進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其含有半乳甘露聚糖、α-1,3-葡聚糖、蛋白質(zhì)、多元醇和黑色素，其中半乳甘露聚糖存在于細胞壁和基質(zhì)中，而α-1,3-葡聚糖主要位于細胞外菌絲表面附近。真菌細胞壁中的β-1,3-葡聚糖在真菌中較為保守且廣泛存在，并作為病原體相關(guān)分子模式 (pathogen associated molecular pattern, PAMP)，能夠被特定的模式識別受體(pattern-recognition receptor, PRR)識別[42]，如TOLL樣受體家族的TLR2、TLR6，C型凝集素受體家族(CLRs)的Dectin-1、Dectin-2、甘露糖受體、CARD9(caspase recruitment domain 9)集合蛋白SP-A和SP-D[43]。這些PRRs對真菌細胞壁PAMPs的識別是抗真菌免疫、激活天然免疫反應(yīng)和形成適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，而真菌能夠通過改變其細胞壁的組成掩蓋或脫落主要的PAMP，如β-葡聚糖，來逃避宿主的免疫識別[44]。研究表明抑制β-1,3-葡聚糖的合成會促進PAMPs的暴露，進而激活免疫防御機制，而α-葡聚糖主要作為毒力因子是否能被PRR特異性識別目前尚不清楚[45]。

4 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上研究生物膜的生活方式、致病性、耐藥機制及與藥物的相互作用，已經(jīng)取得了顯著進展[46]?；诙ㄐ院投康鞍踪|(zhì)組學(xué)通過研究真菌胞外基質(zhì)和持留菌，繪制了多種真菌生物膜的特征性蛋白圖譜，提出其與游離真菌在蛋白質(zhì)組上的差異，并鑒定出了相關(guān)蛋白質(zhì)功能，為了解真菌生物膜相關(guān)感染的發(fā)病機制和抗真菌藥物開發(fā)等奠定了基礎(chǔ)。然而，生物膜形成過程中涉及的生物大分子還包括某些非蛋白成分[23]，蛋白質(zhì)組學(xué)并不能揭示與耐藥性相關(guān)的蛋白質(zhì)的變化與某些非蛋白質(zhì)成分之間的相互關(guān)系。同時，生物膜的形成是一個動態(tài)變化的過程，對于生物膜發(fā)育過程中不同時期蛋白質(zhì)組學(xué)變化的研究也還甚少。研究真菌生物膜不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)表達譜以及藥物作用下的生物膜蛋白質(zhì)組，將有助于進一步發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)生物膜形成的分子機制，并為研究其耐藥性提供新思路。在介導(dǎo)或逃逸宿主免疫過程中，真菌細胞壁中的多糖成分作為PAMP的作用不容忽視，并且參與生物膜的形成。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了β-葡聚糖在真菌感染天然免疫防御的中心作用，以及α-葡聚糖作為真菌毒力因子的功能。目前，人們已經(jīng)從真菌中鑒定出多種α和β-葡聚糖合成所必需的多種酶，并對細胞壁葡聚糖合成的研究機制進行了大量的研究，不過仍有許多問題未得到解決[47]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法尋找或錨定病原真菌利用哪些蛋白成分負責(zé)轉(zhuǎn)運多糖類PAMPs至生物膜上，并通過何種酶類加以修飾，將可能成為今后研究中需要關(guān)注或解決的問題。此外，目前大多數(shù)研究的是體外生物膜，在體內(nèi)或臨床環(huán)境中形成的生物膜的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)仍較少，體內(nèi)生物膜的樣本獲取和蛋白質(zhì)研究對于生物膜的蛋白質(zhì)組學(xué)來說將是一個新的挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)在真菌生物膜研究中整體描述了基因轉(zhuǎn)錄的最終產(chǎn)物，對于蛋白質(zhì)參與的代謝和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，涉及相關(guān)基因和代謝水平的調(diào)控，未來多組學(xué)聯(lián)合分析的參與將會帶來更廣闊的應(yīng)用空間。