朱志文 陽亮芳 鄭楊 黃海麗 何惠娟

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科（廣東湛江 524001）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種高致命性的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，在肝臟原發(fā)性惡性腫瘤中約占10%～15%，發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞肝癌。近年來ICC發(fā)病率不斷攀升，根治性手術(shù)切除是ICC的唯一潛在治療方法［1］。ICC極易向膽管壁浸潤(rùn)并侵犯周圍肝組織，對(duì)于局部晚期或轉(zhuǎn)移性病灶的不可切除的患者，順鉑（DDP）聯(lián)合吉西他濱是當(dāng)前治療晚期ICC的一線療法［2-3］。但化療耐藥性在ICC治療中已越來越普遍，已成為ICC治療失敗的主要原因［2-3］，因此尋找ICC治療的分子靶點(diǎn)對(duì)降低耐藥率和提升治療效果至關(guān)重要。

周期蛋白依賴激酶抑制因子3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）位于染色質(zhì)14q22.22，所編碼的蛋白質(zhì)含有212個(gè)氨基酸殘基［4］。作為一種細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制劑，CDKN3能與CDK1/CDK2特異性結(jié)合并使其去磷酸化。其次，CDKN3可與MDM2和P53形成蛋白復(fù)合物，從而對(duì)P21產(chǎn)生抑制作用［5］。研究表明，CDKN3參與許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)等。目前，已在多種類型的癌癥中觀察到CDKN3表達(dá)增加，高水平的CDKN3與肺腺癌、食管鱗癌、胃癌和肝癌的預(yù)后不良密切相關(guān)［6-9］。最近的報(bào)告還顯示，CDKN3在促進(jìn)腫瘤化療耐藥中也具有潛在作用，高水平的CDKN3可導(dǎo)致食管鱗癌和結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)DDP治療不敏感［10-11］。然而，CDKN3在ICC進(jìn)展和化療敏感性中的作用尚未明確。

當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)CDKN3在ICC組織中呈高表達(dá)，CDKN3參與ICC的發(fā)生發(fā)展和化療敏感性，其生物學(xué)功能與細(xì)胞周期的異常調(diào)控密切相關(guān)，表明CDKN3可作為ICC的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)?？傊?，本研究結(jié)果以期為ICC的診斷、治療以及發(fā)病機(jī)制提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本收集 收集2018年10月至2021年12月在本院接受膽管癌根治手術(shù)患者的膽管癌組織及相應(yīng)的癌旁組織25例，所有病例均有完整且詳細(xì)的病歷資料，本研究得到廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（受理號(hào)：PJ2017066）［1］，并獲得每位患者及其家屬的知情同意。

1.1.2 細(xì)胞 人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810均購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)基、血清FBS購自Gibco；培養(yǎng)皿購自耐斯生命科技公司；Transwell小室購自立沃生物科技公司；PVDF膜購自Millipore；免疫組化試劑購自中杉金橋；裂解液RIPA購自碧云天；干擾和過表達(dá)質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因公司；順鉑購自MCE；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（C1052）購自碧云天。

1.1.4 抗體 CDKN3（PA550929）購自Invitrogen；CDC25C（4688S）購自CST；p-CDK1（Thr14）（2543S）購自CST；β-actin（8457S）購自CST。

1.1.5 儀器 Tanon5200曝光機(jī)、Leica顯微鏡、BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 IHC免疫組化實(shí)驗(yàn) 經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。實(shí)驗(yàn)前65℃烤片30 min，脫蠟、水化。檸檬酸鹽修復(fù)液經(jīng)微波爐高火抗原修復(fù)8 min，兩次。自然冷卻后，用內(nèi)源性過氧化物阻斷劑避光孵育30 min，甩干滴加一抗（CDKN3抗體濃度為1∶100），4℃過夜。次日洗去一抗，滴加二抗孵育50 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加DAB顯影劑，純水終止顯影。蘇木素染液孵育2 min后流水返藍(lán)5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。自然晾干后拍照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和DDP處理 HCCC-9810人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%Gibco胎牛血清和1%抗青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前一天，HCCC-9810細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板內(nèi)，次日待細(xì)胞生長(zhǎng)至孔板面積70%左右，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒、CDKN3敲低質(zhì)粒以及CDKN3過表達(dá)質(zhì)粒，Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。DDP處理時(shí)間為24 h，處理濃度為20 μmol/L。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 分析來自GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE26566數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含104例膽管癌組織和59例與之匹配的非癌性肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組信息。將GSE26566膽管癌樣本按CDKN3的中位表達(dá)量分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行 KEGG 富集分析和GO功能注釋。

1.2.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)根據(jù)制造商的要求，按照說明書的步驟完成后使用BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 對(duì)于克隆形成試驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染24 h的HCCC-9810細(xì)胞用胰酶消化，PBS清洗后接種在6孔板中，每孔500個(gè)細(xì)胞，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，用PBS輕輕清洗平板，多聚甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色1 h，隨后流水沖洗，自然晾干后拍照。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染24 h并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，各組細(xì)胞消化后接種于6孔板內(nèi)，待24 h細(xì)胞鋪滿后用200 μL槍頭豎直劃痕，用PBS沖洗劃下的細(xì)胞，換液后拍照。在培養(yǎng)48 h時(shí)繼續(xù)拍照，用Image J軟件計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.7 Westernblot免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB） 收集細(xì)胞，用配制好的RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后配平，煮沸使蛋白變性，按照40 μg上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后顯影，用Tanon5200系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Graphpad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和做圖，數(shù)據(jù)以（±s）表示。兩組間均值比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)以分析統(tǒng)計(jì)差異，Spearman相關(guān)性系數(shù)分析兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDKN3在膽管癌組織中呈高表達(dá) 首先分析了GSE26566數(shù)據(jù)集中正常組織和膽管癌組織的CDKN3的表達(dá)情況，并將收集的膽管癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色，數(shù)據(jù)集和免疫組化結(jié)果共同顯示，與周圍正常組織相比，膽管癌組織中的CDKN3表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖1A-B）。

圖1 CDKN3在ICC組織中被上調(diào)Fig.1 CDKN3 was upregulated in intrahepatic cholangiocarcinoma tissues

2.2 GO功能注釋和KEGG富集分析預(yù)測(cè)CDKN3在膽管癌中參與的途徑和生物學(xué)過程 將GSE26566的膽管癌樣本分為CDKN3低表達(dá)組和高表達(dá)組，進(jìn)行基因代謝和功能的富集分析，結(jié)果見圖2A-B。共挖掘出1 431個(gè)正相關(guān)基因和1 643個(gè)負(fù)相關(guān)基因，KEGG富集分析顯示這些基因參與細(xì)胞周期信號(hào)通路的調(diào)控，GO功能注釋顯示這些基因主要參與細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換和有絲分裂等過程。

圖2 CDKN3參與調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)化Fig.2 CDKN3 was involved in regulating drug metabolism and G2/M phase checkpoint

2.3 干擾CDKN3可通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯抑制ICC細(xì)胞增殖和遷移 根據(jù)KEGG和GO富集分析提示，CDKN3共表達(dá)基因參與細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換。為驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，首先通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式抑制細(xì)胞中CDKN3的表達(dá)，WB檢測(cè)質(zhì)粒感染效率（圖3A），通過克隆和劃痕和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默CDKN3后抑制了細(xì)胞增殖和遷移能力（P＜0.05，圖3B-C和表1［2］）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，si-CDKN3組的HCCC-9810細(xì)胞在G2/M期比例明顯增高（P ＜ 0.05，圖3D和表1［3］），相應(yīng)的G0/G1期細(xì)胞比例減少，而S期無明顯變化。為進(jìn)一步探究其中的分子機(jī)制，首先通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了CDKN3的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CDKN3可與G2/M期檢查點(diǎn)蛋白CDC25C直接相互作用（圖3E）。并且分析了GSE26566數(shù)據(jù)集中CDC25C的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)膽管癌組織中CDC25C的表達(dá)均明顯高于正常組織（P＜0.05，圖3F），隨后進(jìn)一步分析了CDKN3和CDC25C在膽管癌組織中的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間呈正相關(guān)（P＜0.05，圖3F）。在干擾CDKN3后，通過WB檢測(cè)G2/M期檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CDC25C表達(dá)被顯著降低，而CDK1低活性的磷酸化水平增加（P＜0.05，圖3G、表1）。以上結(jié)果均表明CDKN3通過影響膽管癌細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換，從而參與到膽管癌的發(fā)生發(fā)展中。

表1 轉(zhuǎn)染si-CDKN3對(duì)HCCC-9810細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響的影響Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

表1 轉(zhuǎn)染si-CDKN3對(duì)HCCC-9810細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響的影響Tab.1 Effect of transfection of si-CDKN3 on proliferation，migration，cell cycle and cyclin expression of HCCC-9810 cells ±s

注：si-NC組與si-CDKN3組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組si-NC si-CDKN3細(xì)胞周期（%）G0/G1 47.73±1.07 38.41±1.41**S 44.98±0.38 46.35±1.19 G2/M 7.28±1.39 15.24±0.34**細(xì)胞克隆數(shù)目（個(gè)）175.0±12.49 122.7±6.03**細(xì)胞遷移率（%）64.16±4.09 47.37±3.94**周期蛋白相對(duì)表達(dá)CDKN3 1.05±0.12 0.39±0.09**CDC25C 1.06±0.14 0.72±0.16*p-CDK1 0.69±0.13 1.02±0.08*

圖3 干擾CDKN3可通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯抑制ICC細(xì)胞增殖和遷移Fig.3 CDKN3 inhibition suppressd proliferation and migration of ICC cells by inducing G2/M arrest

2.4 CDKN3過表達(dá)降低膽管癌細(xì)胞對(duì)DDP治療的敏感性 細(xì)胞周期的異常調(diào)控在腫瘤細(xì)胞增殖和化療耐藥中發(fā)揮重要作用，推測(cè)CDKN3可能和膽管癌化療敏感性有密切聯(lián)系。通過克隆形成和劃痕等一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，DDP處理組的膽管癌細(xì)胞其增值和遷移能力與對(duì)照組相比顯著降低，但過表達(dá)CDKN3后，膽管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力得到了有效的挽救（P＜0.05，圖4A、4B和表2），證實(shí)了CDKN3能夠降低膽管癌細(xì)胞對(duì)DDP治療的敏感性。

圖4 CDKN3過表達(dá)可降低膽管癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性Fig.4 Overexpression CDKN3 reduced the sensitivity of cholangiocarcinoma cells to cisplatin

表2 CDKN3對(duì)DDP治療的影響Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

表2 CDKN3對(duì)DDP治療的影響Tab.2 Effect of CDKN3 on DDP treatment ±s

注：NC組與NC+DDP組比較，NC+DDP組與CDKN3+DDP組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組NC NC+DDP CDKN3+DDP細(xì)胞克隆數(shù)目（個(gè)）183.7±17.50 75.0±9.54**119.9±15.10*細(xì)胞遷移率（%）67.11±4.39 31.43±5.20**50.46±6.16**

3 討論

ICC是僅次于肝細(xì)胞肝癌的第二常見原發(fā)性肝惡性腫瘤。隨著外科手術(shù)的進(jìn)步，治療性切除已成為ICC最常見的治療方法，但由于2/3的腫瘤在診斷時(shí)已是局部晚期或轉(zhuǎn)移性病灶，因此很多不適合切除［12］。標(biāo)準(zhǔn)姑息性化療（吉西他濱和DDP）有利于ICC患者的總生存率，但中位生存期仍低于一年［3］。目前，導(dǎo)致ICC化療耐藥的分子機(jī)制尚未明確，因此，深入了解ICC增殖、遷移和化療耐藥的分子機(jī)制是當(dāng)前的迫切需要。

CDKN3是一種周期蛋白依賴激酶抑制蛋白，正常情況下CDKN3負(fù)責(zé)CDK1/CDK2去磷酸化。盡管CDKN3對(duì)CDK1/CDK2具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)調(diào)節(jié)因子，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3的異常高表達(dá)與多種癌癥的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)，包括宮頸癌、食管鱗癌和前列腺癌等，高水平的CDKN3可導(dǎo)致不良的臨床預(yù)后［7，13-14］。而在不同類型的癌癥中CDKN3發(fā)揮的作用也不盡相同，究其原因可能是CDKN3下游作用的靶點(diǎn)不同導(dǎo)致。此外，CDKN3還可作為一些MicroRNA的下游靶點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-181d-5p通過靶向CDKN3抑制AKT通路激活，從而發(fā)揮抑癌作用［15］。MiR-127-3p則通過下調(diào)CDKN3/E2F1軸的活性，抑制腎細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移［16］。然而，CDKN3在ICC中的作用目前未曾有過報(bào)道，因此探究CDKN3與ICC發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系，將有助于更深一步了解ICC發(fā)病的分子機(jī)制，進(jìn)而為ICC的臨床治療提供新思路。

在當(dāng)前研究中，通過GEO數(shù)據(jù)庫和免疫組化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CDKN3在ICC組織中的表達(dá)較癌旁組織顯著升高。為進(jìn)一步研究CDKN3在ICC中的生物學(xué)功能，首先進(jìn)行了KEGG和GO富集分析，兩者結(jié)果一致表明與細(xì)胞周期相關(guān)的生物過程和途徑是共表達(dá)基因富集程度最高的原因，CDKN3可能參與ICC細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)化。為驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)，用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式干擾ICC細(xì)胞中CDKN3的表達(dá)，通過克隆和劃痕一系列功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制CDKN3的表達(dá)可有效減弱ICC細(xì)胞增殖和遷移能力，同時(shí)，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，沉默CDKN3可顯著誘導(dǎo)G2/M期阻滯，這與富集分析預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。為進(jìn)一步探究CDKN3調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)化的分子途徑，通過CDKN3的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，CDKN3可與CDC25C直接相互作用，以及相關(guān)性分析顯示CDKN3和CDC25C在膽管癌組織中的表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)，我們推測(cè)CDKN3可能通過靶向CDC25C而發(fā)揮作用。后續(xù)的WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾CDKN3后CDC25C表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致CDK1去磷酸化激活減少而低活性的磷酸化水平增加。CDC25C是細(xì)胞周期G2/M期的重要檢查點(diǎn)蛋白，CDC25C作用于CDK1 Thr14和Tyr15殘基并使其去磷酸化，CDC25C介導(dǎo)的CDK1去磷酸化和CyclinB1/CDK1復(fù)合物入核是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂起始的關(guān)鍵機(jī)制［17-18］。當(dāng) CDC25C活性受到抑制時(shí)，CyclinB1/CDK1復(fù)合物的活性也會(huì)受到抑制，因此CDC25C在控制細(xì)胞周期方面起著至關(guān)重要的作用［17-18］。最近的一些研究顯示，通過下調(diào)CDC25C/CDK1/CyclinB1信號(hào)軸，可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期阻滯，抑制癌癥進(jìn)展［19-20］。因此，本研究結(jié)果得到了之前結(jié)論的有力支持。

越來越多的研究已表明，細(xì)胞周期的異常調(diào)控是腫瘤細(xì)胞化療耐藥的重要機(jī)制之一。有趣的是，ICC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染CDKN3過表達(dá)質(zhì)粒后，通過DDP治療發(fā)現(xiàn)，CDKN3過表達(dá)挽回了DDP對(duì)ICC細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制作用，CDKN3顯著降低了ICC細(xì)胞對(duì)DDP治療的敏感性。之前已有研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3能夠促進(jìn)食管癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥，抑制CDKN3后可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性［10-11］。最新的報(bào)告還指出，CDKN3通過調(diào)控LDHA依賴的代謝重編程，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞對(duì)DDP抵抗，而抑制CDKN3的表達(dá)對(duì)克服膀胱癌化療耐藥具有潛在作用［21］。以上發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究探索了CDKN3在ICC發(fā)展進(jìn)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，研究表明：CDKN3在ICC組織中高表達(dá)，與ICC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；CDKN3沉默可通過下調(diào)CDC25C/CDK1軸引起G2/M期阻滯，從而抑制ICC細(xì)胞增殖和遷移能力；CDKN3過表達(dá)可有效降低DDP治療的敏感性，這可能是ICC細(xì)胞化療耐藥的潛在機(jī)制?？傊@些結(jié)果提示CDKN3是治療ICC的一個(gè)很有希望的靶點(diǎn)。