徐志紅，陳磊垚，許立，徐德榮

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院藥學部，南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，南京 210046)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease，IBD) 的一種，其特點是腹部疼痛，并伴有帶血腹瀉、疲勞、直腸出血和體質量下降[1]。環(huán)境因素和遺傳因素是導致UC的兩大要素，二者相互作用可導致腸道發(fā)生免疫反應和炎癥[2]。異常激活的核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)促進促炎癥細胞因子轉錄，呈炎癥反應放大現(xiàn)象，決定UC的發(fā)生與發(fā)展[3]。在IBD患者中，結腸上皮細胞和黏膜巨噬細胞上發(fā)現(xiàn)了NF-κB活化[4]。根據(jù)NF-κB表達水平可判斷UC的嚴重程度和藥物干預效果[5]。激活Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3 (NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)導致caspase-1活化[6-7]、成熟白細胞介素(IL)-1β釋放[8]，通過激活淋巴細胞、促進白細胞在損傷或感染部位的滲透，參與全身和局部感染反應的產生[9]。據(jù)報道，NLRP3基因多態(tài)性與人類患IBD的風險呈正相關[10]。NF-κB和NLRP3軸可能是開發(fā)IBD新療法的潛在靶點。木蘭花堿是中草藥木蘭和馬兜鈴的主要活性成分。LI等[11]發(fā)現(xiàn)大劑量木蘭花堿具有較強的抗炎作用，可以抑制一氧化氮(NO)的產生，保護小鼠巨噬細胞免受脂多糖誘導的凋亡。木蘭花堿通過負調控MAPK信號通路的Braf蛋白，抑制銅綠假單胞菌PAK株誘導的炎癥反應[12]。GUO等[13]關于木蘭花堿對脂多糖誘導的體內外急性肺損傷的抗炎作用研究表明，木蘭花堿可劑量依賴性降低促炎細胞因子的表達。但是，筆者尚未見木蘭花堿治療UC的相關報道。本實驗擬考察木蘭花堿對UC模型大鼠的緩解作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 木蘭花堿(上海梵態(tài)生物科技有限公司，含量≥98%，批號：FT10031227)，3%葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS，德國MP Biomedicals公司，批號：S3045)，IL-1β(批號：ab22957)、IL-18(批號：ab24562)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號：22784)等酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自美國Abcam公司，F(xiàn)ITC anti-CD11b(批號ab12452)、NLRP3(批號：ab13544)、IKKβ-1(批號：ab34631)、Iκβα(批號：ab32524)、p-IκBα(批號：ab34246)、p-IKKβ(批號：ab41744)、p-NF-κB p65(批號：abs124475) 等抗體均購自美國Abcam公司，cleaved caspase-1抗體(上海愛必信生物科技有限公司，批號：abs143596)，其他試劑和化學品均來自標準的商業(yè)公司。

1.2實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，6～8周，體質量(200±20) g，購自南通大學，合格證號：SCXK(蘇)2019-0001。自由飲用食物和水，溫度25 ℃，濕度45%。

1.3儀器 酶標儀(美國MD公司，型號SpectraMax 190)；熒光顯微鏡(日本 Olympus公司，型號IX71)；石蠟切片機(德國Medite公司，型號M530)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號5430R)。

1.4造模與分組 SD大鼠進入SPF級動物實驗中心適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、5-氨基水楊酸組(100 mg·kg-1)和木蘭花堿小、中、大劑量組(25，50，100 mg·kg-1)，每組10只，根據(jù)相關文獻造模[14]。自實驗第1天開始，正常對照組大鼠灌胃純凈水，其余5組大鼠灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)10 d 。第11天，處死大鼠后解剖取結腸組織，一部分冷凍(-80 ℃)保存，一部分用10%甲醛溶液固定，用于后續(xù)分析。

1.5疾病活動指數(shù)分析(disease activity index，DAI) 評估大鼠DAI，指標包括質量、大便性狀、便血情況。

1.6髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性分析 稱取大鼠結腸組織50 mg，冰上充分勻漿后取上清液，依據(jù)MPO試劑盒說明書中方法測定MPO活性。

1.7蘇木精-伊紅(HE)染色及病理組織學評分 大鼠結腸組織置于10%甲醛溶液固定，包埋后切片(厚度5 μm)，HE染色，顯微鏡下觀察并攝像。根據(jù)以下5個參數(shù)評分，①病變范圍：0分=0%，1分=1%～25%，2分=26%～50%，3分=51%～75%，4分=76%～100%；②病變深度：0分=無損傷，1分=黏膜上皮，2分=黏膜固有層，3分=黏膜下層，4分=肌層和漿膜層；③隱窩損傷：0分=無損傷，1分=1/3隱窩損傷，2分=2/3隱窩損傷，3分=隱窩缺失或者表面上皮完整，4分=隱窩、表面上皮兩者都缺失；④炎癥細胞浸潤：0分=無浸潤，1分=輕微浸潤，2分=輕度浸潤，3分=中度浸潤，4分=重度浸潤；⑤纖維組織增生：0分=無增生，1分=輕微增生，2分=輕度增生，3分=中度增生，4分=重度增生。

1.8ELISA法檢測炎癥因子含量 結腸組織中炎癥細胞因子(IL-1β、IL-18和TNF-α)根據(jù)相應ELISA試劑盒的操作步驟進行定量分析。

1.9Western blotting分析蛋白表達 提取組織蛋白后，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒定量分析，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophore-sis，SDS-PAGE)凝膠分離，轉膜，脫脂牛奶封閉1.5 h。分別加入一抗稀釋液：IκBα、p-IκBα、p-IKKβ、p-NF-κB p65、NLRP3、IKKβ、cleaved caspase-1，4 ℃，過夜。TBST洗膜后加入二抗，孵育1 h。TBST洗膜后加入化學發(fā)光試劑，用電化學發(fā)光法監(jiān)測蛋白表達，Image J軟件分析灰度值。

1.10免疫組化分析 被石蠟包埋的結腸組織切片(厚度5 μm)，脫蠟，修復抗原，雙氧水滅活內源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白(albumin from bovine serum，BSA)封閉后滴加1：200稀釋的一抗(p-NF-κB p65、NLRP3、cleaved caspase-1)，4 ℃過夜后，加二抗后滴加現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB )顯色液，然后用蘇木精染核，封片，顯微鏡下觀察后攝像。

1.11免疫熒光分析 被石蠟包埋的組織切片后，依次進行脫蠟、水化、修復、1%磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、10%山羊血清封閉等操作后，滴加提前稀釋的直標的熒光抗體(CD11b-FITC)，避光4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染液，避光孵育0.5 h。PBS洗滌后加防熒光猝滅劑，最后用鑷子夾取蓋玻片封片。熒光顯微鏡觀察，分析結果。

2 結果

2.1木蘭花堿對DSS誘導UC大鼠一般狀態(tài)、DAI評分和MPO活性的影響 正常對照組大鼠毛發(fā)光澤鮮亮，活潑好動，正常飲食和排便；模型對照組大鼠飲用DSS溶液第2天，毛發(fā)色澤暗淡，活動減少，體質量減輕，稀便，上述癥狀隨著時間延長加重，并出現(xiàn)便血；用5-氨基水楊酸和木蘭花堿干預后，可不同程度改善上述病癥。治療結束后，與正常對照組比較，模型對照組DAI評分顯著提高(P<0.01)；木蘭花堿中、大劑量組DAI評分明顯低于模型對照組(P<0.01)，其中大劑量組DAI評分最低；木蘭花堿小劑量組DAI評分顯著高于5-氨基水楊酸組(P<0.05)，但是木蘭花堿中、大劑量組DAI評分與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計學意義。模型對照組MPO含量較正常對照組增加(P<0.01)；木蘭花堿中、大劑量組可逆轉模型對照組中MPO值升高(P<0.01)，其中木蘭花堿大劑量組MPO值最低；木蘭花堿小、中劑量組MPO值顯著高于5-氨基水楊酸組(P<0.05，P<0.01)，木蘭花堿大劑量組MPO值與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 6組大鼠DAI、MPO比較

2.2結腸組織病理形態(tài)的改變 正常對照組中大鼠結腸上皮結構完整清晰，固有層炎癥細胞數(shù)量不變，黏膜腺體整齊完好，黏膜下層、肌層、漿膜層無病變特征。模型對照組大鼠可見杯狀細胞丟失，黏膜層和黏膜下層炎癥細胞浸潤嚴重，隱窩結構損壞；DSS引起大鼠的病理組織學評分顯著提高(P<0.01)。木蘭花堿小、中、大劑量及5-氨基水楊酸均可以減輕結腸組織損傷，顯著改善結腸組織結構(圖1)。5-氨基水楊酸組和木蘭花堿各劑量組大鼠病理組織學評分較模型對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；木蘭花堿3個劑量組中大劑量組的病理組織學評分最低；木蘭花堿各劑量組病理組織學評分高于5-氨基水楊酸組，其中小、中劑量組與5-氨基水楊酸組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.5-氨基水楊酸組；D.木蘭花堿小劑量組；E.木蘭花堿中劑量組；F.木蘭花堿大劑量組。①與正常對照組比較，P< 0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05；④與5-氨基水楊酸組比較，P<0.01(F=103.500)。

2.3木蘭花堿調節(jié)細胞炎癥因子的表達 IL-1β、IL-18和TNF-α等 3個促炎癥細胞因子含量在UC大鼠結腸組織中明顯增加。與模型對照組比較，5-氨基水楊酸組大鼠結腸組織中上述 3個促炎癥細胞因子含量降低(P<0.05或P<0.01)，且木蘭花堿各劑量組大鼠炎癥因子含量不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；與5-氨基水楊酸組比較，木蘭花堿小劑量組IL-1β和 3個不同劑量組IL-18、小劑量組TNF-α均顯著增加(均P<0.05)；木蘭花堿 3個不同劑量組中，大劑量組IL-1β、IL-18、TNF-α的含量最低(圖2)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.5-氨基水楊酸組；D.木蘭花堿小劑量組；E.木蘭花堿中劑量組；F.木蘭花堿大劑量組。①與正常對照組比較，P< 0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與5-氨基水楊酸組比較，P<0.05；④與模型對照組比較，P<0.05(F=34.822～55.787)。

2.4結腸組織中CD11b+巨噬細胞數(shù)量 因圖1，2提示木蘭花堿大劑量對UC的療效較好，故免疫熒光法檢測中以木蘭花堿大劑量組為代表。結果顯示，與正常對照組大鼠比較，模型對照組大鼠結腸組織中CD11b+巨噬細胞數(shù)量明顯增加。與模型對照組比較，木蘭花堿大劑量組大鼠結腸組織中CD11b+巨噬細胞數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖3 3組大鼠結腸組織中CD11b+巨噬細胞免疫熒光分析(×200)

2.5木蘭花堿抑制NF-κB激活 與正常對照組比較，模型對照組細胞核中p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白表達顯著增加(P<0.01)，而細胞質中p-NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.01)，IκBα、IKKβ兩個蛋白水平基本沒有變化。木蘭花堿各劑量組結腸組織中p-IκBα、p-IKKβ和細胞核p-NF-κB p65蛋白表達較模型對照組降低(P<0.05或P<0.01)，細胞質p-NF-κB p65蛋白表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IκBα、IKKβ蛋白水平亦無明顯變化。木蘭花堿各劑量組中，細胞質p-NF-κB p65蛋白在木蘭花堿大劑量組中表達最高，細胞核p-NF-κB p65蛋白在木蘭花堿中劑量組中表達最低，p-IκBα蛋白在木蘭花堿大劑量組中表達最低，而p-IKKβ蛋白在木蘭花堿 3個劑量組中表達基本一致，見圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。①與正常對照組比較，P< 0.01；②與模型對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.01( F=42.544～75.734)。

2.6木蘭花堿抑制NLRP3炎性小體活性 由免疫組化結果可知，模型對照組NLRP3蛋白表達較正常對照組增加(圖5)。Western blotting法分析結果亦表明，DSS能夠提高大鼠結腸組織中NLRP3、cleaved caspase-1和ASC蛋白表達水平(P<0.01)。但是，木蘭花堿中、大劑量組大鼠結腸組織中NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表達水平降低(P<0.01)，其中大劑量組中NLRP3蛋白含量最低，中劑量組與大劑量組中cleaved caspase-1蛋白含量基本一致；木蘭花堿小、中、大劑量組大鼠ASC蛋白表達水平降低(P<0.01)，其中大劑量組最低(圖6)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。①與正常對照組比較，P< 0.01；②與模型對照組比較，P<0.01(F=34.132～74.964)。

3 討論

目前，治療UC的傳統(tǒng)藥物有氨基水楊酸類、糖皮質激素類和免疫抑制劑類等三大類，本研究選擇5-氨基水楊酸為陽性對照藥。結果顯示，5-氨基水楊酸組和木蘭花堿小、中、大劑量組UC模型大鼠的病理特征均明顯改善，其中，木蘭花堿小、中劑量組病理組織學評分顯著大于5-氨基水楊酸組，而大劑量組與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計學意義。研究表明，IBD患者體內TNF-α、IL-1β和IL-18等促炎細胞因子水平較健康受試者升高[6]。TNF-α已被證明通過誘導血管通透和血管生成、增加巨噬細胞和T細胞產生促炎細胞因子、引起屏障破壞和促進腸上皮細胞死亡，發(fā)揮多種促炎功能[15]。抑制TNF是目前常用的治療IBD的方法[16]。IL-1β和IL-18是結腸炎早期炎癥級聯(lián)反應是必不可少的[17]。IBD患者的血清和黏膜活檢中IL-1β和IL-18表達水平升高[18]。本研究中，木蘭花堿可顯著抑制DSS誘導的UC大鼠結腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量。這可能與局部炎癥反應的分子變化有關。先天免疫系統(tǒng)參與了DSS誘導的腸道炎癥，這一觀點已被廣泛接受[19]。木蘭花堿小劑量組IL-1β、TNF-α與小、中、大劑量組IL-18顯著高于5-氨基水楊酸組，但是中、大劑量組IL-1β、TNF-α與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計學意義。提示5-氨基水楊酸和木蘭花堿對UC均有療效，但是5-氨基水楊酸優(yōu)于木蘭花堿，這可能與治療周期、給藥途徑、給藥劑量等因素有關，尚待進一步研究。IBD患者體內巨噬細胞的數(shù)量較健康受試者顯著增加[20]。而且，巨噬細胞在UC模型中比例亦增加[21]。本研究顯示，木蘭花堿可降低DSS誘導的模型對照組大鼠結腸組織中巨噬細胞浸潤。

在應對炎癥因子、脂多糖或氧化劑等刺激時，IκBα被快速降解和磷酸化，激活NF-κB二聚體的釋放和易位進入細胞核，從而上調靶基因的轉錄[22-23]。與正常對照組比較，UC大鼠結腸組織細胞核p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白含量明顯增加，細胞質中p-NF-κB p65蛋白表達下降，說明NF-κB被DSS激活。木蘭花堿治療后，細胞核p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白含量下降，與DU等[24]研究羧胺三唑治療UC的結果一致。以上結果表明，木蘭花堿治療UC可能與抑制NF-κB活性有關。

NLRP3炎性小體主要由巨噬細胞產生，與UC密切相關[25]。在急性UC的誘導過程中，NLRP3炎性小體被活化，巨噬細胞中產生更多的IL-1β[26]。BAUER等[27]證實小鼠NLRP3缺陷可抵抗DSS誘導的結腸炎。此外，F(xiàn)ILARDY等[28]發(fā)現(xiàn)轉錄后NLRP3失去控制與結腸炎癥有關。本研究顯示，UC模型對照組大鼠的結腸組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達較正常對照組升高，而木蘭花堿可逆轉上述蛋白含量的升高。說明木蘭花堿可通過抑制NLRP3炎性小體活性發(fā)揮治療UC作用。

綜上所述，木蘭花堿可減輕DSS誘導的UC的嚴重程度，降低炎癥細胞因子含量，抑制NF-κB信號通路和NLRP3炎性小體活性。提示木蘭花堿可能作為一種治療UC的候選藥物。