張波 楊志敏 康子婧 康凱夫，4 許萍榕 鄒倩 朱偉， 王效軍

1廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院）病理科（廣東佛山 528000）；2佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院病理科（廣東佛山 528000）；3南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）（廣東佛山 528000）；4廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院（佛山市順德區(qū)婦幼保健院）（廣東佛山 528000）；5廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系病理學(xué)技術(shù)教研室（廣東東莞 523808）；6廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與統(tǒng)計學(xué)系（廣東東莞 523808）

子宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性癌癥死亡的第三大主要病因，是女性生殖系統(tǒng)第二大常見腫瘤［1］，多數(shù)為持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）感染所致。根據(jù)國家癌癥中心《2020年全國癌癥中心年度工作報告》顯示，子宮頸癌發(fā)病率位于第6位，死亡率位于第8位［2］。子宮頸癌篩查不僅要提高敏感度，還要提高特異度，從而有效準(zhǔn)確診斷HPV陽性或細胞學(xué)為意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）和低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的病例。病理活檢診斷為有創(chuàng)檢查不能成為常規(guī)篩查手段，p16/Ki-67可有效區(qū)分子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）并分級，薄層液基細胞學(xué)（thinprep cytologic test，TCT）聯(lián)合p16/Ki-67對診斷高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HSIL）特異度更高，但在進一步分流ASC-US病變中針對LSIL染色判讀以及子宮頸脫落細胞塊（cell block，CB）應(yīng)用于子宮頸癌篩查相關(guān)文獻鮮有報道。因此本文針對LSIL精準(zhǔn)判讀p16/Ki-67雙染染色、CB聯(lián)合p16/Ki-67雙染在ASC-US和LSIL分流的應(yīng)用進行探討，根據(jù)研究數(shù)據(jù)判定其可行性，為子宮頸癌及癌前病變的早期篩查提供可靠的診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2020年12月至2022年6月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院）和佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院婦科門診就診的符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的患者500例進行CB制備，以子宮頸活檢診斷為最終標(biāo)準(zhǔn)篩選出210例進行常規(guī)切片HE染色和p16/Ki-67雙染。入組病例年齡19～63歲，平均37歲。其中ASC-US 100例，LSIL 110例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）TCT篩查報告為ASCUS和LSIL并同時接受DH3（人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒）雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法技術(shù)行HR-HPV DNA檢測；（2）TCT報告取樣后1個月內(nèi)接受陰道鏡下活檢；（3）制備CB并行p16/Ki-67檢測；（4）非妊娠狀態(tài)；（5）既往宮頸篩查結(jié)果正常，無宮頸手術(shù)史，無任何其他惡性腫瘤史，無自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療；（6）經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院）醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（編號：［2020科］院倫審第1411號）。

1.2 方法

1.2.1 TCT制備 按TCT要求取樣，采用全自動液基細胞制片染色系統(tǒng)（沉降式）完成子宮頸脫落細胞學(xué)制片、巴氏染色。依據(jù)2014年新修訂的子宮頸細胞學(xué)Bethesda分類系統(tǒng)（the bethesda system，TBS）進行細胞學(xué)診斷，獲取ASC-US和LSIL有效樣本。

1.2.2 簡易標(biāo)準(zhǔn)化CB制備及HE染色 （1）將TCT制備后剩余子宮頸脫落細胞樣本倒入新的細胞保存液，用振蕩器震蕩2 min，將采樣器宮頸刷上的細胞充分震蕩入細胞保存液內(nèi)；（2）將保存液內(nèi)加入適量伊紅染液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清；加入95%乙醇3～4 mL震蕩均勻，靜止2 h；2 000 r/min離心5 min，棄去上清；富集樣本后轉(zhuǎn)移至濾紙包埋盒行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、制片和HE染色。制備好的CB細胞富集居中色澤鮮明清晰可見，部分病例可表現(xiàn)出類似組織學(xué)樣結(jié)構(gòu)。

1.2.3 p16/Ki-67雙染 CB切片制備后，采用粘附載玻片撈取連續(xù)2張切片，65℃烤片1 h，手動脫蠟后采用手工SOP法p16/Ki-67免疫細胞化學(xué)雙染染色，經(jīng)過：（1）高壓抗原修復(fù)；（2）浸入PBS緩沖液；（3）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加過氧化物酶阻斷劑50 μL，室溫孵育；（4）滴加混合一抗 p16/Ki-67試劑50 μL；（5）滴加混合聚合物二抗試劑（安必平）50 μL，室溫孵育；（6）滴加新鮮配制 DAB顯色液100 μL，室溫孵育；（7）滴加新鮮配制Fast-Red顯色液100 μL，室溫避光孵育；（8）蘇木素染色液復(fù)染3～5 s，蒸餾水充分沖洗；（9）PBS緩沖液返藍；（10）梯度酒精脫水、透明、中性樹膠封固。

1.2.4 HR-HPV檢測 采用DH3雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法技術(shù)對子宮頸脫落細胞行HR-HPV DNA檢測（杭州德同生物技術(shù)有限公司），包括2種HRHPV型別（HPV16、18型）和12種HR-HPV型別（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型），具體操作按說明書進行。所有檢測都以樣本測量值/參考值的比值表示，比值≥1.0，結(jié)果為“陽性”；比值＜1.0，結(jié)果為“陰性”。

1.2.5 陰道鏡檢查和活檢 使用電子陰道鏡數(shù)字成像系統(tǒng)依據(jù)陰道鏡操作規(guī)范，充分陰道鏡檢查后，立即在異常病變最嚴(yán)重的部位進行活檢，若無異常則常規(guī)3、6、9及12點行多點活檢，福爾馬林固定液固定活檢的組織標(biāo)本送至病理科。

1.2.6 結(jié)果判定 （1）細胞學(xué)診斷：采用TBS分級系統(tǒng)完成TCT制片及CB的HE染色判讀，所有病例均采用雙盲并固定2名經(jīng)驗豐富的主治醫(yī)師及副主任醫(yī)師分別閱片后共同完成結(jié)果判讀；（2）子宮頸活檢診斷：采用組織學(xué)診斷；（3）p16/Ki-67雙染判讀：筆者前期研究［3］中確定CB在整張載玻片（4張連續(xù)切片）發(fā)現(xiàn)一個陽性細胞（細胞同時p16和Ki-67特異性細胞質(zhì)棕色和細胞核紅色）即判讀為陽性；將單個細胞染色或雙染陽性細胞數(shù)＜5%定義為陰性，最終實驗結(jié)果中顯示LSIL組中CB雙染的敏感度低于TCT。本次研究將CB中p16胞質(zhì)淡黃或淺棕色，或同時具有Ki-67細胞核淺紅色顆粒，結(jié)合TCT細胞學(xué)形態(tài)，即可判讀為LSIL；p16/Ki-67雙染強陽性，結(jié)合TCT細胞學(xué)形態(tài)為HSIL；其余情況均為未見上皮內(nèi)病變或惡性病變（negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy，NILM），見圖1。

圖1 p16/Ki-67雙染判讀（×20）Fig.1 The interpretation of p16/Ki-67 dual-staining（× 20）

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 診斷以活檢組織病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，采用SPSS 22.0及Meta-DiSc1.4軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值來評價HR-HPV、CB及p16/Ki-67雙染的篩查、分流應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 LSIL組病例進行p16/Ki-67雙染分析判讀染色特征 LSIL組細胞p16/Ki-67雙染會呈現(xiàn)以下兩種情況：p16胞質(zhì)淡黃色或淺棕色，Ki-67核不染色；p16胞質(zhì)淡黃色或淺棕色，Ki-67核顯示淺紅色顆粒狀。

2.2 CB、HR-HPV及p16/Ki-67雙染三種篩查方法在ASC-US和LSIL中的診斷價值比較 明確LSIL的p16/Ki-67雙染表達模式后，在LSIL組對比不同篩查方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值結(jié)果見表1、圖2。

表1 LSIL組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結(jié)果比較Tab.1 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in LSIL group

在ASC-US組進一步分析p16/Ki-67雙染結(jié)合CB的分流，對比不同篩查方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值結(jié)果見表2、圖2。

圖2 LSIL和ASC-US組中三種篩查方法ROC曲線下面積Fig.2 The area under the ROC curve of the threescreening methods in the LSIL and ASC-US group

表2 ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結(jié)果比較Tab.2 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in ASC-US group

按照30歲進行年齡分層，LSIL組及ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結(jié)果比較見表3、4。

表3 LSIL組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結(jié)果比較Tab.3 Comparisonof HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in LSIL group

表4 ASC-US組中HR-HPV、CB和p16/Ki-67雙染結(jié)果比較Tab.4 Comparison of HR-HPV，CB and p16/Ki-67 dual-staining in ASC-US group

3 討論

HR-HPV聯(lián)合TCT檢測被廣泛應(yīng)用于宮頸癌初篩中，有效提高了敏感性［4］，由于假陽性、假陰性或一過性感染等原因，兩者的敏感度或特異度均不能滿足目前篩查子宮頸癌工作的需求，較早發(fā)現(xiàn)并成功阻斷HR-HPV持續(xù)性感染是預(yù)防CIN或子宮頸癌的關(guān)鍵。HPV是一種雙鏈閉環(huán)的DNA病毒，基因組包括E6和E7兩個主要致癌基因，分別結(jié)合機體抑癌基因p53和pRb蛋白并使其降解和失活，發(fā)生免疫逃逸，一旦E6和E7蛋白與p53和pRb親和力較大，病毒在機體持續(xù)感染，就會增加致癌風(fēng)險。HPV病毒的免疫逃逸機制包括蛋白轉(zhuǎn)錄、抗原遞呈調(diào)節(jié)、細胞因子調(diào)節(jié)以及信號通路方面調(diào)節(jié)等［5-6］。針對以上免疫逃逸機制，目前除了HPV疫苗成為子宮頸癌預(yù)防和治療較有效的方法外，尚無較滿意的預(yù)測HPV感染的生物學(xué)標(biāo)記［7］。因此，進一步選擇特異度和敏感度均較高的篩查方式是目前的工作重點。ASC-US在TCT篩查結(jié)果中僅次于NILM，是目前子宮頸癌篩查領(lǐng)域分層管理、減少不必要活檢及避免過度治療的重點關(guān)注領(lǐng)域。ASC-US并HPV陽性者推薦陰道鏡活檢，陰道鏡活檢是有創(chuàng)檢查，尤其對于年齡＜30歲或者孕期女性，易導(dǎo)致不必要的過度憂慮。單獨檢測HR-HPV易造成＞10%的宮頸癌漏診（尤其是腺癌）［8］。CB是一種評估子宮頸樣本的重要診斷工具，滿意的CB制備難度較大，成為影響病理醫(yī)師診斷準(zhǔn)確性的主要因素［9］。前期研究［10］探討了一種數(shù)控標(biāo)準(zhǔn)化（numerical control standardized，NCS）技術(shù)用于子宮頸CB的制備，效果可靠、穩(wěn)定，在獲取細胞量較少的標(biāo)本類型尤其有優(yōu)勢，但成本偏高，不易在基層病理推廣應(yīng)用。本研究經(jīng)反復(fù)實驗總結(jié)出一套CB制備流程，制備好的CB細胞集中均勻分布、成本低。FANNY等［11］研究指出，標(biāo)準(zhǔn)化制備的CB聯(lián)合p16/Ki-67雙染等其他生物學(xué)標(biāo)記較TCT診斷準(zhǔn)確性更好，可代替宮頸活檢對LSIL的進展進行分類。本研究采用CB聯(lián)合p16/Ki-67雙染作為篩查方法，在年齡＜30歲組中ASC-US具有較高的敏感度（97%）和特異度（100%），可作為較有效的生物學(xué)檢測指標(biāo)替代活檢，降低有創(chuàng)檢查比例，結(jié)論與其相符。本研究在TCT診斷LSIL病例中CB和p16/Ki-67雙染比HR-HPV檢測具有更好的敏感度（90.8%）和特異度（100%），建議使用兩者進行分流。但本研究側(cè)重探討TCT診斷為LSIL的p16/Ki-67雙染判讀，降低ASC-US占比，而不是大多數(shù)關(guān)于診斷HSIL的雙染研究［12］。

p16/Ki-67雙染是近年來備受關(guān)注的免疫細胞化學(xué)，p16蛋白是細胞周期依賴性激酶抑制劑，對細胞增殖和分裂起負調(diào)節(jié)作用，是受同細胞周期調(diào)控密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄活化因子E2F蛋白（E2F transcription factors）活化的下游靶基因，感染子宮頸上皮細胞的HR-HPV的E7蛋白能與pRb蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)后者降解或失活，致使pRb-E2F復(fù)合物中的E2F解離為游離狀態(tài)，故使其下游的靶基因p16表達上調(diào)。以上機制反映出，p16表達上調(diào)表明HPV E6和E7癌基因整合到了宿主子宮頸上皮細胞，并促進子宮頸病變的進一步發(fā)展，最終導(dǎo)致子宮頸癌變，其陽性表達可早于子宮頸細胞學(xué)形態(tài)出現(xiàn)變化之前［13］。ZHANG等［14］提出p16在與HPV感染相關(guān)的惡性腫瘤中如食管癌、口腔癌、宮頸癌等呈高表達，p16表達與CIN級別具有顯著一致性。Ki-67是增殖性細胞核抗原，可作為細胞增殖標(biāo)志物，在p16/Ki-67雙染中，隨著子宮頸CIN病變程度的進展其表達也相應(yīng)增高。正常循環(huán)細胞內(nèi)或者細胞周期仍在正常調(diào)控中時p16和Ki-67相互排斥不能同時表達，而雙染陽性提示HPV感染導(dǎo)致細胞周期調(diào)節(jié)失常［15］，并且成為區(qū)分潛在HSIL的客觀依據(jù)［12，16］。以上各項研究表明，NILM、LSIL 及HSIL均可出現(xiàn)p16/Ki-67雙染陽性表達，隨著病變級別升高，雙染陽性率占比增加，似乎與上述雙染陽性表達機制相悖，而且有研究［12］認為HSIL雙染檢測僅依據(jù)染色結(jié)果不依賴于細胞形態(tài)特征，可直接根據(jù)雙染表達情況來判讀。但上述NILM和LSIL也可出現(xiàn)雙染陽性表達情況，本研究認為p16/Ki-67雙染需要結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)綜合判讀，尤其在ASC-US和LSIL中。

綜上所述，細胞學(xué)和HR-HPV檢測提高了子宮頸癌篩查的敏感性，但同時增加了陰道鏡轉(zhuǎn)診數(shù)量。p16/Ki-67雙染細胞學(xué)檢查，無論單獨還是與其他篩查方法相結(jié)合，都可以作為HPV陽性婦女陰道鏡檢查的一種敏感而有效的檢查方法［17-18］。CB技術(shù)在子宮頸癌篩查文獻中雖報道較少，但文獻顯示CB技術(shù)對比細胞學(xué)在陽性檢出率上具有獨特優(yōu)勢，尤其CB在聯(lián)合p16/Ki-67雙染能夠彌補TCT中主觀因素導(dǎo)致的漏診及誤診，具有較高的敏感度和特異度，對于細胞量少的標(biāo)本具有顯著的優(yōu)勢，可進一步完善子宮頸癌篩查分流管理，降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，是一種可靠的子宮頸癌前病變聯(lián)合篩查方式，具有極其重要的應(yīng)用及推廣價值［1，19］。除了以上各種篩查方法，2016 年針對HPV16和HPV18的二價疫苗被中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）推出并批準(zhǔn)用于9～ 45歲人群［20］。近年研究［21］顯示，人工智能細胞學(xué)輔助閱片系統(tǒng)使子宮頸TCT對ASC-US和LSIL具有更高的敏感性，提高工作效率和診斷準(zhǔn)確率。趙涌等［22-23］認為，HPV E6/E7 mRNA篩查細胞學(xué)診斷為ASC-US、LSIL和不除外高度病變的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H）的患者效能優(yōu)于雜交捕獲法檢測13種HR-HPV，為宮頸癌篩查的分流提供了思路。研究［24］顯示，EB病毒（epstein-barrvirus，EBV）和HPV通過表觀遺傳調(diào)控與各種惡性腫瘤密切相關(guān)。研究統(tǒng)計，約有60%的宮頸癌患者癌組織存在EBV感染［25］。據(jù)此推斷子宮頸癌可能是HPV和EBV協(xié)同感染作用的結(jié)果。

本研究旨在探究創(chuàng)傷性小的、可取代活檢的檢測方法來完成宮頸癌篩查，限于樣本數(shù)量，后續(xù)仍需更多的數(shù)據(jù)來支持和驗證本研究結(jié)果。通過本研究采用的聯(lián)合篩查方法，隨訪部分患者術(shù)后3～6個月TCT結(jié)果為NILM。綜上，下一步結(jié)合人工智能細胞學(xué)輔助閱片系統(tǒng)進一步探討更加精準(zhǔn)的篩查方法，同時提高HPV疫苗接種率，盡早實現(xiàn)人類消除子宮頸癌的戰(zhàn)略目標(biāo)。