胡俊 談榮珍 袁忠 楊盼盼 張楚焌 張斌 沈云峰

1南昌市洪都中醫(yī)院骨傷七科（南昌 330008）；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科（南昌 330006）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種主要好發(fā)于絕經(jīng)后婦女、常見的系統(tǒng)性骨骼疾病，其特征是骨微結(jié)構(gòu)損傷或骨量減少，最終導(dǎo)致骨脆性增加和骨折風(fēng)險上升［1］。目前國內(nèi)40歲以上的人群中被確診為骨質(zhì)疏松癥占3.2%，65歲以上老年人群的確診率則達(dá)到了驚人的32.0%［2］。所以，骨質(zhì)疏松癥的防治具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義。而目前雙磷酸鹽類藥物作為主要的抗骨質(zhì)疏松治療手段，常伴隨著患乳腺癌，下頜壞死或不典型股骨骨折等副作用［3］。因此，中藥在骨質(zhì)疏松癥中的治療作用逐漸受到重視，其療效也被得到越多臨床和基礎(chǔ)研究的證實［4-5］。

鎖陽為具有補(bǔ)腎益精作用的鎖陽科植物，多見于新疆、青海、內(nèi)蒙古等地的，也常作為治療骨質(zhì)疏松的中藥方劑中的重要組成［6］。雖然鎖陽多糖（cynomorium songaricum polysaccharide，CSP）作為鎖陽的主要有效成分之一［7］，但其促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用仍未得到充分地闡明，有待進(jìn)一步深入研究。PI3K/Akt通路是一種在哺乳動物中具有廣泛調(diào)控作用的通路，對多種細(xì)胞的增殖和凋亡都起著重要作用［8-9］。 激活的蛋白激酶B（Akt）可磷酸化糖原合酶激酶3β（GSK3β），并進(jìn)一步調(diào)控Wnt/β-catenin通路，從而對骨代謝過程產(chǎn)生影響［10-11］。本研究目的在于觀察CSP對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響，并進(jìn)一步驗證CSP是否通過調(diào)控PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路起效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 從中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫購入的MC3T3-E1細(xì)胞株。CSP從寧夏香草生物技術(shù)有限公司購入；成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)茜素紅染液和β-catenin免疫熒光染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NVP-BEZ235（BEZ）購自Selleck公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Western Blot抗體購自Cell signaling公司。蛋白免疫印跡所用的電泳儀/電轉(zhuǎn)儀和實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測MC3T3-E1的細(xì)胞活性

利用MTT試驗來觀察不同濃度的CSP（0、25、50、100 μg/mL）對生長期對數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響。每組設(shè)3個復(fù)孔。按說明書流程在CSP干預(yù)后的第1、3、5、7天，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量吸光度，以定量觀察MC3T3-E1的增殖活力。

1.2.2 茜素紅染色 將生長至對數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞種于24孔板中；24 h后待細(xì)胞貼壁，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸、1×10-8mol/L地塞米松）培養(yǎng)，并根據(jù)不加CSP、加入100 μg/mL CSP、同時加入100 μg/mL CSP及50 μmol/L BEZ，將細(xì)胞分為Con組、CSP組及CSP+BEZ組。每3 d換液1次，干預(yù)14 d后對各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，顯微觀察每組的礦化結(jié)節(jié)情況。

1.2.3 Real-time PCR測定相關(guān)成骨分化mRNA的表達(dá)水平 在6孔板中，用不含、含100 μg/mL CSP、100 μg/mL CSP 及 50 μmol/L BEZ 的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，每3 d換液。待細(xì)胞成骨分化14 d后，提取細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增。Real-time PCR引物序列如下：GAPDH-正義鏈5'-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3'，反義鏈5'-CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3'；Runx2-正義鏈 5'-GCTT-CATTCGCCTCACAAAC-3'，反義鏈 5'-GTAGTGA-CCTGCGGAGATTAAC-3'；Osteocalcin-正義鏈 5'-AAATAGCCCTGGCAGATTCC-3'，反義鏈5'-CAGC-CTCCAGCACTGTTTAT-3'；β-catenin-正義鏈5'-CT-TCACCTGACAGATCCAAGTC-3'，反義鏈5'-CCTTCCATCCCTTCCTGTTTAG-3'；Collagen I-正義鏈 5'-CTAAAGGCGAACCTGGTGAT-3'，反義鏈5'-TCCAGGAGCACCAACATTAC-3'。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)。通過Ct值計算2-△△Ct結(jié)果，將目的基因的結(jié)果與GAPDH內(nèi)參基因結(jié)果相除以標(biāo)準(zhǔn)化mRNA的表達(dá)水平。

1.2.4 Western Blot檢測相關(guān)蛋白 干預(yù)方式同1.2.2，每組含3組重復(fù)。14 d后通過RIPA裂解液提取孔內(nèi)的蛋白，進(jìn)行蛋白濃度計算后，配置好10%的蛋白電泳膠后，每孔加入20 μL蛋白樣本進(jìn)行電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉和一抗過夜孵育。其中鼠抗人一抗：Runx2、Osteocalcin、Collagen Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、βcatenin、β-actin；室溫下二抗孵育2 h并用TBST洗膜后，使用ECL曝光液進(jìn)行曝光，分析條帶的曝光強(qiáng)度。

1.2.5 免疫熒光檢測β-catenin的表達(dá) 待細(xì)胞成骨分化14 d后，去除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，并使用0.1%的曲拉通透膜20 min。每孔細(xì)胞經(jīng)歷20 min血清封閉后，加入β-catenin一抗放置于4℃冰箱中過夜。次日加入熒光二抗在室溫條件下孵育2 h；經(jīng)DAPI避光染色2 min后，在暗室內(nèi)通過熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，兩組間計量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSP濃度對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

MC3T3-E1細(xì)胞在不同濃度的CSP干預(yù)7 d后，未見明顯細(xì)胞毒性；與其他濃度比較，100 μg/mL CSP在1～7 d里，促細(xì)胞增殖效果均更加明顯（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度CSP對MC3T3-E1增殖影響Fig.1 Effects of CSP at different concentrations on the proliferation of MC3T3-E1

2.2 CSP對MC3T3-E1成骨分化影響 CSP干預(yù)14 d后，鈣化結(jié)節(jié)明顯增多，面積顯著高于對照組（P＜0.01），但加PI3K阻斷劑后CSP的促進(jìn)作用明顯被減弱（P＜0.01）。見圖2。

圖2 CSP干預(yù)14 d對MC3T3-E1成骨分化的影響Fig.2 The effect of CSP for 14 days on osteogenic differentiation of MC3T3-E1

2.3 CSP對相關(guān)成骨分化mRNA表達(dá)的影響

CSP干預(yù) 14 d后，Runx2、β-catenin、Osteocalcin、Collagen I mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05）；但是加入PI3K阻斷劑干預(yù)后，CSP對成骨相關(guān)mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用被明顯削弱（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CSP干預(yù)14 d對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的影響Fig.3 The effect of CSP for 14 days on osteoblastic differentiation markers of MC3T3-E1 Cells

2.4 CSP對成骨相關(guān)蛋白的影響 CSP干預(yù)14 d后，Runx2、Collagen I、Osteocalcin的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05）；但是PI3K阻斷劑明顯逆轉(zhuǎn)CSP對成骨相關(guān)蛋白的促進(jìn)作用（P＜0.05）。見圖4。

圖4 CSP干預(yù)14 d對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effects of CSP at different concentrations on osteogenic differentiation-related proteins of MC3T3-E1 cells

2.5 CSP對PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響 使用CSP干預(yù)14 d后，Akt、GSK3β蛋白表達(dá)無明顯變化；但PI3K、p-PI3K、Akt、GSK3β、β-catenin蛋白經(jīng)CSP干預(yù)后表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.01）；而加入BEZ后則明顯逆轉(zhuǎn)了上述蛋白水平的增加趨勢（P＜0.05）。見圖5。

圖5 CSP干預(yù)14 d對PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響Fig.5 The effect of CSP for 14 days on PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin signaling pathway related proteins

2.6 CSP對β-catenin蛋白核移位的影響 使用CSP干預(yù)14 d后，CSP組的β-catenin蛋白核位移現(xiàn)象明顯多于對照組；而CSP+BEZ基本觀察不到核位移。見圖6。

圖6 CSP對β-catenin蛋白核移位的作用Fig.6 The effect of CSP on the nuclear translocation of β-catenin protein

3 討論

本研究經(jīng)PCR、Western Blot等實驗證明CSP可有效促進(jìn)Runx2、β-catenin、Osteocalcin、CollagenⅠ這些成骨相關(guān)的mRNA表達(dá)水平，并且可促進(jìn)β-catenin入核。Runx2在成骨早期階段表達(dá)，對細(xì)胞的功能、成骨分化起到重要的調(diào)控作用；而Osteocalcin、Collagen I則是鈣沉積和成骨分化的重要標(biāo)志［12-13］。茜素紅染色實驗也從表型上證明了CSP促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用；CSP對成骨相關(guān)蛋白的促進(jìn)作用也得到Western Blot實驗結(jié)果驗證。Western Blot實驗則進(jìn)一步揭示了這一促進(jìn)作用背后可能涉及到PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路；加入PI3K抑制劑后上述作用均被明顯逆轉(zhuǎn)，因此反向加強(qiáng)驗證了CSP促成骨分化的作用。

既往有研究指出，鎖陽乙醇提取物可明顯減少去卵巢大鼠的骨丟失，相關(guān)分子機(jī)制可能與血清成骨標(biāo)志物ALP、OCN表達(dá)增加、破骨標(biāo)志物TRAP、CTSK表達(dá)減少及GSH-PX和SOD、抑制MDA等氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性提高有關(guān)［14］。CSP也被證實具有改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松作用，作用機(jī)制可能與其提高雌激素水平、增加OPG/RANKL蛋白比例有關(guān)［15］。但未見其在PI3K/Akt通路相關(guān)領(lǐng)域的研究，基于此，本研究繼續(xù)深入CSP促進(jìn)成骨分化的可能機(jī)制。

在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等重要的過程，PI3K/Akt信號通路均廣泛參與，并扮演至關(guān)重要的調(diào)控角色。新近研究也發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的增加也與該通路的激活密切相關(guān)［16-17］。另一方面，抑制PI3K/Akt通路會降低ALP、OCN、Osterix、和Runx2的表達(dá)水平，因此抑制成骨細(xì)胞分化［18］。此外，GSK-3β作為該通路的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)之一，Akt能夠明顯抑制GSK-3β的磷酸化致其失活，降低對β-catenin的降解作用，讓更多的βcatenin入核促進(jìn)下游的促細(xì)胞增殖、成骨基因表達(dá)［19-20］。提示PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路在成骨分化過程中至關(guān)重要。本研究也發(fā)現(xiàn)其參與了CSP的促成骨分化過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CSP促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞成骨分化的機(jī)制與其增加成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)、促進(jìn)β-catenin入核有關(guān)，而其中PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，但仍待動物體內(nèi)實驗作進(jìn)一步驗證。