李姝麗 吳秀禎 王志賢 盛長(zhǎng)忠 周澤奇 陳龍

[1.天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，天津 300072; 2.天津市侵襲性真菌病精準(zhǔn)診斷技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300467; 3.丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300467; 4.天津科技大學(xué)輕工技術(shù)與工程學(xué)院，天津 300457]

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是導(dǎo)致曲霉病的最常見病原體，唑類藥物如伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑是治療曲霉病的一線藥物。近年來，隨著唑類藥物的廣泛使用，全球范圍內(nèi)的煙曲霉耐藥率迅速增加，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。煙曲霉唑類耐藥機(jī)制有多種，其中最常見的是cyp51A基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[2-3]。常見的耐藥檢測(cè)方法主要包括基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測(cè)、質(zhì)譜、NGS技術(shù)和PCR技術(shù)。煙曲霉耐藥機(jī)制的研究及耐藥菌的鑒定對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。文章對(duì)臨床或文獻(xiàn)報(bào)道的煙曲霉唑類耐藥機(jī)制及檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)。

1 煙曲霉唑類藥物耐藥機(jī)制

唑類藥物包括氟康唑、酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等，是治療曲霉病的一線藥物。唑類藥物通過非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制細(xì)胞膜中麥角固醇合成通路中的關(guān)鍵蛋白-羊毛甾醇14-α-去甲基化酶(Cyp51A)的活性，影響麥角固醇的生物合成，進(jìn)而影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和膜結(jié)合蛋白酶的活性，從而殺傷菌體[4]。

已報(bào)道的煙曲霉唑類耐藥機(jī)制包括：Cyp51A蛋白構(gòu)象改變或過表達(dá)、外排泵相關(guān)蛋白過表達(dá)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和形成生物被膜等，其中由cyp51A基因突變引起的蛋白構(gòu)象改變是最重要的耐藥機(jī)制[5]。超過20種cyp51A點(diǎn)突變，如G54、G138、M220、G448等，可引起蛋白構(gòu)象改變，致使唑類藥物不能與之結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性[6-7]。另外，cyp51A基因的啟動(dòng)子區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列(tandem repeat，TR)，如TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A可以使Cyp51A蛋白過量表達(dá)，從而增加菌體對(duì)唑類藥物的耐受性，這種情況約占全部唑類耐藥突變類型的80%[8]。

2 耐藥檢測(cè)方法

2.1 基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測(cè)方法

分離培養(yǎng)是耐藥檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，典型方法是標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法和瓊脂/紙片擴(kuò)散法。美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)和歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)分別針對(duì)絲狀真菌制定了標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏實(shí)驗(yàn)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)[9]。

肉湯稀釋法 肉湯稀釋法是測(cè)定抗真菌藥物最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在微孔板中加入等量的真菌培養(yǎng)基和連續(xù)稀釋的抗真菌藥物，孵育一段時(shí)間后，通過觀察培養(yǎng)基的渾濁度判斷真菌的生長(zhǎng)情況。目前，商業(yè)化產(chǎn)品有英國(guó)的Sensititre YeastOne?(TREK Diagnostic Systems, West Sussex, UK)顯色藥敏板，適用于念珠菌、曲霉和隱球菌等。它在每個(gè)稀釋孔中加入了顯色試劑，可根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化判斷真菌的生長(zhǎng)或抑制，其中紅色表示生長(zhǎng)、紫色表示生長(zhǎng)抑制、藍(lán)色表示無生長(zhǎng)[10]。該方法可用于兩性霉素B、氟胞嘧啶、多種棘白菌素類藥物和伏立康唑、泊沙康唑等三唑類藥物的抗真菌活性的測(cè)定[11]。

瓊脂/紙片擴(kuò)散法 基于瓊脂/紙片擴(kuò)散法的商業(yè)化產(chǎn)品中，最常用的是法國(guó)生物梅里埃公司的E-test?(Biomérieux, Marcy-l’étoile, France)[12]。該方法是在試紙條上包被一定濃度梯度的抗真菌藥物，將其置于涂有煙曲霉孢子懸浮液的平板中，孵育24～48 h后，會(huì)在平板上觀察到橢圓形的生長(zhǎng)抑制。該方法能夠測(cè)定兩性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈、伏立康唑、泊沙康唑等多種抗真菌藥物對(duì)煙曲霉的MIC值[13]，在煙曲霉的耐藥檢測(cè)中廣泛使用，常用于對(duì)肉湯稀釋法藥敏檢測(cè)結(jié)果的復(fù)驗(yàn)。

基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測(cè)方法得到的結(jié)果比較可靠、檢測(cè)成本低，臨床上廣泛應(yīng)用。但由于檢測(cè)周期長(zhǎng)、敏感性低、培養(yǎng)過程易污染，難以滿足臨床早期快速診斷的需求。

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)方法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionizationationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是目前發(fā)展最快的耐藥檢測(cè)技術(shù)之一。該方法使用復(fù)合相關(guān)指數(shù)(composite correlation index，CCI)分析不同濃度藥物壓力下細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白譜之間的相關(guān)性，得到最低藥物濃度(minimal profile change concentration，MPCC)，近似于肉湯稀釋法的MIC值[14]。該方法可準(zhǔn)確檢測(cè)出耐伏立康唑的煙曲霉菌株，并在檢測(cè)煙曲霉對(duì)卡泊芬凈的耐藥性方面與肉湯稀釋法有很好的一致性[15]。相較于真菌藥敏實(shí)驗(yàn)，MALDI-TOF MS檢測(cè)速度快、所需的樣本量少、檢測(cè)通量大、覆蓋菌種范圍廣，非常適合臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。但是MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)分析依賴于強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，隨著對(duì)真菌種類和耐藥突變研究的不斷深入，需對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行持續(xù)更新。另外，不同地域的真菌病原種類及藥物耐受情況不完全相同，因此有必要建立適合本地區(qū)的真菌病原生物質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)[16]。目前，MALDI-TOF MS方法只能利用純培養(yǎng)物，無法直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，因此會(huì)延長(zhǎng)檢測(cè)周期[17]。此外，隨著培養(yǎng)條件不同，峰值會(huì)發(fā)生一定變化，這增加了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的困難程度[18]。

2.3 NGS檢測(cè)方法

二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)通過測(cè)定樣本中的全部核酸序列，在全基因組水平上實(shí)現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)，這使臨床核酸序列信息的使用提升到新的水平[19]。利用NGS技術(shù)能夠檢測(cè)臨床分離株基因組中與耐藥性有關(guān)的、可能被靶向DNA序列分析遺漏的新突變類型，在臨床耐藥真菌的檢測(cè)方面具有很大潛力。目前它已經(jīng)用于念珠菌中與唑類、棘白菌素類耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)[20-22]，但在耐藥煙曲霉鑒定方面的應(yīng)用較少。Hagiwara等[23]曾經(jīng)利用NGS技術(shù)對(duì)8株臨床分離的煙曲霉進(jìn)行耐藥檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中4株攜帶基因突變，其中1株基因組中包含與伊曲康唑耐藥相關(guān)的cyp51A(P216L)突變，進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)11個(gè)基因的缺失。而傳統(tǒng)方法(如PCR方法或微衛(wèi)星基因分型)則無法檢測(cè)出這些突變。盡管NGS技術(shù)在耐藥基因突變檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)明顯，但其檢測(cè)的精度取決于測(cè)序深度，現(xiàn)階段檢測(cè)單核苷酸突變的成本較高；另外，臨床樣本尚不能進(jìn)行直接檢測(cè)且對(duì)操作人員專業(yè)性的要求很高，這使其在現(xiàn)階段難以在臨床上大規(guī)模應(yīng)用[24]。

2.4 PCR檢測(cè)方法

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)，通過檢測(cè)cyp51A基因的典型耐藥突變位點(diǎn)間接反映菌株的耐藥性。

PCR方法中應(yīng)用最普遍的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)與探針熔解曲線技術(shù)。在反應(yīng)體系中加入多條經(jīng)不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的、覆蓋不同耐藥突變位點(diǎn)的TaqMan探針，待擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。隨著體系中溫度的升高，探針逐漸從模板鏈上脫落，有一半探針脫落時(shí)的溫度為該探針與對(duì)應(yīng)模板的Tm值。含有突變堿基的模板與探針的Tm值低于完全匹配的模板，因此能夠通過Tm值的差異鑒定野生型和突變基因；同時(shí)，可在一個(gè)體系中添加多條探針實(shí)現(xiàn)多個(gè)耐藥靶點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)[25]。

目前，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的煙曲霉唑類耐藥檢測(cè)商業(yè)化產(chǎn)品包括AsperGenius?、MycoGenie?和Fungiplex azolus?(見表1)。這三款產(chǎn)品都能直接從臨床樣本中，同時(shí)進(jìn)行曲霉種屬鑒定和煙曲霉耐藥檢測(cè)，利用多重?zé)晒釶CR方法與熔解曲線分析cyp51A基因的耐藥突變，選擇的靶點(diǎn)分別是TR34/L98H和Y121F/T289A突變(AsperGenius?)、TR34/L98H(MycoGenie?)、TR34和TR46(Fungiplex azolus?)，其中AsperGenius?的靶點(diǎn)最全，對(duì)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)和血液樣本中檢測(cè)效果好，對(duì)其性能的報(bào)道最多。Chong等[26-27]曾經(jīng)在2015年和2016年對(duì)AsperGenius?的檢測(cè)效果進(jìn)行報(bào)道，在19份來自血液病和ICU患者的BAL樣本中，成功鑒定出16個(gè)曲霉陽(yáng)性樣本，其中14份為煙曲霉。對(duì)14份煙曲霉陽(yáng)性樣本進(jìn)行耐藥檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，12份為野生型，1份TR34/L98H突變，1份為TR46/Y121F/T289A突變。另外，在一項(xiàng)對(duì)201名疑似IA的血液病患者的多中心的前瞻性研究中，檢出97例曲霉陽(yáng)性，其中有68例(70%)耐藥PCR鑒定陽(yáng)性，其中7個(gè)樣本中檢測(cè)到TR34/L98H突變，1個(gè)樣本中檢測(cè)到TR46/Y121F/T289A突變，3個(gè)樣本中同時(shí)檢測(cè)到野生型和TR34/L98H突變組合。MycoGenie?缺乏TR46/Y121F/T289A靶點(diǎn)，影響其檢測(cè)靈敏性，在呼吸道樣本(n=88)敏感性和特異性為92.9%和90.1%，對(duì)于血清樣本的敏感性和特異性為100%和84.6%[28]。qPCR方法無需獲得純的真菌培養(yǎng)物，直接通過擴(kuò)增臨床樣本中的核酸，即時(shí)、快速、高效地對(duì)其進(jìn)行耐藥鑒定。

表1 商業(yè)化煙曲霉唑類耐藥檢測(cè)PCR產(chǎn)品[29]Tab.1 Commercial PCR assays for the detection of azole resistance in A. fumigatus

PCR擴(kuò)增與基因測(cè)序聯(lián)合使用也可用于臨床煙曲霉的耐藥檢測(cè)。Trama等[30]直接對(duì)56份全血樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序，發(fā)現(xiàn)2份樣本中含有cyp51A基因的G54突變。另外，一些沒有被探針覆蓋的突變位點(diǎn)可以通過測(cè)序方法檢測(cè)到；但是與商業(yè)化的qPCR檢測(cè)產(chǎn)品相比，測(cè)序相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大量臨床樣本的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

新型的煙曲霉唑類耐藥檢測(cè)方法彌補(bǔ)了藥敏實(shí)驗(yàn)敏感性低、耗時(shí)長(zhǎng)的不足，但目前MALDI-TOF MS和NGS尚處于技術(shù)攻關(guān)時(shí)期，短期內(nèi)無法滿足臨床診斷的需求，qPCR技術(shù)相對(duì)成熟，商業(yè)化的產(chǎn)品靈敏度高、檢測(cè)成本低，更適于臨床分級(jí)診療。但qPCR方法只能檢測(cè)已知的耐藥靶點(diǎn)，隨著對(duì)耐藥機(jī)制的深入研究，多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合使用而形成的多維立體檢測(cè)方案，有利于提高對(duì)耐藥基因的早期診斷并為臨床用藥提供參考。