程玉謙 王悅

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染疾病科（天津 300211）

肺炎克雷伯菌是臨床常見的革蘭氏陰性病原菌，獲得對抗生素的多重耐藥性和擁有高毒力已成為其兩種不同進化方向。前者是導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要病原菌，通過獲得耐藥基因尤其是超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）或碳青霉烯酶導(dǎo)致多重耐藥；而后者對大多數(shù)抗菌藥物敏感，毒力強，常導(dǎo)致危及生命的侵襲性感染如肝膿腫和眼內(nèi)炎等。以往認為這兩種克隆株是獨立進化，但是自從2014年報道多重耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌（MDR-hvKP），面對抗生素選擇壓力，越來越多的整合高毒力和多重耐藥表型的臨床株被檢測到并且作為“超級細菌”引起全世界的關(guān)注，尤其是碳青霉烯耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP），給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)，甚至導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)的爆發(fā)流行。為了更好地了解這種“超級細菌”并制定高效可行的防治策略，本文針對其流行病學(xué)特點及耐藥機制做一綜述。

1 流行病學(xué)特點

通過比較七個管家基因的等位基因序列，多位點序列分型（MLST）可以將肺炎克雷伯菌群體構(gòu)建成譜系，即序列類型（ST）。肺炎克雷伯菌的高耐藥和高毒力表型具有自己獨特的克隆譜系。全球已報告碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌（CRKP）中，ST11克隆主要在中國和南美流行，ST258主要在美國報道，ST512在意大利和希臘流行，ST147主要在印度和突尼斯報道。同時高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）主要集中于ST23，ST65和ST86克隆背景［1］。近年來，有關(guān)CR-hvKP臨床株的報道陸續(xù)出現(xiàn)并逐漸增多。2014年CEJAS等［2］報道了美國首次分離的產(chǎn)KPC-2的ST23型CR-hvKP的菌株。2016年ZHANG等［3］報道了我國浙江省從住院患者中分離出的5株攜帶blaKPC-2的ST23/K1型CR-hvKP克隆株和少見的ST1797克隆株。我國CR-hvKP的流行病學(xué)分析顯示80%的CR-hvKP菌株屬于產(chǎn)KPC-2的ST11型。ST11-CR-HvKP具有高傳播性，高耐藥性和高毒力，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，我國是流行率最高的國家［4-5］。盡管流行病學(xué)研究顯示在我國KPC是CR-hvKP最常見的碳青霉烯酶，攜帶NDM，VIM，OXA和IMP的CR-hvKP也陸續(xù)被報道［11-14］。同時我國也出現(xiàn)其他ST型CR-hvKP。近期 ZHU等［15］首次報告了由一種新型ST克?。篠T859-K19 CR-hvKP臨床分離株導(dǎo)致的上海教學(xué)醫(yī)院感染暴發(fā)，利用WGS數(shù)據(jù)建立的系統(tǒng)圖顯示所有11株CR-hvKP菌株具有幾乎相同的耐藥基因圖譜（blaKPC-2、blaTEM-1B、blaSHV-187、rmtB、fosA6）和毒力基因圖譜（rmpA、rmpA2、iucABCDiutA），屬于同一克隆傳播，這一觀察結(jié)果提示在肺炎克雷伯菌中，編碼可移動遺傳元件的耐藥基因和毒力基因正在向更多的ST型傳播，因此需要進行大規(guī)模和廣泛的流行病學(xué)監(jiān)測，以深入研究CR-hvKP的進化。 ZHAO等［16］首次報道了從華西醫(yī)院一位ICU重癥感染患者的痰液中分離的一株ST592的CR-hvKP菌株，這是一種少見的與高毒力和碳青霉烯耐藥性相關(guān)的ST型，突出了CR-hvKP的不同克隆背景。

除我國，包括美國、英國、阿根廷、日本和加拿大在內(nèi)的眾多國家陸續(xù)報道CR-hvKP［1］。隨著毒力基因和耐藥基因的傳播，菌株的克隆背景呈現(xiàn)多樣性，已經(jīng)報道了越來越多的序列類型（ST）的CR-hvKP 分離株，包括 ST11，ST14，ST23，ST25，ST36，ST65，ST86，ST1797，ST43，ST231，ST147，ST15，ST383，ST268，ST595，ST375，ST48和 ST307等［6-9］，其所攜帶的碳青霉烯酶包括 KPC-2，NDM（NDM-1，NDM-5和NDM-7），IMP，SIM，VIM（VIM-1和VIM-2）和OXA-48等［10］。對GenBank中可用基因組序列的分析也證實攜帶毒力質(zhì)粒的CRKP已經(jīng)傳播到世界其他地區(qū)，對公眾健康構(gòu)成了巨大威脅，全球需立即采取行動阻止這種危險微生物的傳播［5］。

2 耐藥機制

CR-Hvkp主要是通過移動遺傳元件在細菌中轉(zhuǎn)移耐藥基因和毒力相關(guān)基因，這些遺傳元件包括質(zhì)粒、整合接合元件（ICE）、整合子、插入序列（IS）和轉(zhuǎn)座子。目前文獻報告的CR-hvKP菌株通過以下三種模式產(chǎn)生。

2.1 捕獲耐藥基因或發(fā)生染色體基因突變 hvKP譜系（如ST23/ST86/ST65）通過移動遺傳元件獲得碳青霉烯酶基因或在染色體上發(fā)生基因突變。其機制主要包括通過分子間復(fù)制轉(zhuǎn)座由毒力質(zhì)粒捕獲耐藥基因、獲得可接合的耐藥質(zhì)粒、獲得具有未知接合轉(zhuǎn)移機制的耐藥質(zhì)粒以及通過其他未知機制獲得耐藥基因。

hvKP菌株獲得攜帶碳青霉烯酶基因的質(zhì)粒是報道最多的機制，耐藥基因主要包括blaKPC-2，blaNDM-1，blaOXA-48，blaVIM-1，blaVIM-2 和blaIMP-6；其中，blaKPC-2和blaNDM-1最為普遍。HvKp獲得碳青霉烯耐藥基因具有地域性。例如，NDM和OXA在印度很常見，因此近年來在該地區(qū)出現(xiàn)了產(chǎn)NDM和OXA的CR-hvKP菌株。同樣OXA-48在法國流行，RACHA等［17］在一位泌尿道感染患者中分離出一株CR-hvKP即Kpn154，含有IncL型pOXA-48樣質(zhì)粒和IncHI1B/IncFIB型pVIRKpn154，Kpn154是由K2/ST86 Hvkp通過編碼碳青霉烯酶OXA-48質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。加拿大、美國和英國也報道了以類似機制進化的產(chǎn)KPC-2的K2/ST86分離株以及產(chǎn)KPC-2和NDM的K1/ST23分離株［18-20］。在我國，2016年ZHANG等［3］報道了浙江省住院患者中分離產(chǎn)blaKPC-2的K1/ST23型和少見的ST1797型CR-hvKP克隆株。YAN等［21］從浙江省一例患有COPD的老年患者痰液中分離出ST23/K1型CR-hvKP菌株ZJ27003，其含有攜帶blaKPC-2的IncP1質(zhì)粒p27003_KPC可以轉(zhuǎn)移至銅綠假單胞菌PAO1并使受體對碳青霉烯具有耐藥性，提示這種攜帶和傳播blaKPC-2基因的CR-hvKP分離株對公共健康造成嚴重威脅。除了獲得可傳播的接合質(zhì)粒外，hvKP菌株的毒力質(zhì)粒也可以通過分子間的轉(zhuǎn)座整合抗生素耐藥基因。介導(dǎo)這種轉(zhuǎn)座的移動元件靶向毒力質(zhì)粒上的相關(guān)熱點，導(dǎo)致耐藥基因和稱為靶點重復(fù)（TSD）的重復(fù)熱點序列的整合。2018年我國首次報道了攜帶blaKPC-2的毒力雜合質(zhì)粒的CR-hvKP臨床株：一株K1/ST23 CR-hvKP臨床株KP70-2，其含有的質(zhì)粒pKP70-2是pLVPK樣毒力質(zhì)粒，除了位于遺傳保守質(zhì)粒骨架內(nèi)的額外MDR編碼區(qū)，與其他hvKP菌株攜帶的各種已知的毒力質(zhì)粒幾乎在結(jié)構(gòu)上相同。MDR編碼區(qū)含有移動元件，包含抗生素耐藥基因dfrA14和blaKPC-2，該MDR區(qū)域側(cè)翼為兩個相同方向的IS26拷貝，與靶位點重復(fù)的外部8bp（CTAAAATT）產(chǎn)物連接，表明插入事件是通過IS26介導(dǎo)的分子間復(fù)制轉(zhuǎn)座將多藥耐藥區(qū)域整合到毒力質(zhì)粒［22］，這將導(dǎo)致嚴重的公共衛(wèi)生問題。

同時，通過染色體突變獲得碳青霉烯耐藥性的hvKP雖然很少但也有報道。如2016年印度報道的K2/ST14型hvKP菌株 U25，其ompK36在134位氨基酸處插入了甘氨酸和天冬氨酸，這種突變導(dǎo)致膜通透性改變，阻礙抗生素進入細胞產(chǎn)生對亞胺培南的耐藥性，在U25的質(zhì)粒（包括blaOXA-9，blaCTX-M-15和blaSHV-11）和染色體（blaOXA-1和blaSHV-28）中發(fā)現(xiàn)了多種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，但是沒有檢測到碳青霉烯酶［23］。早在2015年我國的一項回顧性研究中發(fā)現(xiàn)一株ST65/K2臨床株由于產(chǎn)生ESBL和減少OmpK35/36的表達而表現(xiàn)出對碳青霉烯類的高耐藥性，但不產(chǎn)生碳青霉烯酶［24］。

2.2 獲得毒力相關(guān)基因 CRKP分離株獲得毒力質(zhì)粒，如獲得pLVPK樣毒力質(zhì)粒的ST11 CR-hvKP。獲得毒力相關(guān)基因涉及三個主要機制：（i）通過與由同源重組介導(dǎo)的輔助接合質(zhì)粒共整合來獲得毒力質(zhì)粒；（ii）通過同源重組獲得含有毒力基因的接合質(zhì)粒；（iii）攜帶毒力因子的ICE元件的染色體整合。同源重組在高毒力相關(guān)基因的傳播中起著關(guān)鍵作用。相比上述hvKP克隆株獲得耐藥基因，這些CRKP譜系可能更容易獲得毒力基因或毒力質(zhì)粒［25］。最具特征的毒力質(zhì)粒是來自K1/ST23菌株NTUH-K2044的224 kbp質(zhì)粒pK2044；來自K2/ST86菌株CG43的219 kbp質(zhì)粒pLVPK和K2/ST66菌株Kp52.145的121 kbp質(zhì)粒Kp52.145pII，其中毒力相關(guān)的位點和基因是高度保守的［26］。CR-hvKP的高毒力主要包括rmpADC和rmpA2（粘液表型調(diào)節(jié)子），以及編碼iucABCD-iutA的氣桿菌素和編碼iroBCDN的沙門菌素，因為缺乏包含tra基因的完整接合模塊，以往認為毒力質(zhì)粒如pLVPK是非結(jié)合的［26］。近年來，越來越多的證據(jù)表明pLVPK樣毒力質(zhì)粒能夠傳播和增強CRKP的毒力［28］。YAO等［29］從河南省臨床患者中篩選出4株ST11-CRHvKP菌株，每株菌株均攜帶KPC-2編碼質(zhì)粒和毒力質(zhì)粒，毒力質(zhì)粒的進一步測序顯示與pLVPK高度同源。GU等［28］報道了浙江省一所醫(yī)院ICU發(fā)生的ST11-CR-HvKP菌株導(dǎo)致呼吸機相關(guān)肺炎的流行，除了攜帶blaKPC-2基因的接合MDR質(zhì)粒外，致病菌株還獲得了大約170 kbp的pLVPK樣毒力質(zhì)粒，這5位患者死于嚴重肺部感染、多器官衰竭或感染性休克。隨后，DONG等［30］分析了上述三種ST11 CR-HvKP分離株的全基因組序列（WGS），它們各自攜帶五種質(zhì)粒，包括一個178 Kb的IncHI1B/FIB型攜帶rmpA2的毒力質(zhì)粒，一個177.5 Kb的IncFII/R自轉(zhuǎn)移的攜帶blaKPC-2 MDR質(zhì)粒，一個99.7 Kb的Incl1質(zhì)粒和兩個大小分別為11.9 Kb和5.6 Kb的ColRNAI型質(zhì)粒。非接合的毒力質(zhì)粒和攜帶blaKPC-2的MDR接合質(zhì)粒之間存在同源區(qū)域，這表明毒力質(zhì)粒從ST23 hvKP到ST11 CRKP的傳播可能是通過這兩種質(zhì)粒的共整合轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的。這標志著一個令人擔(dān)憂的進化事件—質(zhì)粒介導(dǎo)的多藥耐藥性和高毒力的融合，因為它們同時具有高毒力、多藥耐藥性和高度傳播性，對人類健康造成嚴重威脅，應(yīng)采取控制措施，防止其在醫(yī)院和社區(qū)的進一步傳播。

YANG等［31］探討了ST11 CR-Hvkp獲得毒力質(zhì)粒的分子機制，即通過同源重組和插入序列IS26和IS903B在毒力質(zhì)粒、Incl1型接合輔助質(zhì)粒和小ColRNAI質(zhì)粒之間形成融合質(zhì)粒的事件介導(dǎo)的。融合事件將導(dǎo)致肺炎克雷伯菌產(chǎn)生新的毒力因子，并加強這些毒力因子的傳播，這一發(fā)現(xiàn)為克雷伯菌毒力質(zhì)粒傳播的遺傳機制提供了新的見解。含有鐵載體生物合成基因的種屬特異性整合和結(jié)合元件ICEKp在肺炎克雷伯菌的進化中起著重要作用，ICEKp的水平轉(zhuǎn)移為毒力因子的傳播提供了重要機制。SHEN等［32］報道了ST35/KL108 CR hvKp分離株是通過獲得攜帶blaNDM-5的質(zhì)粒并整合位于染色體上的約76 Kb的含有iroBCDN和rmpA基因的ICEKp1元件而進化。這也是有關(guān)ST35型產(chǎn)NDM-5的CR hvKp出現(xiàn)ICEKp1染色體整合的首次報道。

WU等［33］通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索了1980年至2022年間105個國家的21 016株CRKP的基因組序列，研究了CRKP的基因組特征，包括克隆譜系、碳青霉烯酶基因、毒力基因以及莢膜和脂多糖類型，發(fā)現(xiàn)我國大部分Hvkp與優(yōu)勢CRKP克隆相關(guān)，提示CRKP的經(jīng)典菌株已經(jīng)開始進化成高毒力菌株，因此提出鑒于CR-hvKP在全球范圍的播散，應(yīng)實施由WGS支持的實時監(jiān)測和嚴格的感染控制措施。

2.3 單個質(zhì)粒中毒力基因和碳青霉烯耐藥基因的融合 大多數(shù)已知的融合過程由插入序列元件通過同源重組介導(dǎo)。2018年我國學(xué)者報道的K1/ST23型CR-hvKP的雜合質(zhì)粒pKP70-2最為經(jīng)典，攜帶毒力基因rmpA2和blaKPC-2，blaKPC-2位于非Tn4401元件中，稱為NTEKPC-Id，結(jié)構(gòu)為IS26-△tnpR-ISKpn8-blaKPC-2-DISKpn6-IS26［22］。2018年TURTON等［34］分析了攜帶碳青霉烯酶基因的序列類型（ST）15，48，101，147和383“高風(fēng)險”克隆株中的毒力質(zhì)粒，在菌株KpvST383_NDM_OXA-48，Kpv_ST383_S1和KpvST 48_NDM發(fā)現(xiàn)了三種攜帶毒力片段和blaNDM-5的雜交質(zhì)粒，全基因組測序分析提示這些雜交質(zhì)粒是通過IS介導(dǎo)的重組產(chǎn)生的。高毒力菌株能夠通過將IGE，主要是IS介導(dǎo)的MDR區(qū)整合到其內(nèi)在毒力質(zhì)粒中來獲得MDR決定簇，構(gòu)成了具有保守毒力區(qū)和新獲得的MDR編碼位點的雙重特征的鑲嵌質(zhì)粒，但可能不是接合的。然而，如果將編碼自轉(zhuǎn)移接合系統(tǒng)的基因與耐藥決定簇一起整合到毒力質(zhì)粒中，則將賦予雜交質(zhì)粒自傳遞性和接合性。或者借助于其他結(jié)合質(zhì)粒，可以將該雜合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。因此，如果不考慮進入宿主細菌的適應(yīng)性成本，它們能夠?qū)⒛退幮院投玖蛞淮涡赞D(zhuǎn)移到任何類型的肺炎克雷伯菌克隆中，以促進MDR hvKP尤其是CR-hvKP的出現(xiàn)。此外，如果IGE進一步將來自高毒力質(zhì)粒的毒力位點/基因攜帶到其他耐藥質(zhì)粒中，則形成了具有大多數(shù)耐藥質(zhì)粒特征的雜交質(zhì)粒。它們可以被轉(zhuǎn)移到hvKPs或cKPS中，從而形成由它們的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)的MDR hvKPs。在ST11 K64 hvCRKP菌株中發(fā)現(xiàn)了一種雜合質(zhì)粒，即pCRHV-C2244，該質(zhì)粒由pLVPK樣毒力質(zhì)粒和IS26介導(dǎo)轉(zhuǎn)座而攜帶blaKPC-2的IncFII/IncR質(zhì)粒融合而成［35］。由于缺乏tra基因，pCRHV-C2244本身沒有結(jié)合，但在輔助接合質(zhì)粒存在下，可以由大腸桿菌以10-10的低頻率轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌ATCC 13883［38］。最近發(fā)現(xiàn)，在ST86 hvCRKP中，非接合的pLVPK樣質(zhì)粒可通過275 bp短區(qū)的同源重組與攜帶blaKPC2的接合質(zhì)粒融合，從而實現(xiàn)兩種質(zhì)粒作為單個實體的接合轉(zhuǎn)移［36］。文獻已經(jīng)證明重組可以發(fā)生在非常短（＜ 100 bp）的同源序列之間［37］。ZHAO等［16］在一株ST592的CR-hvKP菌株中觀察到pLVPK樣毒力質(zhì)?？梢酝ㄟ^重組在接合過程中與攜帶blaKPC2的IncFII大接合質(zhì)粒融合，這種重組很可能發(fā)生在短至43 bp的同源區(qū)域之間。

此外，毒力基因可以通過肺炎克雷伯菌衍生的外膜囊泡（OMV）水平轉(zhuǎn)移。OMVs可以介導(dǎo)毒力質(zhì)粒phvK2115的種內(nèi)和種間水平轉(zhuǎn)移，也可以同時將兩種耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌和大腸桿菌受體菌株中。OMVs介導(dǎo)的phvK2115的水平轉(zhuǎn)移使得肺炎克雷伯菌中的毒力和碳青霉烯類耐藥基因共存，導(dǎo)致CR-hvkp的出現(xiàn)，這是一種重要的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移機制［38］。

3 臨床問題

3.1 環(huán)境定植 FRENCKEN等［27］研究表明G-菌的腸道定值增加了ICU患者出現(xiàn)菌血癥的風(fēng)險，對G-菌腸道定植的常規(guī)監(jiān)測具有臨床意義。CR-hvKP具有腸道定植的能力，這些菌株傳播的風(fēng)險很高，有可能導(dǎo)致嚴重感染。在一項針對低收入國家孕婦肺炎克雷伯菌腸道攜帶的流行病學(xué)研究中，提示環(huán)境暴露因素包括食物、動物接觸或家庭成員住院，同時發(fā)現(xiàn)了孕婦MDR HvKp的腸道定植［39］，甚至在即食蔬菜中檢測到ST23 CRKP菌株［40］，這不僅僅是食品安全問題，而是公共衛(wèi)生威脅。ZHENG等［41］針對教學(xué)醫(yī)院腹瀉住院患者進行篩查，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌目（CPE）細菌的攜帶率為12.4%，其中KP最常見（65/87），以ST11型（58/65；89%）為主，S1核酸酶PFGE（S1-PFGE）和Southern印跡分析顯示ST11 CR-HvKP分離株攜帶至少四種類型的rmpA-和rmpA2-陽性質(zhì)粒，大小范圍從約146 kb到約218 kb，糞便可能是ST11-CR-HvKP菌株的來源，有必要進一步研究ST11-CR-HvKP直腸定植與臨床感染之間的關(guān)系。

3.2 CR-hvKP院內(nèi)爆發(fā)對感控的挑戰(zhàn) CR-hvKP在醫(yī)療環(huán)境中的快速傳播和爆發(fā)對感染控制提出了巨大挑戰(zhàn)。高水平的耐藥性和致病性往往導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果。2016年從我國ICU病房分離出21株產(chǎn)生KPC-2的ST11型CRKP菌株，它們來自同一克隆并獲得了pLVPK樣毒力質(zhì)粒，導(dǎo)致5名患者在住院期間死亡［28］。OUYANG等［42］針對2018年湖南省一家醫(yī)院分離的CRKP進行的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生ST11 KPC-2的CR-hvKP在院內(nèi)廣泛存在，并且出現(xiàn)了ST11-KL64和ST11-KL47的兩個重要譜系的克隆傳播。因此迫切需要開發(fā)新的快速方便的方法來準確區(qū)分高毒力肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯菌，以便進行精確治療并阻止CR-hvKP的傳播。同時，產(chǎn)生一種以上碳青霉烯酶的CR-hvKP菌株已經(jīng)出現(xiàn)。LIU等［43］從我國燒傷創(chuàng)面感染患者中分離出同時產(chǎn)生NDM-1和KPC-2的ST86/K2肺炎克雷伯菌菌株。近年意大利報道了從住院患者分離出同時產(chǎn)生OXA-48，NDM-1和NDM-5的新型高毒力XDR肺炎克雷伯菌克隆KP52-19，OXA-48與NDM-1和NDM-5在單個菌株中的三種不同質(zhì)粒上的共存，導(dǎo)致血流感染［44］，由于遺傳元件的高遷移率以及由此所致質(zhì)粒的高重組率，在醫(yī)院環(huán)境中可能導(dǎo)致流行的雜合耐藥性/毒力的質(zhì)?？寺∽V系的傳播，監(jiān)測新出現(xiàn)的克隆型肺炎克雷伯菌中毒力/耐藥性質(zhì)粒的傳播具有絕對重要性，這給臨床管理、感染控制和抗菌藥物的應(yīng)用帶來巨大的挑戰(zhàn)。

總之，在過去的幾十年里，肺炎克雷伯菌不斷進化演變，成為高毒力和/或多藥耐藥菌株。尤其值得關(guān)注的是，CR-hvkp已在全球范圍內(nèi)傳播，對人類健康構(gòu)成重大威脅。這些菌株通過MDR克隆獲得毒力基因或通過hv克隆發(fā)展MDR表型而進化，進化事件主要涉及基因突變的累積和水平基因轉(zhuǎn)移，這需要做更多的研究深入理解這種“超級細菌”，從而設(shè)計可行的方法來根除或阻止菌株的進一步進化和播散。