陳海明 張賢春 齊見旭

?？谑腥嗣襻t(yī)院（海口 570208）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性炎癥性疾病，已成為全球第四大常見的死亡原因，并與重大的社會和經(jīng)濟負擔相關［1］。反復的有害刺激會誘導混亂的免疫反應并促進受損上皮細胞的炎癥過程，導致組織破壞和進行性氣流受限［2］。由于各種致病機制之間的相互作用增加了COPD治療的復雜性，因此單靶點治療難以達到滿意的療效，亞細胞功能的治療性修復已成為藥物開發(fā)的重點［3］。線粒體作為一種分布廣泛且具有功能的細胞器，在氣道疾病的靶向治療中引起了越來越多的關注［4］。大量研究表明，線粒體功能障礙與氧化應激、炎癥、增殖、凋亡有關，這些都是COPD病理生理學的關鍵方面［5］。肌管蛋白相關蛋白14（myotubularin related protein 14，MTMR14）是MTM相關蛋白家族的一部分，以往研究表明MTMR14參與多種生物學過程，如細胞凋亡、炎癥和自噬［6］。PAN等［7］發(fā)現(xiàn)，MTMR14通過抑制PTEN調節(jié)的線粒體自噬來預防腦卒中，表明MTMR14參與介導線粒體功能的治療性修復。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)，MTMR14作為炎癥和肺氣腫的調節(jié)劑緩解COPD［8］。然而，MTMR14在COPD中的作用機制仍不清楚，尤其是MTMR14調節(jié)的線粒體自噬是否影響COPD中的線粒體功能尚未探索。本研究構建了香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）處理的細胞模型和COPD小鼠模型，探討MTMR14在COPD病理過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年12月至2021年12月在本院胸外科因醫(yī)療原因接受手術的參與者（年齡：40～80歲）作為研究對象。參照GOLD 2020標準診斷COPD［9］。根據(jù)肺功能和吸煙史將受試者分為兩組：對照組和COPD組。排除標準如下：（1）慢性肺部疾病，如肺纖維化、哮喘、支氣管擴張；（2）活動性肺結核；（3）腎、肝或心力衰竭；（4）目前接受吸入或口服類固醇治療。在手術切除期間收集肺組織標本（距病灶5 cm的最小距離）。研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意（倫理批件號：2019-15）。

1.2 材料

1.2.1 細胞 人氣道上皮細胞系NuLi-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。

1.2.2 動物 雄性C57BL/6J小鼠（年齡：10～12周；體質量：25～30 g）購自上海杰思捷實驗動物有限公司［生產(chǎn)許可證：［SCXK（滬）2018-0004］。在12：12 h的光/暗光循環(huán)下給小鼠喂食無菌水和食物。

1.2.3 試劑和儀器 3R4F研究卷煙購自美國University of Kentucky。 MTMR14、ATG5、ATG7、Beclin1、LC3和GAPDH抗體購自美國CST公司。熒光染料，包括MitoTracker（紅色）、LysoTracker（綠色）；BCA測定試劑盒，MitoSOX（Molecular Probes）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Cell Counting Kit-8購自自美國Sigma-Aldrich公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。RIPA裂解緩沖液購自瑞士Roche公司。IL-6和IL-8 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。H&E染色試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。線粒體分離試劑盒、ATP測定試劑盒購自上海Beyotime公司。熒光顯微鏡、IX83顯微鏡購自日本Olympus公司。Azure C300數(shù)字成像系統(tǒng)購自瑞士Axonlab公司。A1R共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司。管式光度計購自瑞士Tecan Group公司。多模式閱讀器購自美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞處理 NuLi-1細胞在不同濃度（2%～8%CSE，24 h）和時間點（0～ 48 h，6%CSE）下用CSE刺激。為了考察MTMR14過表達對暴露于CSE的NuLi-1細胞中線粒體自噬、細胞活力、線粒體氧化應激和炎癥影響，使用Lipofectamine 2000將MTMR14及其陰性對照Vector轉染NuLi-1細胞，然后將這些細胞與6%CSE一起孵育24 h。參照文獻方法獲得CSE［10］。通過將兩支香煙（3R4F）的煙霧收集到含有20 mL培養(yǎng)基的50 mL離心管中獲得CSE。使用0.22 μm過濾器對獲得的提取物進行滅菌處理，將其視為100%濃度的CSE。用細胞培養(yǎng)基稀釋制備工作濃度。

1.3.2 免疫組織化學分析 對照組和COPD組患者的支氣管組織切片與3% H2O2在室溫下孵育20 min，再與2%牛血清白蛋白一起孵育30 min，然后與MTMR14（1∶100）一抗在4℃下孵育過夜。載玻片與二抗孵育（1∶250、37℃、30 min），并用蘇木精復染。通過IX83顯微鏡分析組織切片并拍攝有代表性的照片。

1.3.3 蛋白質免疫印跡 細胞在RIPA裂解緩沖液中勻漿，并通過BCA測定法定量蛋白質濃度。通過電泳將變性蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。阻斷非特異性結合后，將膜與針對MTMR14（1∶500）、ATG5（1∶500）、ATG7（1∶500）、Beclin1（1∶1 000）、LC3（1∶1 500）或GAPDH（1∶5 000）特異性抗體在4℃下孵育過夜。通過化學發(fā)光底物將膜與物種特異性HRP綴合的二抗孵育后，使用Azure C300數(shù)字成像系統(tǒng)將蛋白質條帶可視化。

1.3.4 線粒體檢測和線粒體ROS測量 NuLi-1細胞在4%多聚甲醛中固定30 min，用0.1%Triton X-100滲透30 min，并在在含有Tween-20的磷酸鹽緩沖鹽水中用5%牛血清白蛋白封閉。將細胞用Lyso Tracker Green（75 nmol/L）染色NuLi-1細胞以觀察溶酶體，用MitoTracker Red（250 nmol/L）染色以觀察線粒體。通過A1R共聚焦顯微鏡觀察溶酶體和線粒體的共定位。將細胞與5 μmol/L MitoSOX Red在37℃下孵育10 min，并通過熒光顯微鏡在510 nm激發(fā)和580 nm發(fā)射波長下測量熒光強度。

1.3.5 細胞活力測定 細胞處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將板在37℃下孵育2 h。通過自動酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.3.6 ELISA試驗 收獲小鼠血清和細胞培養(yǎng)物上清液，然后在4℃下以3 000 r/min離心5 min。采用ELISA試劑盒測定細胞培養(yǎng)物中IL-6和IL-8水平。

1.3.7 小鼠分組處理 將小鼠隨機分為4個不同的組：對照+Vector組、CS+Vector組、對照+MTMR14組和CS+MTMR14組，每組7只。COPD小鼠模型參照前人研究［11］建立。將小鼠全身暴露于煙霧（CS）空氣中，每天約3 h（10支香煙/45 min/次，每天4次）和每周6 d，總共使用萬寶路紅香煙2周（焦油：10 mg，一氧化碳：11 mg，尼古?。?.8 mg）。將所有小鼠在室內空氣中再飼養(yǎng)2周。第22天，用PenWu裝置將50 μL獲自和元生物技術（上海）股份有限公司的MTMR14-Adeno-AAV（MTMR14）經(jīng)氣管內給藥（每只小鼠總滴度vg，一次）過表達MTMR14，并使用等量的陰性對照（NC）-AAV作為載體（Vector）對照。從第31天起，將100 μg彈性蛋白在50 μL生理鹽水氣管內給藥（q.o.d.，持續(xù)1個月），并在最后一次彈性蛋白給藥后24 h處死。對照小鼠在相同時間暴露于無CS的室內空氣和用不含彈性蛋白生理鹽水氣管內給藥。

1.3.8 肺蘇木精和伊紅（H&E）染色 將4%多聚甲醛固定的肺組織包埋在石蠟中。切片（5 μm厚）用H&E染色。為了評估肺損傷的嚴重程度，考慮了以下5個病理特征：（1）滲出液的存在；（2）嗜中性粒細胞浸潤；（3）肺泡內出血/碎片；（4）細胞浸潤；（5）細胞增生。這些病理特征中的每一個的嚴重程度通過0～5的評分來評估，如下：0，不存在/無；1、輕微；2、輕度；3、適中；4、中度；5、重度。

1.3.9 線粒體超氧化物和ATP含量測定 快速取出50 mg左葉肺組織，切成小塊，放入預冷的含有1 mmol/L PMSF的分離試劑中。然后將組織均質化并在600×g、4℃下離心5 min。將上清液轉移至另一管中，并在11 000×g、4℃下離心10 min。沉淀物含有分離的線粒體，并懸浮在儲存緩沖液中。使用MitoSOX（Molecular Probes）測定線粒體超氧化物的產(chǎn)生。用溶解在DMSO中的MitoSOX處理分離的線粒體，最終濃度為5 μmol/L。在黑暗中在37℃下孵育10 min。隨后，使用多模式閱讀器檢測MitoSOX的熒光，激發(fā)和發(fā)射波長分別為510 nm和580 nm。使用ATP測定試劑盒測定ATP濃度。將上清液添加到ATP測試工作緩沖液中。使用管式光度計測量熒光。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。使用雙側學生t檢驗分析兩組之間的差異，使用Bonferroni的事后檢驗進行單向或雙向ANOVA以進行多組之間的比較。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COPD患者氣道上皮細胞中MTMR14表達情況 與對照組織相比，COPD患者氣道上皮中MTMR14表達水平降低（圖1A）。COPD患者的氣道上皮細胞中MTMR14的蛋白表達較對照組降低，和Beclin1的蛋白表達和LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值均增加（圖1B）。

圖1 MTMR14在患者氣道上皮細胞中的蛋白表達Fig.1 Protein expression of MTMR14 in airway epithelial cells of COPD patients

2.2 CSE對人氣道上皮細胞中MTMR14表達以及自噬水平影響 在24 h內暴露于濃度增加的CSE（0～8%）降低了MTMR14的蛋白表達。此外，Beclin1的蛋白質表達和LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值在CSE處理的細胞中均以濃度依賴性方式在24 h內增加（圖2A）。當NuLi-1細胞在48 h內暴露于6%CSE時，MTMR14的蛋白表達以時間依賴性方式降低。暴露于6%CSE在12、24 h上調NuLi-1細胞中Beclin1的蛋白質水平和LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值，隨后在48 h下降（圖2B）。

圖2 Western blot檢測CSE對氣道上皮細胞中MTMR14蛋白表達以及自噬水平影響Fig.2 Western blot detection of the effect of CSE on the expression of MTMR14 protein and the level of autophagy in airway epithelial cells

2.3 MTMR14對暴露于CSE的NuLi-1細胞活力和線粒體影響 在對照組細胞中，溶酶體和線粒體位于不同的細胞區(qū)室。在6%CSE組中，NuLi-1細胞中以黃色熒光的形式檢測到溶酶體和線粒體共定位。用MTMR14預處理減弱了暴露于6%CSE的細胞中的線粒體自噬（圖3）。與對照組相比，6%CSE組中細胞活力顯著降低（P＜0.05），和線粒體ROS、IL-6、IL-8水平顯著升高（P ＜ 0.05）。用MTMR14預處理減弱了暴露于6%CSE對細胞活力、線粒體氧化應激和炎癥影響（表1）。

表1 MTMR14過表達對暴露于CSE的NuLi-1細胞中細胞活力、線粒體氧化應激和炎癥影響Tab.1 Effects of MTMR14 overexpression on cell viability，mitochondrial oxidative stress and inflammation in NuLi-1 cells exposed to CSE ±s

表1 MTMR14過表達對暴露于CSE的NuLi-1細胞中細胞活力、線粒體氧化應激和炎癥影響Tab.1 Effects of MTMR14 overexpression on cell viability，mitochondrial oxidative stress and inflammation in NuLi-1 cells exposed to CSE ±s

注：與對照組相比，**P ＜0.01、***P ＜0.001；與6%CSE+Vector組相比，#P ＜0.05、##P ＜0.01

組別對照組6%CSE組6%CSE+Vector組6%CSE+MTMR14組F值P值細胞活力（%）100.00±3.12 61.15±2.88**58.73±3.26**78.46±2.66#8.481＜0.001相對線粒體ROS 1.00±0.06 4.86±0.42***4.53±0.45***1.98±0.25##28.633＜0.001 IL-6（pg/mL）204.42±22.17 436.76±30.84***422.13±29.53***288.76±23.76##74.185＜0.001 IL-8（pg/mL）255.76±28.32 841.79±53.26***805.71±48.62***471.90±33.68##63.902＜0.001

圖3 通過LysoTracker標記的溶酶體（綠色）和MitoTracker標記的線粒體（紅色）的細胞室共定位來評估線粒體自噬Fig.3 Assessment of mitophagy by intracellular colocalization of LysoTracker-labeled lysosomes（green）and MitoTracker-labeled mitochondria（red）

2.4 MTMR14過表達改善CS誘導的COPD小鼠模型 CS能夠引起嚴重的肺損傷，表現(xiàn)出明顯的炎癥細胞浸潤、間質水腫和充血（圖4A）。與對照+Vector組相比，CS+Vector組血清炎癥標志物IL-6和IL-8水平明顯升高（P ＜0.05）（圖4B-D）。與CS+Vector組相比，CS+MTMR14組小鼠肺損傷減輕，以及IL-6和IL-8水平明顯降低（P＜0.05）（圖4）。

圖4 MTMR14過表達改善CS誘導的COPD小鼠模型（n=7）Fig.4 MTMR14 overexpression improves CS-induced COPD mouse model（n=7）

2.5 MTMR14減輕CS模型小鼠肺組織線粒體功能障礙 與對照+Vector組相比，從CS+Vector組小鼠肺中分離出的線粒體顯示出其ATP含量顯著降低（P＜0.05），以及線粒體超氧化物產(chǎn)生增加（P＜0.05）。然而，與CS+Vector組相比，從CS+MTMR14組小鼠分離的線粒體ATP含量顯著增加（P＜0.05），以及線粒體超氧化物產(chǎn)生水平降低（P＜0.05）（圖5A-C）。

與對照+Vector組相比，從CS+Vector組小鼠肺組織線粒體中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5和ATG7的蛋白水平升高。CS+MTMR14組線粒體中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5和ATG7的蛋白水平較CS+Vector組降低（圖5D）。

圖5 MTMR14減輕CSE模型小鼠肺中的線粒體功能障礙（n=7）Fig.5 MTMR14 attenuates mitochondrial dysfunction in the lungs of CSE model mice（n=7）

3 討論

對COPD患者支氣管活檢的研究報告了炎癥基因和蛋白的表達增加，以及支氣管上皮細胞的結構改變［12-13］。煙霧誘導的炎性細胞因子上調可能與COPD患者的肺功能、疾病嚴重程度和臨床結果相關［14］。線粒體自噬是維持生理細胞功能所必需的，然而在COPD患者中過度的線粒體自噬可能會導致疾病的進展［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在COPD小鼠和COPD患者中報告了線粒體自噬失調［16］。與線粒體自噬相關，parkin RBR E3泛素蛋白連接酶的過表達足以誘導線粒體自噬并促進CSE暴露的氣道上皮細胞中線粒體ROS的產(chǎn)生以及細胞衰老［17］。因此，上調的氣道上皮線粒體自噬可能會加劇COPD的進展［18］。本研究測定了COPD患者原發(fā)性氣道上皮細胞的自噬水平，并發(fā)現(xiàn)COPD患者的原發(fā)性氣道上皮細胞中自噬標志物Beclin1、LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值顯著增加。這些數(shù)據(jù)支持氣道上皮線粒體自噬參與COPD的發(fā)病機制。

最近的研究報告了MTMR14參與人類疾病。YANG等［19］研究表明自噬相關基因MTMR14在結直腸癌中下調，通過上調MTMR14可促進結直腸癌細胞凋亡。與此一致，缺乏MTMR14的小鼠表現(xiàn)出高脂飲食誘導的脂質積累和炎癥加速［20］。本研究中，MTMR14在COPD患者和CSE刺激的NuLi-1細胞中的表達下調，并且MTMR14過表達部分抑制了CSE誘導的炎癥、活力降低和氧化應激。體內研究證實MTMR14在COPD模型小鼠中抑制炎癥和肺氣腫的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)表明，MTMR14通過抑制炎癥反應在COPD中發(fā)揮保護作用。氣道上皮細胞線粒體是炎癥小體激活、ROS產(chǎn)生、細胞凋亡和免疫反應的重要貢獻者［21-22］，所有這些都與COPD相關。因此，氣道上皮細胞中的線粒體損傷被認為有助于COPD的發(fā)病機制。

線粒體是反應性物種的關鍵細胞來源，也是能夠產(chǎn)生能量的細胞的動力室。線粒體結構的整合、線粒體鈣的平衡、線粒體膜電位的穩(wěn)定以及通過有絲分裂迅速清除受損線粒體，可維持線粒體內穩(wěn)態(tài)和線粒體功能障礙［15］。線粒體功能障礙在調節(jié)炎癥、氧化應激和凋亡方面起著關鍵作用，這些與慢性呼吸道疾病的發(fā)病機制有關，例如肺纖維化和COPD［23］。越來越多的證據(jù)表明，COPD患者的線粒體功能障礙主要表現(xiàn)為ROS增加、線粒體膜電位降低、線粒體結構破壞和線粒體吞噬失衡［24］。本研究證實了這些發(fā)現(xiàn)，筆者在COPD小鼠肺組織中分離出的線粒體顯示出其ATP含量顯著降低，以及線粒體超氧化物產(chǎn)生增加，表明線粒體存在功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，CSE誘導的過度線粒體自噬導致炎癥和細胞損傷加重，而通過抑制CSE誘導的線粒體自噬改善線粒體功能障礙，延緩細胞衰老，并最終抑制病理性COPD進展［25］。本研究結果表明，MTMR14過表達抑制COPD小鼠肺組織過度線粒體自噬，這一病理改變可能參與改善線粒體功能障礙。

總之，本研究結果提供了MTMR14在COPD中的保護作用的相關證據(jù)。MTMR14過表達減輕COPD的炎癥和肺氣腫，這在一定程度上取決于線粒體功能和線粒體自噬的調節(jié)。然而，研究并沒有對MTMR14介導的下游通路進行分析。在未來的研究中，將進一步探索MTMR14如何調節(jié)線粒體自噬，旨在明確MTMR14在COPD發(fā)展中的臨床價值和潛在機制。