任穎慧 曹魯娜 趙蕊蕊 武 玲

藥品微生物限度檢查是保證用藥的有效性、保障藥品安全性的重要措施[1]。我國開展藥品微生物污染檢查工作始于1972年[2]，《中華人民共和國藥典》2005年版初次提出微生物限度檢查方法驗(yàn)證，2015年版將方法驗(yàn)證修訂為方法適用性，形成了較為完善的藥品微生物控制標(biāo)準(zhǔn)體系，基本與美國藥典（USP）等國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）方案接軌，實(shí)現(xiàn)了微生物限度檢查由最終產(chǎn)品檢驗(yàn)向過程控制的改變。方法適用性將試驗(yàn)條件、供試品等因素作為一個(gè)整體系統(tǒng)來評(píng)價(jià)，更具科學(xué)性[3-5]。由于我國方法適用性工作開展時(shí)間較短，加之在前版藥典規(guī)定的方法驗(yàn)證基礎(chǔ)上有大幅度修訂，有些實(shí)驗(yàn)室在開展該項(xiàng)工作時(shí)對(duì)新版藥典要求理解不夠透徹、檢驗(yàn)?zāi)芰Σ蛔恪⒔⒌奈⑸锵薅葯z查方法不夠規(guī)范，與標(biāo)準(zhǔn)要求還存在一定的差距。本文以筆者所在實(shí)驗(yàn)室2020年1月至2021年10月收集的541份藥品生產(chǎn)企業(yè)提供的方法適用性資料為樣本，對(duì)照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105、1106和1107有關(guān)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法的要求[6]，逐份審核企業(yè)提供的方法適用性資料，針對(duì)審核資料時(shí)發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行分類整理，結(jié)合筆者實(shí)際工作，分析其問題來源并針對(duì)性提出正確的解決方案，為推動(dòng)企業(yè)規(guī)范開展方法適用性試驗(yàn)提供參考。

1 存在的問題及分析探討

1.1 微生物計(jì)數(shù)法存在的問題

微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)[6]。方法適用性資料中出現(xiàn)問題較多的是稀釋液的使用、試驗(yàn)菌的使用、試驗(yàn)菌株的回收試驗(yàn)、抑菌活性去除等方面。

1.1.1 稀釋液的使用 供試品的處理是獲得良好檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)[7]。對(duì)于水溶性供試品，供試液制備時(shí)藥典規(guī)定可以選用的稀釋液有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH7.2磷酸鹽緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3種，有的企業(yè)試驗(yàn)記錄中照抄照搬藥典內(nèi)容，將3種稀釋液羅列。正確的操作建議：每次試驗(yàn)應(yīng)據(jù)實(shí)寫明具體使用的是哪種稀釋液，同時(shí)應(yīng)明確標(biāo)注取用量，而不能用“取適量”描述。

1.1.2 試驗(yàn)菌的使用 《中華人民共和國藥典》2020年版四部對(duì)試驗(yàn)菌共有3個(gè)要求：1）試驗(yàn)菌株傳代次數(shù)不能超過5代，且應(yīng)使用新鮮培養(yǎng)物（黑曲霉除外）；2）所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%；3）加入試驗(yàn)菌液后使每毫升供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100 cfu[6]。要同時(shí)滿足這3個(gè)要求，在制備菌液時(shí)應(yīng)充分考慮。有的企業(yè)將試驗(yàn)菌液制成每毫升含菌量不大于100 cfu的菌懸液，采用平皿法制備試驗(yàn)菌液時(shí)取1∶10供試液10 ml，加入1 ml上述菌懸液。這樣以來，所加菌液體積超過了供試液體積的1%，相當(dāng)于試驗(yàn)菌液對(duì)供試液進(jìn)行了稀釋，增加了計(jì)數(shù)結(jié)果誤差，降低了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。有的企業(yè)取供試品10 g，加入稀釋劑至100 ml，制成1∶10供試液，試驗(yàn)組直接取上述100 ml供試液加入不大于100 cfu的菌懸液1 ml，滿足了所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%，但每毫升供試液含菌量不大于1 cfu，以上兩種操作菌懸液含菌量過低易引入操作誤差，同時(shí)菌落數(shù)分布的不均勻可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)菌無法順利回收。第2種方法更是造成了培養(yǎng)基的大量浪費(fèi)，因?yàn)橹苽涞脑囼?yàn)組混勻后僅需分注2個(gè)平皿（1 ml/皿）進(jìn)行微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

正確的操作建議：取不超過5代的藥典規(guī)定的5種試驗(yàn)菌株，制備成含菌量為103～104cfu/ml的菌懸液或孢子懸液，以平皿法為例，應(yīng)取供試液9.9 ml，加入0.1 ml試驗(yàn)菌懸液[8]，同時(shí)滿足了規(guī)定的3個(gè)條件，而且這種操作簡單便捷，避免了培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌懸液的浪費(fèi)。采用薄膜過濾法時(shí)，每張濾膜每次沖洗量一般為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1 ml含菌量不大于100 cfu的菌懸液，即可滿足藥典要求。

1.1.3 試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn) 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)菌株有5種，包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，其中白色念珠菌和黑曲霉既用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)，同時(shí)用于霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)，只是所用的培養(yǎng)基不同。資料審核中，有一家企業(yè)未對(duì)黑曲霉進(jìn)行回收試驗(yàn)。如果操作不當(dāng)，黑曲霉容易對(duì)試驗(yàn)環(huán)境造成污染；試驗(yàn)人員防護(hù)不當(dāng)，黑曲霉有可能對(duì)人員造成傷害[9-10]。但這些危險(xiǎn)因素可以通過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程防范，不能成為規(guī)避標(biāo)準(zhǔn)要求的借口。

微生物限度檢查是檢測(cè)活的微生物，其自身處于生長、繁殖和死亡的生物代謝狀態(tài)。與化學(xué)對(duì)照品含量穩(wěn)定不同，試驗(yàn)菌液的含菌量不是固定的，因此，每一次使用時(shí)都要進(jìn)行預(yù)計(jì)數(shù)，在試驗(yàn)時(shí)應(yīng)進(jìn)行同步準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

1.1.4 抑菌活性的去除 方法適用性的目的是建立對(duì)樣品影響更小、操作效率更高的方法[11]，存在工作量大、重復(fù)勞動(dòng)過多的問題[12]，抑菌活性的去除是微生物限度檢查工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)[13]。541份方法適用性資料中，采用平皿傾注法（1∶10）的有301份；其他240份均采用了增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、使用中和劑、薄膜過濾法，以及上述方法的聯(lián)合應(yīng)用等去除抑菌活性。有的企業(yè)去除樣品抑菌活性時(shí)采用增加稀釋液體積（平皿傾注法1∶100供試液）進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，在滿足藥典要求的情況下，繼續(xù)采用薄膜過濾法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果薄膜過濾法的試驗(yàn)結(jié)果與平皿法相差無幾，最后確定的方法是平皿傾注法（1∶100）。筆者認(rèn)為這種雙重試驗(yàn)不可取。通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)設(shè)計(jì)得出有效結(jié)論后，應(yīng)及時(shí)予以確認(rèn)，無須重新開展試驗(yàn)，重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)人力物力都是極大的浪費(fèi)。這在一定程度上表明檢驗(yàn)人員對(duì)藥典要求理解不充分。

有的企業(yè)在重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，直接選用高稀釋級(jí)供試液、薄膜過濾法或添加中和劑等方法進(jìn)行抑菌活性的去除。筆者認(rèn)為每一次方法適用性試驗(yàn)都應(yīng)該做到全面、完整，為了減少檢驗(yàn)工作量，提高工作效率，可以借鑒以往工作經(jīng)驗(yàn)和按照前版藥典要求建立的方法適用性資料，選用回收比值低于0.5的菌株作為敏感菌株開展預(yù)試驗(yàn)，當(dāng)預(yù)試驗(yàn)符合藥典要求后再進(jìn)行正式試驗(yàn)，而不宜直接略過。

正確的操作建議：設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)應(yīng)遵循由簡到繁，由單一到聯(lián)合的原則，采取循序漸進(jìn)的方式逐步開展。一般選擇平皿法最低稀釋級(jí)進(jìn)行初篩，當(dāng)回收比值符合要求時(shí)，即可對(duì)方法進(jìn)行確認(rèn)。當(dāng)任一回收比值不在0.5～2范圍時(shí)，表明樣品對(duì)試驗(yàn)菌株有一定的抑菌活性，可采取適宜的方法去除樣品抑菌活性重新開展試驗(yàn)。對(duì)于采取多種方法均無法去除抑菌活性的樣品，表明樣品不易被該類微生物污染，應(yīng)結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估采用回收比值最為接近的方法[11]。

1.1.5 對(duì)照試驗(yàn)的開展 使用中和劑時(shí)，應(yīng)確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性，中和劑對(duì)照組回收比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)[6]；在12份使用中和劑去除樣品抑菌活性資料中，僅有1份設(shè)計(jì)了中和劑對(duì)照組試驗(yàn)。

開展方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行陰性空白對(duì)照試驗(yàn)，用于監(jiān)測(cè)試驗(yàn)過程中是否引入二次污染、試驗(yàn)條件是否滿足藥典要求，確保選定的方法具有良好的系統(tǒng)適用性，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。一旦陰性空白對(duì)照試驗(yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，表明本次試驗(yàn)結(jié)果無效，需要立刻啟動(dòng)OOS調(diào)查找出污染環(huán)節(jié)并采取糾正措施后重新進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 控制菌檢查法存在的問題

控制菌檢查用于在規(guī)定的條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物[6]。出現(xiàn)問題較多是加菌方式以及耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的問題。

1.2.1 加菌方式的問題 控制菌檢查是將供試液和試驗(yàn)菌液分別加入培養(yǎng)基，不需將試驗(yàn)菌液加入供試液混勻后加入培養(yǎng)基。有的企業(yè)混淆了現(xiàn)行版藥典中的微生物計(jì)數(shù)和控制菌檢查加菌方式，直接將試驗(yàn)菌液加入供試液混勻后再加入培養(yǎng)基。

1.2.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的問題

1.2.2.1 試驗(yàn)菌的使用 耐膽鹽革蘭陰性菌泛指能夠在結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基中生長的微生物，腸桿菌科的細(xì)菌、產(chǎn)氣單胞菌屬和假單胞菌屬屬于這一類[14]。確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌，有的企業(yè)單獨(dú)使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，不符合藥典要求。

1.2.2.2 不能準(zhǔn)確區(qū)分定性或定量檢查 如某樣品為含藥材原粉的固體口服制劑，按照《中華人民共和國藥典》四部通則1107規(guī)定耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)進(jìn)行定量檢查，標(biāo)準(zhǔn)要求是“小于102cfu/g”，但企業(yè)提供的資料進(jìn)行了定性檢查。通則1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)藥品的給藥途徑及特性等制訂，凡規(guī)定“不得檢出”的應(yīng)進(jìn)行定性檢查，凡規(guī)定“小于……”的應(yīng)進(jìn)行定量檢查。

1.2.2.3 預(yù)培養(yǎng)用供試液體積過少 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查時(shí)，應(yīng)首先對(duì)1∶10供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。藥典對(duì)預(yù)培養(yǎng)的供試液體積沒有明確要求，有的企業(yè)取1∶10供試液1 ml進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的目的是使供試液中的微生物得以恢復(fù)，取樣量應(yīng)對(duì)樣品具有一定代表性，供試液過少對(duì)供試品的代表性較差，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。正確操作建議：在進(jìn)行試驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)，要為該項(xiàng)目預(yù)留不少于10 ml的1∶10的供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后取預(yù)培養(yǎng)物1 ml進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2.4 加入菌液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng) 該項(xiàng)檢查是為了使供試品的受損細(xì)菌充分恢復(fù)但不繁殖，需要對(duì)1∶10供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（約2 h）。此時(shí)，不能將試驗(yàn)菌液加入1∶10供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，適宜的培養(yǎng)條件會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)菌株快速繁殖，可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 其他問題

1份資料中提出回收率應(yīng)高于70%，為《中華人民共和國藥典》2010年版藥典要求，表明企業(yè)在進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)沒有對(duì)現(xiàn)行版藥典進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)習(xí)和理解，只是簡單抄寫上版方法適用性材料；有4家企業(yè)提供的方法適用性資料沒有單位公章，無從確認(rèn)資料的有效性和可靠性；有2家企業(yè)提供的資料是企業(yè)所在地省級(jí)藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方法適用性資料，表明企業(yè)在委托檢驗(yàn)完成后，沒有進(jìn)行方法的轉(zhuǎn)移和確認(rèn)；541份資料中，有109份使用“常規(guī)法”“稀釋法”等新版藥典未收載的方法術(shù)語進(jìn)行描述。

2 改進(jìn)建議

2.1 提高檢驗(yàn)人員檢驗(yàn)?zāi)芰?/h3>

綜上所述，可以看出大部分問題的出現(xiàn)源于對(duì)現(xiàn)行版藥典要求理解不透徹，主要問題源于檢驗(yàn)人員專業(yè)能力不足。通過對(duì)轄區(qū)內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)的調(diào)研，得知在小型藥品生產(chǎn)企業(yè)中很少單獨(dú)設(shè)置微生物檢驗(yàn)人員崗位，大部分都是從事理化項(xiàng)目檢驗(yàn)的人員兼崗開展工作。微生物常規(guī)檢驗(yàn)主要靠人工操作，不涉及大型自動(dòng)化精密儀器，基本操作容易掌握，在企業(yè)中普遍對(duì)其重視不夠，實(shí)際上該項(xiàng)目易學(xué)難精。企業(yè)提供的培訓(xùn)機(jī)會(huì)少，同時(shí)檢驗(yàn)人員自身對(duì)提升檢驗(yàn)技術(shù)的主動(dòng)性差，導(dǎo)致對(duì)微生物限度檢查積累經(jīng)驗(yàn)少，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)理解不透徹、不充分。因此，企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)微生物檢驗(yàn)人員的培養(yǎng)，組織集中培訓(xùn)學(xué)習(xí)理論知識(shí)，不定期開展實(shí)際操作的考核。在條件允許的情況下，建議派遣技術(shù)骨干到本級(jí)或上級(jí)藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)習(xí)，學(xué)成后在企業(yè)內(nèi)部實(shí)施“傳幫帶”，切實(shí)掌握好微生物限度檢查操作技術(shù)，建立起一支過硬的微生物檢驗(yàn)隊(duì)伍。

《中華人民共和國藥典》2020年版自2020年12月30日實(shí)施以來，至今已過一年，中藥制劑、化學(xué)藥品的微生物計(jì)數(shù)、控制菌檢查等基本沿用了2015年版的有關(guān)規(guī)定。微生物檢驗(yàn)工作者要積極參加中國食品藥品檢定研究院組織的現(xiàn)行版藥典微生物限度檢查的線上線下培訓(xùn)班，還應(yīng)加強(qiáng)自學(xué)，提升自身檢驗(yàn)技術(shù)，為保障藥品質(zhì)量安全把好關(guān)。

2.2 增加檢驗(yàn)工具書的配備

有些問題在《中國藥品標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》中描述較為詳細(xì)，比如微生物計(jì)數(shù)中的供試液制備有舉例說明，但企業(yè)尤其是小型藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)品種較少，涉及的檢驗(yàn)項(xiàng)目少，對(duì)工具書的投入可能欠缺。企業(yè)可向當(dāng)?shù)厮帣z機(jī)構(gòu)借閱有關(guān)資料，各級(jí)藥檢機(jī)構(gòu)也應(yīng)主動(dòng)為轄區(qū)內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)提供技術(shù)支持和技術(shù)咨詢，共同致力于藥品質(zhì)量的提高。

2.3 準(zhǔn)確把握微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于具體品種的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)結(jié)合制劑通則項(xiàng)下和通則1107規(guī)定確定。如橡膠膏劑在通則1107中有需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)限度要求，但在通則橡膠膏劑項(xiàng)下則只有對(duì)控制菌的要求：不得檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。對(duì)于方法適用性資料中沒有明確標(biāo)準(zhǔn)要求但檢出結(jié)果超出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的，在沒有公開處方來源及制法的前提下，藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)一定要和藥品生產(chǎn)企業(yè)聯(lián)系確認(rèn)是否含有神曲等發(fā)酵原料、是否含有未經(jīng)提取的動(dòng)植物來源的成分及礦物質(zhì)等特殊情況，防止漏檢項(xiàng)目、標(biāo)準(zhǔn)要求出現(xiàn)錯(cuò)誤等檢驗(yàn)差錯(cuò)事故的發(fā)生。建議藥品生產(chǎn)企業(yè)在處方及制法保密的前提下，方法適用性資料中除了記錄試驗(yàn)結(jié)果外，還應(yīng)明確標(biāo)注限度要求。

2.4 方法適用性試驗(yàn)周期

企業(yè)一般將周期確定為5年，與藥典換版周期一致。541份資料中，中成藥517份，占95.6%。中藥制劑成分復(fù)雜，當(dāng)處方來源中的藥材產(chǎn)地、炮制方法、貯藏環(huán)境等發(fā)生變化時(shí)，企業(yè)應(yīng)重新開展方法適用性試驗(yàn)[15]。541份資料中，均為藥典換版同步進(jìn)行的方法適用性試驗(yàn)，未見因其他因素重新開展方法適用性試驗(yàn)的資料。

2.5 嚴(yán)格規(guī)范術(shù)語使用

自2015年版藥典起，僅收錄了平皿法、薄膜過濾法和MPN法，沒有常規(guī)法、稀釋法、中和法等描述，常規(guī)法一般指使用低稀釋級(jí)（1∶10供試液）進(jìn)行檢驗(yàn)，稀釋法指采用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積的方法來去除樣品抑菌活性，但業(yè)內(nèi)人士不會(huì)引起誤解。筆者建議使用現(xiàn)行版藥典收錄的方法術(shù)語進(jìn)行描述，對(duì)這些不規(guī)范卻大家又耳熟能詳?shù)摹扒靶g(shù)語”繼續(xù)使用是否合適，值得商榷。

3 小結(jié)

微生物計(jì)數(shù)法方法適用性中主要問題存在于稀釋液的使用、試驗(yàn)菌液的使用、試驗(yàn)菌株的回收試驗(yàn)、抑菌活性的去除、對(duì)照試驗(yàn)的開展等方面；控制菌檢查法方法適用性中主要問題存在于加菌方式以及耐膽鹽革蘭陰性菌檢查等方面。相關(guān)從業(yè)人員在開展方法適用性試驗(yàn)時(shí)應(yīng)讀懂學(xué)透《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105、1106、1107的具體要求，結(jié)合所在實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，制定準(zhǔn)確可行的操作規(guī)程，從“人、機(jī)、料、法、環(huán)、測(cè)”等6個(gè)方面達(dá)到有效控制各試驗(yàn)環(huán)節(jié)，切實(shí)掌握科學(xué)完整準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法，避免出現(xiàn)文中所述各類常見問題。

從資料審核中可以發(fā)現(xiàn)，大部分企業(yè)的方法適用性資料比較完整規(guī)范，有缺陷的資料占比較小。結(jié)合文中發(fā)現(xiàn)的問題，各藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)不斷完善和提高開展方法適用性試驗(yàn)的能力，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為人民群眾用藥安全有效提供保障。