尚勝捷，王 璨，陳云峰

武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

替諾福韋（tenofovir，PMPA）于1993年被發(fā)現(xiàn)具有抗核苷酸逆轉(zhuǎn)錄的作用，具有很好的抗病毒效果［1］，但是由于其使用過程中具有腎毒性等副反應(yīng)問題，基于此作為前藥，陸續(xù)開發(fā)了一些新的核苷類抗病毒藥物，吉利德公司開發(fā)的富馬酸丙酚替諾福韋（tenofovir alafenamide fumarate，TAF）和富馬酸替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）分別于2016年和2008年被FDA批準(zhǔn)用于治療乙肝（hepatitis B virus，HBV）和人類免疫缺陷病（human immunodeficiency virus，HIV），其在體內(nèi)通過代謝形成R-9-（2-磷酸甲氧基丙基）-腺 嘌 呤［R-9-（2-phosphonylmethoxypropyl）-adenine，PMPA］的前藥而發(fā)揮抗病毒作用，值得注意的是，它們的化學(xué)合成的核心中間體為PMPA［2］。另外，近期也有報(bào)道PMPA可直接用于治療嚴(yán)重急性呼吸征冠狀病毒感染［3-5］。鑒于PMPA在醫(yī)藥領(lǐng)域的重要性，其合成工藝備受關(guān)注。

1999年，吉利德公司首次報(bào)道了合成PMPA的商業(yè)路線［6］，總收率為13%，隨后經(jīng)過優(yōu)化，使總收率提高到24%（圖1）［7-8］。整條反應(yīng)路線是以腺嘌呤和碳酸丙烯酯為起始原料的，然而由于腺嘌呤分子上的6號位氮原子和9號位氮原子競爭，反應(yīng)的選擇性較差，最終導(dǎo)致目標(biāo)分子N9-（2-羥基丙基）腺嘌呤（5）產(chǎn)率降低。1990年，Proenc等［9-10］報(bào)道了以二氨基馬來腈（1）為起始原料，合成咪唑衍生物的方法，在此基礎(chǔ)上，2020年，Derstine等［11］報(bào)道了以1為起始原料合成5的非核苷路線，該條路線巧妙的避免了6號位氮原子和9號位氮原子的競爭，手型異丙醇骨架在合成咪唑環(huán)前被安裝到分子中，并且保留了手型結(jié)構(gòu)，這個(gè)方法為合成PMPA提供了新的選擇。同時(shí)，該方法也有較大的優(yōu)化空間，相關(guān)的產(chǎn)物后處理較為繁瑣不適于工業(yè)生產(chǎn)，可以對后處理進(jìn)行優(yōu)化，使其更適合工業(yè)化生產(chǎn)；另外，作者使用較為昂貴的三甲基溴硅烷（trimethylbromosilane，TMSBr）等試劑，可以通過優(yōu)化反應(yīng)條件，使用更為經(jīng)濟(jì)的試劑，有利于降低合成成本。

圖1 吉利德公司報(bào)道的替諾福韋合成路線Fig.1 PMPA synthesis route reported by Gilead

從5合成PMPA的方法也有較多報(bào)道。2010年，Brown等［12］使用叔丁醇鎂作為堿，將5烷基化（圖2式1）；在第一步過程中，烷基化可以在極性非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行，其中，N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、N-甲基吡咯烷酮（N-methylpyrrolidone，DMP）效果最好，但由于DMF存在游離的二甲胺，會(huì)導(dǎo)致一些二甲酰磷酰胺產(chǎn)生，故作者選用NMP作溶劑。在第二步合成過程中，作者使用路易斯酸催化亞磷酸二乙酯脫烷氧基，用三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMSCl）代替較昂貴的TMSBr；在此步驟中，并不需要分離出中間產(chǎn)物N9-［（2-羥甲基亞磷酸二乙酯）丙基］-腺嘌呤（8）。2016年，Riley等［13］使用甲基格式試劑和叔丁醇體系，將5烷基化（圖2式2）；在第一步烷基化過程中，由于叔丁醇鎂的價(jià)格過高，并且過量鎂離子與8絡(luò)合形成少量副產(chǎn)物，因此作者使用甲基格氏試劑代替叔丁醇鎂作為堿。作者并沒有對亞磷酸試劑進(jìn)行篩選，是因?yàn)镸g2+與8絡(luò)合，使得5更容易烷基化［14］。使用環(huán)己烷做為溶劑，更容易提純中間產(chǎn)物8。在第二步水解過程中，作者使用氫溴酸和醋酸體系做水解。綜上所述，因?yàn)闅滗逅岬亩拘院头磻?yīng)體系的除水難度，以及三甲基溴硅烷是一種較為昂貴的水解試劑，本文使用已經(jīng)報(bào)道過的TMSCl和溴化鈉（sodium bromide，NaBr）體系先把對甲苯磺酰基甲氧基亞膦酸二乙酯（9）水解［11］，再進(jìn)行5的烷基化，降低了反應(yīng)危險(xiǎn)和生產(chǎn)成本，適合工業(yè)生產(chǎn)。

圖2 替諾福韋的合成路線Fig.2 Synthesis route of PMPA

為了解決傳統(tǒng)合成工業(yè)遇到的問題和提供可供選擇的工藝合成路線，通過文獻(xiàn)對比，本文選擇1為起始原料，避免使用腺嘌呤來合成PMPA；另外，最后一步合成中使用更經(jīng)濟(jì)的堿和優(yōu)化反應(yīng)的后處理，進(jìn)一步控制合成成本。綜上所述，選擇以下合成方案（圖3）。

圖3 替諾福韋的合成方案Fig.3 Proposed synthesis scheme of PMPA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑及材料

1.1.1 主要化學(xué)儀器Varian 600 MHz以及400 MHz核磁共振儀（TMS做內(nèi)標(biāo)）；RY-1型熔點(diǎn)儀；FINNIGAN TRACE MS和BRUKER APEX IV FTMD質(zhì)譜儀；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.2 化學(xué)試劑二氨基馬來腈（純度≥98%，國藥試劑）；異丙醇胺（純度≥98%，優(yōu)索試劑）；氫氧化鋇（純度≥98%，天津大茂化工試劑）；醋酸甲脒（純度≥98%，麥克林試劑）；三甲基氯硅烷（純度≥99%，麥克林試劑）；叔丁醇鈉（純度≥98%，國藥試劑）；對甲苯磺酸?；籽趸鶃喠姿岫阴ィ兌取?8%，麥克林試劑）；氯化鎂（純度≥98%，國藥試劑）；N，N-二甲基甲酰胺（純度≥99%，天津富宇試劑）；乙腈（純度≥99%，天津富宇試劑）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 N-亞甲胺基-（2-氨基-1，2-二氰基乙烯基）乙酯（2）的合成稱取20 g原料1于250 mL的燒瓶中，加入80 mL的乙醇，常溫下攪拌5 h。再將25 mL原甲酸三乙酯一次性滴加進(jìn)反應(yīng)中。將126.5 mg的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）加入反應(yīng)中（注意此過程需要嚴(yán)格控制TFA的量，若滴加過量，則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物粘結(jié)而難以攪拌）。反應(yīng)在油浴鍋中加熱至40℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后，在20 min內(nèi)冷卻至室溫，繼續(xù)冷卻至反應(yīng)內(nèi)部溫度0℃。通過真空過濾分離固體，得到的固體在真空下干燥。反應(yīng)最終得到26.2 g淺灰色固體，產(chǎn)率為94.2%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.21（s，1H），4.05（s，2H），3.57（s，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ157.37，123.53，115.26，115.12，98.79，55.10。

1.2.2 N-（2-羥丙基）-4-氰基-5-氨基咪唑（4）的合成在250 mL的圓底燒瓶中加入14.4 mL異丙醇胺，用20 mL乙腈溶解，室溫下攪拌5 min。將20 g原料2溶解于140 mL乙腈中，并一次性加入反應(yīng)中，此時(shí)反應(yīng)液變?yōu)樯罴t色，用額外12 mL乙腈沖洗瓶壁上的殘留固體反應(yīng)2.5 h。原料2消耗完畢后，使用冰水浴將反應(yīng)混合物冷卻至0～5℃，加入30.4 g氫氧化鋇和72 mL蒸餾水。隨后將反應(yīng)加熱至40℃，反應(yīng)液變?yōu)樯钭厣?，反?yīng)1.5 h。反應(yīng)完全后，反應(yīng)混合物通過布氏漏斗過濾，在40℃下減壓脫去溶劑，產(chǎn)物以黑油狀液體留在燒瓶中。在黑油產(chǎn)物中添加氫氧化鋇的飽和800 mL乙醇溶液，常溫下攪拌過夜（約12 h）。抽濾反應(yīng)液除去鋇鹽沉淀，40℃下減壓脫去溶劑，得到的固體在真空下干燥，最終得到淺灰色固體產(chǎn)物18 g，產(chǎn)率81.4%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ7.11（s，1H），6.08（s，2H），5.06（d，J=4.9 Hz，1H），3.87～3.74（m，2H），3.68～3.58（m，1H），1.05（d，J=6.2 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ148.37，134.00，118.07，90.71，65.36，50.62，21.07。

1.2.3 N9-（2-羥基丙基）腺嘌呤（5）的合成在250 mL圓底燒瓶中加入27.8 g原料4和醋酸甲脒29.5 g，將混合物溶于100 mL的DMF中。加熱混合物至內(nèi)溫100℃，反應(yīng)過夜（約12 h）。反應(yīng)完全后，關(guān)閉加熱并加入異丙醇150 mL，將反應(yīng)液冷卻至室溫（25℃）。再將反應(yīng)液冷卻至-15℃的內(nèi)溫，在此溫度下攪拌3 h。過濾懸浮液，用80 mL冷的異丙醇洗滌固體，將分離出的固體置于真空烘箱中干燥2 h，最終得26.5 g白色固體產(chǎn)物5，產(chǎn)率82.0%，熔點(diǎn)228～235℃（文獻(xiàn)值：230℃）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.02（s，1H），7.99（s，1H），5.03（d，J=4.3 Hz，1H），4.09（d，J=9.3 Hz，1H），4.04～3.94（m，2H），1.06（d，J=5.6 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ157.17，149.03，145.75，141.39，124.15，65.20，50.86，21.26.ESI-MSm/z：194.3。

1.2.4 對甲苯磺?；籽趸鶃喠姿幔?）的合成稱取50 g對甲苯磺?；籽趸鶃喠姿岫阴ト芙庥?8 mL的乙腈中，加入40 g NaBr和42 g TMSCl，將混合物在60℃的油浴中加熱3 h。原料消耗完畢后，過濾鈉鹽，減壓脫去溶劑，殘留物用50 mL蒸餾水洗滌，加水過程中可以觀察到游離的白色固體，混合物常溫下攪拌過夜（約12 h）。得到的反應(yīng)液用正己烷洗滌，保留水相。得到的水相中加入50 mL的甲苯共沸干燥，最終得到無色或淡黃色的油狀產(chǎn)物39.0 g，其產(chǎn)率為94.4%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ7.37（m，J=16.5，7.8 Hz，2H），6.97～6.86（m，2H），3.28（m，J=53.8，14.4，8.3 Hz，3H），2.01（d，J=23.5 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ145.51，131.59，130.06，128.19，64.05（d，J=6.5 Hz），21.61。

1.2.5 替諾福韋（PMPA）的合成向500 mL三頸燒瓶中加入400 mL的DMF，并通過冰浴使溶液降溫至0℃，在此溫度下加入60 g叔丁醇鈉和6 g氯化鎂，此時(shí)溶液中有部分叔丁醇鈉未完全溶解。待溶液內(nèi)溫降至0℃時(shí)，一次性加入20 g原料5，攪拌10 min，期間反應(yīng)液溫度保持在5℃以下。在1 h內(nèi)分4次加入6（每次添加12 g），注意保持反應(yīng)液溫度不超過5℃，且不宜過快添加，避免溶液變得黏稠而攪拌困難。添加完畢后將反應(yīng)液升溫至室溫（約20℃），過夜反應(yīng)（約12 h）。原料被大部分消耗完畢后，停止反應(yīng)，減壓脫去溶劑，剩余固體用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2左右，期間有白色固體析出，使用冰浴將反應(yīng)液降溫至5℃以下。過濾白色固體，再用200 mL正己烷洗滌固體，得到的白色固體置于75℃下真空干燥。最終得到白色固體19.3 g，產(chǎn)率65.0%，熔點(diǎn)180～188℃（文獻(xiàn)值：180℃）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.21（s，2H），7.13（s，2H），4.16～4.08（m，1H），4.02～3.98（m，1H），3.87～3.83（m，1H），3.81～3.69（m，2H），1.08（s，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ130.63，128.54，128.26，125.98，65.08，50.62，34.43，21.58，21.24.ESI-MSm/z：288.1。

2 結(jié)果與討論

在合成2的過程中，使用原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯對最終產(chǎn)率影響不大，在兩種原料市場價(jià)格相差不大的情況下，選擇原甲酸三乙酯的原因在于反應(yīng)副產(chǎn)物是乙醇，在綠色化學(xué)的要求下，相比于甲醇，生產(chǎn)更為安全，也容易處理。

從2到4的合成過程中，中間產(chǎn)物（3）不需要經(jīng)過額外的分離，在不添加額外試劑的情況下，中間產(chǎn)物會(huì)緩慢成環(huán)生成4。加入額外的堿催化試劑（如碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鋇等）會(huì)使得成環(huán)速率加快。日本Soda公司［15］使用氫氧化鈉作為堿催化試劑，但是最終得到的產(chǎn)品聚合成黑油狀，難以分離并且不能直接用于合成下一步。1990年，Proenc等［9］報(bào)道使用氫氧化鋇作為堿催化劑，游離的鋇離子與產(chǎn)物絡(luò)合解聚，最終產(chǎn)品經(jīng)過減壓脫去溶劑呈淺灰色固體，后處理方式簡單且方便繼續(xù)做衍生化。采取此種方式，最終得到預(yù)期產(chǎn)品。

在合成5的過程中，溶劑應(yīng)該選擇極性非質(zhì)子高沸點(diǎn)溶劑，水的存在會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不佳，最終分離收率會(huì)降低，反應(yīng)溫度在80～120℃之間，過低的溫度也會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不佳，當(dāng)反應(yīng)內(nèi)溫高于120℃時(shí)，未能觀察到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化（結(jié)果如表1所示）。在后處理過程中，篩選了一些醇類溶劑，異丙醇表現(xiàn)出最好的分離效果。

表1 反應(yīng)溫度對分離收率的影響Tab.1 Effect of reaction temperature on isolation yield

在通過水解9合成6的過程中，通常使用路易斯酸作為水解試劑。Derstine等［11］報(bào)道使用TMSBr作為路易斯酸。2015年，Pizova等［16］報(bào)道了一種水解亞磷酸二乙酯的方法，作者使用TMSCl/NaBr體系水解。綜合考慮原料的價(jià)格，選擇TMSCl/NaBr水解體系，使得合成成本進(jìn)一步降低。值得注意的是，6的純度過低會(huì)影響5到PMPA的轉(zhuǎn)化。

在合成PMPA的過程中，首先篩選了溶劑，溶劑的選擇出于兩方面考慮：一方面體系中的質(zhì)子會(huì)消耗堿；另一方面，原料極性較大，小極性溶劑不能使原料有效溶解，從而導(dǎo)致5轉(zhuǎn)化降低。因此考慮使用極性非質(zhì)子溶劑，在此過程中嘗試篩選1，4-二氧六環(huán)、乙腈、正己烷、DMF、NMP，其中DMF和NMP表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)換效果（結(jié)果如表2所示）。堿的選擇是控制合成成本的關(guān)鍵因素之一，傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)使用較為昂貴的叔丁醇鎂，因此嘗試使用叔丁醇鈉，篩選了叔丁醇鈉的物質(zhì)的量作為對反應(yīng)的轉(zhuǎn)化影響因素，結(jié)果顯示，5-7倍物質(zhì)的量的叔丁醇鈉有最好的轉(zhuǎn)化效率，考慮到鎂離子與6絡(luò)合，會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化，因此采用叔丁醇鈉和氯化鎂共催化的方法，結(jié)果表明更有利于PMPA的轉(zhuǎn)化。溫度的控制也是保證轉(zhuǎn)化率的重要因素之一，在向反應(yīng)液中添加原料6的過程中，若溫度高于10℃，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液凝結(jié)而難以攪拌。另外，過快的滴加原料6，也會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液凝結(jié)，最好的添加原料6的方式是在保持低溫的前提下，緩慢滴加原料6的DMF溶液。

表2 反應(yīng)溶劑對分離收率的影響Tab.2 Effect of reaction solvent on isolation yield

3 結(jié)論

PMPA的傳統(tǒng)合成路線遇到的問題為：（1）以腺嘌呤為起始原料合成PMPA，在生成5過程中，不可避免的產(chǎn)生腺嘌呤上的N6-取代的烷基化副產(chǎn)物7。（2）從5到PMPA過程中，叔丁醇鎂及三甲基溴硅烷等試劑的使用增加了合成路線的成本。考慮到上述問題，提出以下解決思路：（1）設(shè)計(jì)一種非核苷合成路線，避免使用腺嘌呤作為合成PMPA的起始原料。（2）考慮使用更廉價(jià)的堿、路易斯酸、溶劑等原料，從而控制合成成本。在已有的合成方法的基礎(chǔ)上，本工作解決了傳統(tǒng)工藝路線問題，合成PMPA的總收率從24%提升到37%；簡化了后處理方式，同時(shí)使用更為經(jīng)濟(jì)的原料（如用叔丁醇鈉替代叔丁醇鎂、用TMSCl替代TMSBr等），進(jìn)一步控制合成成本，適合工業(yè)生產(chǎn)。