劉付麗 周銓，2

1廣東醫(yī)科大學(xué)（廣東湛江 524000）；2佛山市第一人民醫(yī)院（廣東佛山 528000）

神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥（neuronal ceroid lipofuscinosis，NCL）是一組遺傳性神經(jīng)變性疾病［1］，為溶酶體沉積癥，具有特征性的腦部和其他組織細(xì)胞溶酶體內(nèi)自發(fā)熒光脂質(zhì)褐素沉積。其患病率為1/100 000 ～ 1/14 000［2］，主要發(fā)生在歐美國家及一些亞洲國家，中國較少報道。NCL根據(jù)臨床發(fā)病年齡分為4種類型，即嬰兒型、晚期嬰兒型、青少年型和成人型。根據(jù)基因型分類，分為16種類型，DNAJC5基因所致的類型為神經(jīng)蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥4型，屬于成人型神經(jīng)蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥（adult neuronal ceroid lipofuscinosis，ACLN），其遺傳模式為常染色體顯性遺傳［3］。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性視力喪失，共濟(jì)失調(diào)，難治性癲癇和精神運(yùn)動倒退［4］，顱腦MRI影像學(xué)檢查表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)及小腦萎縮。2011年，NOSKOVA等［5］在20個家族中篩選DNAJC5基因發(fā)現(xiàn)了c.344T＞G（p.Leu115Arg）錯義突變。本文報道由DNAJC5基因c.344T＞G（p.Leu115Arg）錯義突變所致的中國1個神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥家系，并對該家系患者的臨床表現(xiàn)、影像特點(diǎn)及基因突變特點(diǎn)進(jìn)行分析，目前國內(nèi)不尚未有DNAJC5基因錯義突變相關(guān)公開報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中家系為同胞姐弟，于2013-2020年先后在佛山市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診，詳細(xì)追問家系中其他成員的病史。先證者，男性，40歲，2020年10月因“發(fā)作性幻視、肢體抽搐5年”就診，體格檢查：神志清，簡單對答，雙側(cè)瞳孔等圓等大，對光反射靈敏，未見眼球震顫，四肢肌肉欠飽滿，四肢震顫，四肢肌力4級，肌張力正常，指鼻試驗雙側(cè)可疑陽性，雙側(cè)Babinski征陰性。個人史：足月順產(chǎn)，為第三胎，生長發(fā)育、智力運(yùn)動發(fā)育正常，否認(rèn)熱性驚厥史。家族史：先證者父親有癲癇病史，45歲去世。2009年8月先證者大姐發(fā)現(xiàn)有癲癇病史。

1.2 頭顱MRI掃描檢查 選用佛山市第一人民醫(yī)院高場強(qiáng)（3.0T）癲癇薄層（1 mm間隔）序列、以海馬長軸垂直的冠狀位的磁共振掃描進(jìn)行T1、T2、Flair以及三維容積采集等序列檢查。

1.3 基因測序

1.3.1 DNA提取 經(jīng)先證者及其家屬知情同意后，采集先證者、先證者妻子、先證者2位女兒、先證者母親、大姐及大姐小兒子的外周靜脈血各2 mL，分別加入ACD抗凝劑，送深圳安吉康爾醫(yī)學(xué)檢驗實驗室。通過外周血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA，將制備好的DNA用于文庫構(gòu)建、全外顯子測序、Sanger驗證。

1.3.2 全外顯子測序 選用Illumina Hiseq X Ten測序平臺獲得測序數(shù)據(jù)，篩選出變異位點(diǎn)，采用FastQC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾。以GRCh37參照基因組序列，使用BWA（Burrows Wheeler Alignment tool）等軟件進(jìn)行序列比對，運(yùn)用GATK等軟件檢測樣本變異信息注釋，對潛在致病變異進(jìn)一步做sanger測序分析其來源。

1.3.3 Sanger驗證 根據(jù)雙脫氧末端終止法，通過PCR擴(kuò)增得到足量的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用ABI 3730x1遺傳分析儀對擴(kuò)增純化后的產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳分析并收集熒光信號，經(jīng)Sequencing Analysis 5.2軟件分析，最終得到DNA的序列。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果 NO.II4先證者，男性，40歲，5年前（約35歲時）無明顯誘因出現(xiàn)幻視，表現(xiàn)為眼前出現(xiàn)七彩樣閃光點(diǎn)，隨之出現(xiàn)大片水波樣橫紋，持續(xù)1～2 min左右后出現(xiàn)雙眼黑朦、上腹部悶脹感，繼之出現(xiàn)意識不清、肢體抽搐，呈全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，持續(xù)4 min后癥狀緩解，未服藥治療?；颊呱鲜霭Y狀反復(fù)，幻視發(fā)作約2～3次/d，嚴(yán)重時伴四肢強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，約3～4次/月。2年前患者出現(xiàn)行走不穩(wěn)，雙手震顫，以靜止性震顫為著，反應(yīng)遲鈍，語言表達(dá)能力減退，精神疲倦，視幻覺明顯。

NO.I1先證者父親，男性，45歲（1987年）去世，既往約32歲時無明顯誘因出現(xiàn)一過性意識不清，口吐白沫，雙眼上翻，肢體抽搐，呈全面性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，持續(xù)約3～4 min后可恢復(fù)意識，癥狀緩解，未診治及服藥治療，共發(fā)作3次。

NO.II2先證者大姐，女性，45歲（2021年）去世，2009年8月先證者大姐無明顯誘因出現(xiàn)意識不清，向后傾倒，雙眼上翻，肢體抽搐，呈全身性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，持續(xù)約4 min后緩解，到湖南省當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，予丙戊酸鈉緩釋片抗癲癇治療，服藥后仍有癲癇發(fā)作，約2～3次/月。2011年先證者大姐出現(xiàn)幻視，表現(xiàn)為視物呈現(xiàn)七彩樣閃光點(diǎn)，隨之出現(xiàn)大片水波樣橫紋，持續(xù)1～2 min左右后出現(xiàn)雙眼黑朦。

2.2 頭顱MRI掃描結(jié)果 先證者頭顱MRI結(jié)果提示大腦及小腦輕度萎縮，先證者大姐頭顱MRI提示大腦及小腦輕度腦萎縮。見圖2、3。

圖1 成人型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥家系圖Fig.1 Pedigree of adult neuronal ceroid lipofuscinosis

圖2 先證者頭顱MRI提示大腦皮層及小腦輕度萎縮Fig.2 Brain MRI of the proband showed mild atrophy of cerebral cortex and cerebellum

圖3 先證者大姐頭顱MRI提示輕度腦萎縮。Fig.3 Brain MRI of the proband's elder sister showed mild cerebral atrophy

2.3 基因突變檢測結(jié)果 通過對先證者家系進(jìn)行全外顯子組測序，檢測到DNAJC5基因存在1個雜合變異：c.344T ＞ G（p.Leu115Arg），此序列變化導(dǎo)致DNAJC5基因第344位核苷酸T被替換為G（c.344T＞G），導(dǎo)致第115號氨基酸由亮氨酸變成精氨酸（p.Leu115Arg），該變異為錯義突變。到目前為止，該變異在參考人群基因頻率數(shù)據(jù)庫（gnomeAD）中最小等位基因頻率未記錄。多種預(yù)測結(jié)果提示該變異對基因或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成有害影響的可能性大。該變異被Clinvar數(shù)據(jù)庫報道為致病的。經(jīng)分析，先證者的母親未見突變，先證者的大女兒雜合突變，先證者的二女兒未見突變，先證者的二姐未見突變，受檢者的大姐雜合突變，先證者的大姐小兒子未見突變。見圖4。

圖4 先證者及其家屬DNAJC5基因的Sanger測序結(jié)果Fig.4 Sanger sequencing results of DNAJC5 gene of the proband and his family

3 討論

本文報道1個由DNAJC5基因突變所致成人型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥家系的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征。成人型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥（ANCL）首發(fā)癥狀出現(xiàn)于30歲左右，臨床癥狀呈慢性、進(jìn)行性加重，患者約在10年后死亡，存在2種主要的臨床表型［6］：A型表現(xiàn)為進(jìn)行性難治性肌陣攣癲癇、癡呆、共濟(jì)失調(diào)及晚發(fā)的錐體和錐體外系癥狀，受累個體多不伴有視力障礙。B型表現(xiàn)為行為異常、癡呆、運(yùn)動障礙，可伴有共濟(jì)失調(diào)和錐體外系癥狀及腦干受累癥狀［6］。眼底檢查顯示有視神經(jīng)萎縮和（或）視網(wǎng)膜色素變性，MRI為大腦皮質(zhì)及小腦腦萎縮，病理顯示腦內(nèi)神經(jīng)元有大量脂質(zhì)色素沉積。起病年齡越早，臨床表現(xiàn)及預(yù)后越嚴(yán)重。

本研究納入的家系特點(diǎn)主要為：發(fā)病年齡平均為33歲，臨床表現(xiàn)早期以癲癇癥狀起病，后期伴有行走不穩(wěn)、言語困難、肢體靜止性震顫，視物不清癥狀。先證者及其大姐顱腦MRI影像學(xué)檢查表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)及小腦輕度萎縮。先證者大姐起病年齡較先證者早，臨床癥狀相對重。綜合分析，臨床表現(xiàn)考慮為成人型神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥A型。同時，本研究中全外顯子二代測序中發(fā)現(xiàn)了先證者大女兒攜帶有DNAJC5基因c.344T＞G（p.Leu115Arg）突變，來源于先證者，目前年齡10歲，智力運(yùn)動發(fā)育正常，臨床表現(xiàn)正常。根據(jù)該家系發(fā)病特點(diǎn)，應(yīng)該高度關(guān)注先證者大女兒發(fā)病情況。DNAJC5基因位于染色體20q13.33，編碼α-半胱氨酸串蛋白（cysteine-string protein α，CSPα）［5］。CSPα是一種具有酶活性的分子伴侶復(fù)合物，屬于突觸前J蛋白，在神經(jīng)組織以及突觸和網(wǎng)格蛋白包被的小泡中表達(dá)，主要功能是保證突觸囊泡蛋白的正確折疊。CSPα包含了N端J結(jié)構(gòu)域（15-83 aa）、連接區(qū)（84-112）和半胱氨酸鏈結(jié)構(gòu)域（CSD）（113-136 aa）這三個高度保守的結(jié)構(gòu)域，突變主要發(fā)生在CSPα高度保守的區(qū)域。DNAJC5基因突變的p.L115R突變會影響到位于CSD N端高度保守的二亮氨酸殘基。CSPα缺乏充分棕櫚?；蛉笔Э赡芡瑫r導(dǎo)致突觸前功能障礙和進(jìn)展性神經(jīng)退行性變，以及溶酶體中錯誤折疊和蛋白水解抵抗蛋白的積累，這些蛋白以神經(jīng)元中以特有的脂質(zhì)褐樣沉積的形式存在［7］。DNAJC5基因錯義突變導(dǎo)致蛋白改變少，臨床癥狀相對較輕。

過去診斷NCL主要依靠發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)和病理檢查結(jié)果，現(xiàn)在的診斷還可以通過酶學(xué)分析和基因檢查，在進(jìn)行生化和基因檢查前必須進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的檢查，以確定溶酶體內(nèi)沉積物的性質(zhì)［8］。病理檢查發(fā)現(xiàn)病理性脂褐素顆粒是診斷NCL的金標(biāo)準(zhǔn)，基因檢查目前已經(jīng)成為診斷NCL的重要方法［9］?；蛐团c臨床表型的相關(guān)性拓寬了對NCL疾病的認(rèn)識，同時為治療進(jìn)展提供了基于基因的關(guān)注和對病理靶點(diǎn)的考慮。

NCL屬于溶酶體貯積?。╨ysosomal storage disease，LSD），因大腦有特殊的血腦屏障存在，許多應(yīng)用于LSD的治療方法對NCL患者無效［10］。因此目前尚無有效的治療，治療只能以控制癥狀、改善生存質(zhì)量為目標(biāo)，例如針對癲癇癥狀給予藥物等對癥處理。目前新興的治療方法處于臨床試驗階段，分別包括：（1）酶替代療法；（2）基因治療；（3）干細(xì)胞治療；（4）免疫治療；（5）其他藥物治療［11］。但是，為了獲得長期的臨床效益，對NCLs的治療必須盡早開始，最好是在出現(xiàn)任何癥狀之前。這將需要在基于DNA的方法的進(jìn)步的幫助下進(jìn)行快速和早期診斷，并突出了發(fā)展適當(dāng)新生兒篩查的重要性［12-13］。本研究中先證者和先證者大姐出現(xiàn)了臨床癥狀，并在不斷加重，嚴(yán)重影響了正常生活及工作，治療上可予抗癲癇藥物控制癲癇發(fā)作等對癥治療。而該研究中先證者大女兒為DNAJC5基因錯義突變攜帶者，根據(jù)該家系的發(fā)病特點(diǎn)，應(yīng)高度重視其在未來生活中出現(xiàn)相關(guān)的臨床表現(xiàn)，盡早開始干預(yù)。在基因診斷明確的前提下給予患者家系遺傳咨詢，通過胎盤絨毛或羊水細(xì)胞基因分析可以對下一胎同胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷，減少疾病患兒的出生。