孟玲寧 曹小利 張燕 周萬青 沈瀚

(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 221000)

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是一種細胞分泌的膜性囊泡。研究表明EVs在細胞生命的許多方面起著重要作用，包括細胞間的通訊、發(fā)病機制和癌癥進展[1]。然而，EVs在微生物學中的作用卻研究較少，EVs在微生物中最先是在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的[2]，后續(xù)的研究表明它們在革蘭氏陽性菌中也普遍存在[3]，此后也有研究發(fā)現(xiàn)其在病毒致病過程中的作用和機制。目前，關(guān)于EVs與真菌感染關(guān)系的研究甚少，本綜述將介紹EVs在真菌中的相關(guān)研究進展。

1 真菌細胞外囊泡的概述

在真核細胞中，EVs共分為四種類型：第一種稱為凋亡小體，它是胞膜皺縮內(nèi)陷形成的泡狀小體，其大小在1 000～5 000 nm；第二種稱為細胞微泡，它是由細胞膜上出芽后向外分泌而成，其大小為100～1 000 nm；第三種稱為膜粒子，它是由上皮細胞分泌的特有的囊泡物質(zhì)，其大小為50～80 nm；第四種稱為外泌體，它是細胞早期內(nèi)腔內(nèi)陷和向內(nèi)發(fā)芽而形成的囊泡，后與細胞膜融合釋放出細胞的膜性囊泡，其大小為40～100 nm[4]?，F(xiàn)有文獻中提到的EVs均沒有嚴格區(qū)分真菌中的凋亡小體、細胞微泡以及外泌體，統(tǒng)稱為細胞外囊泡。EVs內(nèi)部或表面上攜帶各種蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、毒素、色素和其他分子[5]。

與其他原核微生物不同，真菌EVs在大分子的跨細胞壁分泌中起到重要作用，它能夠保護內(nèi)部成分免受跨細胞壁過程中的降解并確保其有效濃度。但目前沒有明確的機制闡明EVs是如何穿過真菌細胞壁進入外部環(huán)境中，只有三種假說：一是在細胞膜和細胞壁之間聚集的EVs會產(chǎn)生膨脹壓力，從而迫使EVs穿過細胞壁，在這種情況下，EVs的大小將由細胞壁的孔徑大小或細胞壁的厚度決定；二是由EVs相關(guān)的降解酶及合成酶介導的細胞壁重塑，使得EVs穿過細胞壁進入外部環(huán)境；三是涉及細胞壁的跨蛋白質(zhì)通道，可以促進EVs的通過，這一過程可能需要能量參與[6-7]。

2 不同真菌細胞外囊泡的生物學特性

2.1 隱球菌屬

新生隱球菌是第一種分離出EVs的真菌，EVs中攜帶了蛋白、脂類、RNA和許多毒力因子包括莢膜抗原、葡萄糖醛酸氧甘露聚糖(GXM)、漆酶等[8]。脂質(zhì)分析顯示，新生隱球菌EVs中除了包括葡萄糖神經(jīng)酰胺和麥角固醇外，還存在磷脂酰膽堿和其他磷脂[9]。另兩項關(guān)于新生隱球菌蛋白質(zhì)組學的研究分別發(fā)現(xiàn)了其EVs中有92種和202種蛋白，其中包括了具有細胞毒性以及應對氧化應激功能的蛋白質(zhì)[10]。EVs中也存在著不同類型的RNA，主要包括miRNA、非編碼RNA(ncRNA)以及mRNA[11]。

有研究表明新生隱球菌EVs能夠穿過細胞壁進入莢膜是在細胞壁重塑酶介導下，敲除幾丁質(zhì)主要合成酶基因CHS3或者次要合成酶基因CHS2、CHS6以及CHS7，在很大程度上會減少EVs的釋放以及細胞外GXM的含量。相反，如果敲除基因CHS4或者CHS5則可以增加EVs的產(chǎn)生。CHS相關(guān)基因的敲除對EVs釋放產(chǎn)生的不同影響提示真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)會直接影響到EVs的生物學特性[12]。EVs中的GXM對巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞具有免疫抑制作用，有研究表明，因為Fas/FasL通路的激活，GXM在體內(nèi)外均表現(xiàn)出對巨噬細胞的細胞毒功能。同時，又有研究證實了在體外實驗中新生隱球菌EVs刺激的巨噬細胞會產(chǎn)生相關(guān)的細胞因子包括TNF-α和NO，而這些因子的產(chǎn)生會增加巨噬細胞吞噬和殺死真菌細胞的能力，這些研究表明新生隱球菌產(chǎn)生的EVs對真菌致病產(chǎn)生了正調(diào)控和負調(diào)控的雙功能[13-14]。

格特隱球菌同樣可以釋放EVs以調(diào)節(jié)巨噬細胞反應，它們通過釋放EVs向鄰近的真菌細胞發(fā)出信號，使其在巨噬細胞內(nèi)迅速增殖，而EVs這種提高格特隱球菌細胞增殖速率的能力則取決于其內(nèi)部的特異性蛋白及RNA[15]。

2.2 念珠菌屬

白念珠菌是最常見的人類共生真菌，其主要定植于健康個體的胃腸道、口腔和陰道黏膜。在免疫抑制個體中，白念珠菌則會成為機會致病菌引起一系列疾病，從淺表的黏膜感染到危及生命的全身感染。大多數(shù)情況下，白念珠菌是以酵母相和菌絲體的形式存在，而關(guān)于白念珠菌EVs的研究大多集中在酵母相上[16]。白念珠菌EVs蛋白質(zhì)組學研究將EVs中發(fā)現(xiàn)的75種蛋白質(zhì)分為9個功能組，其中最多的是與細胞壁相關(guān)的蛋白質(zhì)，占41%[17]。研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌EVs中的脂質(zhì)成分基本與新生隱球菌中的相似，包括磷脂酰絲氨酸、葡萄糖基神經(jīng)酰胺和麥角固醇。白念珠菌EVs中同樣有和新生隱球菌類似的miRNA、ncRNA和mRNA[18]。

研究表明磷脂酰絲氨酸在免疫細胞的激活過程中起到重要作用，敲除磷脂酰絲氨酸合酶基因CHO的白念珠菌EVs不能夠激活巨噬細胞BMDM和J774.14中NF-κB[19]。研究數(shù)據(jù)表明，白念珠菌EVs具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以促進先天性免疫反應的激活，其EVs可以刺激巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO和IL-12，并且降低IL-10和TGF-β；同時也可以刺激巨噬細胞BMDM產(chǎn)生NO、IL-12及TNF-α[20]。由于白念珠菌EVs中存在有特定的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白Hgt1p，所以與其他真菌EVs相比，白念珠菌產(chǎn)生的EVs在人血清中能夠更穩(wěn)定存在，原因是該轉(zhuǎn)運蛋白與補體因子H相結(jié)合，從而逃避補體替代途徑的活化[19]。

KARKOWSKA-KULETA等[21]在2020年首次分離出了光滑念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌中的EVs，通過納米顆粒跟蹤分析及透射電鏡分析，發(fā)現(xiàn)其大小與白念珠菌EVs相似，多為50～100 nm及200 nm以上。質(zhì)譜結(jié)果顯示這些念珠菌EVs存在大量有關(guān)真菌細胞壁構(gòu)建、重塑及完整性的蛋白，3種念珠菌EVs中均存在細胞壁葡聚糖酶(包括Eng1、Exg1、Xog1、Bgl2和Scw4)，這些酶的活性與EVs穿過細胞壁到達外部環(huán)境相關(guān)，同時在表面多糖的重塑過程中發(fā)揮作用，使得真菌能夠通過干擾受體識別影響其與宿主免疫細胞的相互作用。

2.3 其他真菌

副球孢子菌病是一種系統(tǒng)性肉芽腫性真菌病，多見于拉丁美洲地區(qū)，該病由巴西副球孢子菌引起，它是一種雙相型真菌[22]，通過電子顯微鏡分析顯示EVs大多為20～200 nm。其EVs中鑒定出了具有免疫原性的α-Gal抗原決定簇，在酶聯(lián)免疫吸附測定中，含有α-Gal表位的巴西副球孢子菌EVs與副球菌類真菌病患者分離的抗α-Gal抗體以及MOA(識別末端α-Gal的凝聚素)發(fā)生特異性反應，用半乳糖苷酶處理后反應被抑制[23]。有研究表明，巴西副球孢子菌可以誘導小鼠巨噬細胞產(chǎn)生促炎分子從而調(diào)節(jié)宿主免疫[24]。

馬拉色菌是人類皮膚菌群中的主要共生真菌，與特應性皮炎等皮膚病有一定關(guān)系。Gehrmann等[25]證實了馬拉色菌會釋放具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞外囊泡，這些EVs在PBMC(peripheral blood mononuclear cells,外周血單核細胞)中可以誘導IL-4和TNF-α應答，與健康對照組相比，特應性皮炎患者IL-4的產(chǎn)生明顯更高。

莢膜組織胞漿菌是一種雙相型真菌，多為一過性感染，但在免疫缺陷或低下的患者中可引起播散性組織胞漿病，預后兇險。研究表明，莢膜組織胞漿菌可以利用EVs的分泌機制運輸毒力因子，并且其EVs與組織胞漿病患者的血清可以發(fā)生免疫反應，證明EVs成分與發(fā)病機理相關(guān)[26]。

3 真菌細胞外囊泡的提取

細胞外囊泡的富集和分離對于其后續(xù)的成分和功能研究非常重要，基于外泌體的尺寸、密度和免疫表型發(fā)展出了多種提取方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜及免疫親和法等[27]。由于目前真菌EVs的研究還處于初步階段，所以其分離方法比較單一，最常用的分離真菌EVs的方法為超速離心法，將培養(yǎng)48 h的真菌上清液進行連續(xù)離心，首先低速離心去除細胞以及碎片，后高速離心去除大直徑的囊泡。接著將上清液通過0.4～0.8 μm的碳聚酸脂膜過濾器后進行20倍濃縮，最后再使用更高速離心沉淀真菌EVs[28-29]。但這種傳統(tǒng)的分離方法耗時久，并且產(chǎn)量很低，最主要的問題是這種方法是從液態(tài)培養(yǎng)基中分離得到的EVs，但生理狀態(tài)下EVs并不是在液體基質(zhì)中產(chǎn)生的，所以為了更好地模擬生理狀態(tài)下EVs的生物學特性， REIS等[30]以格特隱球菌為模型，研究出一種從固體培養(yǎng)基中快速可靠分離出真菌EVs的新方法。將一定濁度的格特隱球菌懸浮液均勻接種于YPD固體培養(yǎng)基中，使得真菌EVs受平板尺寸的限制在生長區(qū)域中形成密度相對較高的囊泡，培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)收集真菌細胞于PBS中制備成緩沖液，最后進行差速離心初步去除細胞和碎片，將所得上清液通過0.45 μm的脂膜過濾，最后高速離心獲得EVs的沉淀。

4 展 望

目前，真菌細胞外囊泡的研究依舊處于起步階段，得益于哺乳動物體系外泌體研究方法的快速發(fā)展，真菌EVs的分離方法也在不斷改進。但真菌EVs特定生物標志物的缺乏阻礙了其進一步亞型的分類，在此后的研究中，真菌EVs可以根據(jù)ISEV的建議進行表面標記分類(CD63+、CD81-等)，而不是簡單的大小分類。真菌EVs是免疫反應調(diào)節(jié)中的重要因素，其內(nèi)部分子的多樣性導致了不同的免疫應答，在某些情況下，EVs作用于免疫系統(tǒng)對宿主有益，而其他情況時，EVs又支持疾病的發(fā)生發(fā)展，這種差異可能取決于病原體本身及其EVs，為了進一步闡明這種機制，有必要進行更深入的研究。真菌EVs成分雖復雜，但是它們影響真菌與宿主細胞的相互作用表明，其在提供新的抗真菌感染策略中具有巨大的潛力；真菌細胞外囊泡包括很多具有免疫原性的蛋白質(zhì)和糖類，這也為其作為診斷標志物和疫苗研究提供了新思路。真菌EVs的結(jié)構(gòu)與實驗室被工程化的脂質(zhì)體相似，在脂質(zhì)體中攜帶病原相關(guān)分子模式PAMP(pathogen-associated molecular patterns)或損傷相關(guān)分子模式DAMP(damage associated molecular patterns)后可以促進佐劑樣特性，結(jié)構(gòu)相似的真菌EVs同樣可以發(fā)揮脂質(zhì)體的作用，為白細胞提供真菌PAMP，并可能促進CD4亞群的分化，證實了其作為疫苗的潛力。目前已有針對白念珠菌外泌體疫苗的研究，但其免疫反應性和毒性還需要進一步的證實。