何珂瑤 劉怡文 張哲源 張家豪 代寧濤 楊海軍 孔金玉 周福有，4

1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院胸外科（河南新鄉(xiāng) 453003）；2河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南科技大學腫瘤研究所，河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室（河南洛陽 471003）；3安陽市腫瘤醫(yī)院病理科（河南安陽 455000）；4安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科，河南省食管癌精準防治醫(yī)學重點實驗室（河南安陽 455000）

食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）發(fā)病率與病死率極高，病因至今尚未完全明確［1-2］。筆者既往研究證實，具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）為ESCC的關鍵致病因素［3-4］。資料顯示，病原微生物入侵可引發(fā)宿主細胞自噬反應，并通過多種生物學機制發(fā)生自噬逃逸，從而長期定植并促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及化療耐受［5-7］。微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）是最早發(fā)現(xiàn)的自噬調節(jié)因子，多種病原微生物可通過調控LC3活性，引起自噬小體堆積，為自身定植提供條件［8-10］。因此推測Fn可能通過激活LC3，誘發(fā)自噬反應，促進ESCC惡性演進。

本研究首先建立LC3敲降的ESCC細胞系，分別用Fn感染親本與敲降細胞系，探索LC3在Fn促癌機制中發(fā)揮的作用。并檢測ESCC組織中Fn感染及LC3表達情況，進一步分析二者對ESCC患者生存期的影響，為ESCC防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 ESCC細胞系KYSE150及Fn菌株（本實驗室凍存）；四氧化鋨、丙酮、環(huán)氧樹脂（德國Merck生命科學公司）；醋酸鈾、檸檬酸鉛（中國ChemicalBook公司）；LC3抗體（英國Abcam公司）；GAPDH抗體、山羊抗兔IgG、ECL發(fā)光顯影液（中國CWBIO公司）；免疫組化試劑盒（中國ZSGB-BIO公司）；RNAscope試劑盒及Fn特異性探針（美國ACD公司）；凝膠成像儀（美國Thermo公司）；透射電鏡（日本Hitachi公司）；酶標儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 Fn感染ESCC細胞 厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)Fn。培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)KYSE150。將Fn（菌液OD600nm=1～2）加入KYSE150培養(yǎng)基（MOI=10），感染12 h及24 h，進行后續(xù)實驗。具體細菌及細胞培養(yǎng)方法參照本課題組前期研究［11］。

1.3 Western blot 各組細胞蛋白（30 μg總蛋白/泳道）經(jīng)電泳、轉膜、封閉后，LC3（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體孵育4 h，山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2 h。ECL發(fā)光顯影液于凝膠成像儀中檢測蛋白條帶，Image Lab軟件測定灰度值。以LC3-Ⅱ與GAPDH比值為最終LC3-Ⅱ相對表達量［12］。實驗重復3次。

1.4 透射電鏡 各組細胞經(jīng)戊二醛及四氧化鋨固定、梯度丙酮脫水、滲透液滲透、環(huán)氧樹脂包埋后，常規(guī)切片（片厚100 nm）。經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛染色后，用透射電鏡觀察各組細胞中自噬小體。

1.5 慢病毒載體包裝 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)293T細胞，采用慢病毒包裝試劑盒，將LC3敲降質粒（LC3-DNA）配制為LC3-DNA-EndoFectin混合物，加入293T培養(yǎng)基中，48 h后收取病毒上清，加入KYSE150培養(yǎng)基中。嘌呤霉素篩選后，Western blot檢測敲降效率。將LC3敲降后的細胞命名為KYSE150-LC3。

1.6 平板克隆 各組細胞均于6孔板中鋪入每孔2 mL細胞懸液（含1×103個細胞），常規(guī)培養(yǎng)1周。經(jīng)甲醛固定、結晶紫染色后，拍照并計數(shù)克隆數(shù)［13］。實驗重復3次。

1.7 劃痕實驗 各組細胞均于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合至70%，用無菌槍頭劃痕。至培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每隔6 h對同一位置細胞拍照。用Image J軟件測量并計算各組細胞的遷移面積［14］。實驗重復3次。

1.8 Transwell Matrigel膠包被Transwell小室基底膜。各組細胞饑餓培養(yǎng)24 h后，取100 μL細胞懸液（含1×105個細胞），加入Transwell小室，并向下室加入600 μL含血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。擦去小室上層細胞，經(jīng)甲醛固定、結晶紫染色后，拍照并計數(shù)穿過基底膜的細胞數(shù)［15］。實驗重復3次。

1.9 病例資料 選取2015年1月至2017年1月安陽市腫瘤醫(yī)院216例ESCC患者癌組織及相應癌旁組織石蠟包埋標本為研究對象，于術前獲得患者知情同意，且經(jīng)倫理委員會審核批準（批件號：2022WZ17K01）。納入標準及排除標準見圖1，最終納入211例ESCC患者。

圖1 本研究ESCC患者的入組標準及臨床病理特征Fig.1 Enrollment criteria and clinicopathological characteristics of ESCC patients in this study

1.10 RNAscope ESCC組織及相應癌旁組織病理切片（片厚2 μm），經(jīng)脫蠟、水化、靶標修復液修復、雙氧水及蛋白酶孵育、Fn探針雜交后，顯色試劑顯色。結果判定：細胞漿可見紅色顆粒為Fn 16S rRNA表達陽性。本研究中：（1）Fn感染陽性細胞判定標準為細胞中紅色顆?！?個；（2）Fn感染陽性樣本判定標準為每張切片中陽性細胞比例≥30%。具體操作步驟及評分細則參照本課題組前期研究［16］。

1.11 免疫組化 同批ESCC組織及相應癌旁組織連續(xù)切片（片厚2 μm），經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復后，試劑盒中試劑1及試劑2封閉。LC3抗體（1∶200）、試劑3及試劑4孵育后DAB顯色。復染、脫水、透明后封片。結果判定：細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為LC3表達陽性。本研究中LC3陽性判定標準為評分＞4分。具體操作步驟、陽性對照、陰性對照及評分細則參照文獻［17］。

1.12 統(tǒng)計學方法 （1）采用SPSS 26.0軟件及GraphPad 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析及繪圖。（2）計量資料以（±s）表示，t檢驗比較兩組間差異；單因素方差分析比較兩組以上組間差異。（3）計數(shù)資料采用χ2檢驗分析相關性，Cohen's kappa系數(shù)分析一致性（Kappa＞0.7，一致性顯著）。（4）生存分析：①Kaplan-Meier生存分析比較各組間生存時間差異；②生存時間為患者入院時間至最后1次隨訪日期或死亡；③隨訪時間為60個月；④刪失數(shù)據(jù)為隨訪至60個月仍存活的患者（59例），未刪失數(shù)據(jù)為由ESCC導致的死亡患者（152例）。（5）P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Fn感染對KYSE150中LC3及自噬小體的影響 采用Fn感染KYSE15012h及24h。通過Western blot檢測各組細胞中LC3-Ⅱ表達情況（圖2A、B）結果顯示：與KYSE150相比，KYSE150+Fn（12 h）及KYSE150+Fn（24 h）中 LC3-Ⅱ表達量逐漸增高（P＜0.05）。采用透射電鏡觀察KYSE150及KYSE 150+Fn（24 h）中自噬小體形成情況（圖2C、D）結果顯示：與KYSE150相比，KYSE150+Fn（24 h）中自噬小體數(shù)量增加（P＜0.05）。

圖2 Fn感染可誘導KYSE150中LC3-Ⅱ高表達及自噬小體富集Fig.2 Fn infection induced high expression of LC3-Ⅱand enrichment of autophagosomes in KYSE150

2.2 Fn感染及LC3高表達對KYSE150增殖能力的影響 采用Western blot檢測LC3敲降效率（圖3A、B）結果顯示：與KYSE150相比，KYSE150-LC3中LC3表達量降低（P＜0.05），成功建立LC3敲降的穩(wěn)定細胞系。用Fn感染KYSE150及KYSE150-LC3，實驗分為 KYSE150組、KYSE150-LC3組、KYSE150+Fn組及KYSE150-LC3+Fn組。采用平板克隆檢測各組細胞的增殖能力（圖3C、D）結果顯示：與KYSE150組相比，KYSE150-LC3組增殖能力降低（P＜0.05）；而KYSE150+Fn組增殖能力增強（P＜0.05）。與KYSE150+Fn組相比，KYSE150-LC3+Fn組增殖能力降低（P＜0.05）。

圖3 Fn感染及LC3高表達對KYSE150增殖能力的影響Fig.3 Effect of Fn infection and LC3 high expression on the proliferation of KYSE150

2.3 Fn感染及LC3高表達對KYSE150遷移及侵襲能力的影響 采用劃痕實驗（圖4A-C）及Transwell（圖4D、E）檢測各組細胞的遷移及侵襲能力，結果顯示：與KYSE150組相比，KYSE150-LC3組上述能力降低（P＜0.05）；而KYSE150+Fn組上述能力增強（P＜0.05）。與KYSE150+Fn組相比，KYSE150-LC3+Fn組上述能力降低（P＜0.05）。

圖4 Fn感染及LC3高表達對KYSE150遷移及侵襲能力的影響Fig.4 Effect of Fn infection and LC3 high expression on the migration and invasion of KYSE150

2.4 ESCC組織中Fn感染及LC3表達檢測 采用RNAscope檢測Fn感染情況，結果顯示：癌細胞及間質細胞胞漿出現(xiàn)紅色顆粒，為Fn感染陽性（圖5A），而相應癌旁組織中Fn多為陰性（P＜0.05，圖5E及表1）。采用免疫組化檢測LC3表達情況，結果顯示：癌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，為LC3表達陽性（圖5B），而相應癌旁組織中LC3多為陰性（P＜0.05，圖5F與表1）。癌組織中Fn感染率及LC3陽性率分別為39.81%及41.71%，二者具有顯著一致性（P＜0.05，表2）。

圖5 Fn感染與LC3表達檢測結果（DAB染色，×400）Fig.5 Detection results of Fn infection and LC3 expression（DAB staining，× 400）

表1 ESCC組織及相應癌旁組織中Fn及LC3陽性率的比較Tab.1 Comparison of positive rates of Fn and LC3 in ESCC tissues and corresponding adjacent tissues 例（%）

表2 ESCC組織中Fn感染與LC3高表達的一致性分析Tab.2 Consistency analysis of Fn infection and LC3 high expression in ESCC tissues 例（%）

2.5 Fn感染及LC3高表達與ESCC患者臨床病理特征的相關性 將2張連續(xù)切片中Fn及LC3同時判定為陽性的樣本定義為Fn誘導LC3高表達陽性組，以Fn+LC3（+）表示（75例）；不滿足2張連續(xù)切片同時陽性的歸為陰性組，以Fn+LC3（-）表示（136例）。分析各因素與患者臨床病理特征的相關性（表3）結果顯示：Fn感染、LC3高表達及Fn+LC3（+）的ESCC患者中，男性多于女性，有吸煙、飲酒史的患者多于無吸煙、飲酒史的患者，低分化患者多于中-高分化患者，腫瘤浸潤深度侵及外膜的患者多于未侵及外膜的患者，有淋巴結轉移的患者多于無淋巴結轉移的患者，臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者多于Ⅰ/Ⅱ期的患者（均P＜0.05）。

表3 Fn感染及LC3表達與ESCC患者臨床病理特征的相關性Tab.3 Correlation analysis of Fn infection and LC3 expression with clinicopathological features of ESCC patients 例（%）

2.6 Fn感染及LC3高表達對ESCC患者生存期的影響 分析各因素與ESCC患者生存期之間相關性。結果顯示：211例ESCC患者術后5年總生存率為27.96%（圖6A），其中Fn感染陽性、LC3表達陽性及Fn+LC3（+）組患者的5年總生存率及中位生存時間均顯著低于陰性組患者（P＜0.05，圖6B-D）。且與Fn感染及LC3表達陽性的患者相比，F(xiàn)n+LC3（+）患者5年生存期縮短更顯著。

圖6 ESCC患者術后生存曲線Fig.6 Survival curve of ESCC patients after surgery

3 討論

ESCC是常見的惡性腫瘤。筆者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染陽性的ESCC患者預后不良［4］。闡明Fn致病的分子機制對降低ESCC發(fā)病率及改善患者預后至關重要。

病原微生物對宿主微環(huán)境的重塑機制至今尚未完全明確，但多數(shù)可引發(fā)宿主細胞自噬反應，并演進出多種機制發(fā)生自噬逃逸［18-20］。LC3為自噬標志蛋白。當自噬被誘導時，胞漿中的LC3-Ⅰ被修飾成膜結合型LC3-Ⅱ，轉定位于自噬小體雙層膜表面，一般以LC3-Ⅱ表達量評估自噬水平［21-22］。多種病原微生物均可通過調控LC3表達及轉定位，誘發(fā)癌細胞自噬。幽門螺旋桿菌、乙肝病毒及人乳頭瘤病毒均可通過激活LC3，誘發(fā)癌細胞自噬，協(xié)助自身大量復制，并促進胃癌、肝癌及宮頸癌的惡性增殖［8-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染后，ESCC細胞中LC3表達量及自噬小體數(shù)量增加，表明Fn感染可誘導LC3高表達，引發(fā)ESCC細胞自噬反應。為探明LC3在Fn促癌機制中發(fā)揮的作用，建立LC3敲降的ESCC細胞系，分別用Fn感染親本與敲降細胞系，發(fā)現(xiàn)Fn感染時，ESCC細胞的LC3蛋白增加、惡性生物學行為增強，提示Fn可通過誘導LC3高表達，引發(fā)自噬潮，促進ESCC細胞快速增殖及惡性侵襲。LC3敲降時，上述指標均降低，提示LC3的激活與ESCC細胞惡性生物學行為的維持密切相關。而Fn感染LC3敲降的ESCC細胞時，并不能引起上述指標增強，提示LC3的敲降阻斷了Fn在ESCC細胞中的促癌作用，表明LC3是Fn感染引起ESCC惡性演進過程中的關鍵調控因子。

研究顯示，LC3已成為多種腫瘤的關鍵治療靶點［23-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中Fn感染率及LC3陽性率分別為39.81%及41.71%，二者具有一致性，提示Fn感染的ESCC細胞中LC3高度激活。Fn感染及LC3高表達患者多為有吸煙、飲酒史的男性患者，提示由于大多數(shù)男性患者長期吸煙、飲酒，F(xiàn)n定植率高，定植部位LC3多為高表達。且隨腫瘤分化程度降低，二者陽性率逐漸增高，提示Fn感染及LC3高表達與腫瘤的惡性程度有關。二者陽性組的患者腫瘤浸潤程度深、淋巴結轉移率高、臨床分期多為Ⅲ/Ⅳ期，提示Fn感染及LC3高表達可促進ESCC的惡性演進。二者陽性組的患者5年生存期均縮短，且二者共陽性組的患者5年生存期縮短更顯著，提示Fn感染及LC3高表達均可影響ESCC患者生存期，且二者共陽性對患者生存期影響最大。

綜上所述，F(xiàn)n可通過誘導LC3高表達，引發(fā)自噬反應，促進ESCC惡性演進。由于病原微生物感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素的復雜過程，F(xiàn)n的具體致病機制仍有待進一步探討，但有效清除Fn并抑制其對ESCC細胞自噬的誘導作用，對延長患者生存期至關重要。