谷長維，胡博，2*，劉微

[1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，吉林 長春 130112；3.吉林省維民知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)，吉林 長春 130000]

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 是一種α-冠狀病毒，可導(dǎo)致各年齡段豬暴發(fā)高度接觸性腸道疾病[1]。PEDV 自2013 年在美國中西部出現(xiàn)以來，已在美洲大部分地區(qū)流行，使養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)了重大的經(jīng)濟損失[2]。流行區(qū)的控制措施是針對建立PEDV 母豬免疫力和控制PEDV感染。母源免疫在保護新生仔豬抵抗PEDV感染中起關(guān)鍵作用。商業(yè)性疫苗、肌內(nèi)注射給藥，只有在口服暴露于活的PEDV(反饋)后，才能夠增強PEDV 的免疫力，這是實現(xiàn)強烈、快速、持久刺激腸道黏膜免疫的唯一途徑[3]。多項PEDV 抗體試驗，包括免疫熒光試驗(immunological fluorescence assay，IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、病毒中和(virus neutralization，VN) 和熒光聚焦中和(fluorescence focus neutralization，F(xiàn)FN)[4]，特別是評估PEDV 中和抗體水平(VN、FFN) 為評估和預(yù)測豬群免疫力提供了有價值的工具[5]。VN 檢測試劑盒在常規(guī)使用中存在固有的弱點：檢測結(jié)果具有主觀性，因為反應(yīng)是由人評價的，檢測的重復(fù)性受到細胞增殖和病毒復(fù)制的運行間變異的影響，并且涉及的生物過程通量較慢。PEDV FFN 試驗是VN 試驗的改良版，由試驗人員讀取結(jié)果，并根據(jù)相對于對照樣本的熒光減少解釋響應(yīng)。具體而言，抗體滴度報告為最高稀釋度的倒數(shù)，導(dǎo)致熒光聚焦單位(fluorescence focus units，F(xiàn)FU)相對于病毒對照孔減少超過90%。FFN 不依賴于檢測病毒致細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE) 的事實意味著該檢測具有更短的周轉(zhuǎn)時間[6](即，可在20～24 h 內(nèi)讀取平板，而VN 為3 d)。盡管如此，F(xiàn)FN 保留了VN的一些缺點，包括直接觀察熒光染色的感染細胞是主觀的、勞動密集型的和耗時的[6]。與其他方法相比，據(jù)報道成像細胞計數(shù)是檢測中和抗體(如水泡性口炎病毒和腺病毒)的一種客觀、快速、可重復(fù)、特異性和半自動的方法。我們評估了基于成像細胞術(shù)的PEDV 高通量中和試驗(high-throughput neutralization assay，HTNT)的性能。

1 材料和方法

1.1 材料

Vero 81 細胞(ATCC CCL-81；美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基(DMEM 培養(yǎng)基；美國MilliporeSigma 公司)，10%熱滅活胎牛血清[(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)；美國Atlas 生物制品公司]和1%青霉素-鏈霉素(美國Grand Island 生物制品集團公司)。

1.2 方法

用從感染PEDV 的仔豬上采集的材料接種20 頭9 周齡豬，隨時間采集樣本，獲得已知PEDV 抗體狀態(tài)的血清樣本(n=159)。為驗證其PEDV 陰性狀態(tài)，在接種后第4 天(days post inoculation，DPI) 采集所有豬的血清和口腔液體標本，通過PEDV IgG ELISA 和逆轉(zhuǎn)錄實時PCR(realtime-reverse transcription polymerase chain reaction，RT-rtPCR)進行檢測。將約15 g 切碎的PEDV RT-rtPCR 陽性腸道組織(田間樣本)與500 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4；美國Grand Island 生物制品集團公司) 混合，制備注射豬的PEDV 接種物。DPI 0 時，使用噴霧器(美國Chapin公司)將接種物噴入每頭豬的鼻孔中5 s。通過PEDV RT-rtPCR 檢 測DPI -7、DPI 0 和DPI 7 采集的個體豬的糞便樣本，以確認生產(chǎn)性感染。

在第-4、0、7、14、21、28、35 和42天，從頸靜脈或顱腔靜脈采集用于抗體檢測的血液樣本，并將血清儲存在-80 ℃的2 mL低溫試管(德國Greiner Bio-One 公司) 中直至檢測。從接種PEDV 的豬上采集血清樣本(n=159)，隨機排序，隨后通過HTNT 和FFN檢測PEDV 中和抗體。

在含2 μg/mL 甲苯磺?；鵏-苯丙氨酸氯甲基酮(tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone，TPCK)處理的胰蛋白酶的病毒接種培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM 培養(yǎng)基) 中10 倍連續(xù)稀釋(10-1～10-8) 病毒貯備液，然后向含融合Vero 81 細胞的96 孔板的5 個孔中加入100 μL 各稀釋液，進行病毒滴定。不含病毒的病毒接種培養(yǎng)基用作陰性對照。將平板置于37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中孵育5 d，或直至觀察到細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。使用Spearman+K?rber 方法計算病毒滴度，并表示為50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/mL[7]。

在PEDV HTNT 中使用透明平底、黑色聚苯乙烯、組織培養(yǎng)處理的96 孔板(美國Corning 生命科學(xué)公司)，以避免使用成像細胞儀(配備MiniMax 300 成像細胞儀的Spectra Max i3 多模式酶標儀平臺；美國Molecular Devices 公 司) 用SoftMax Pro軟件(v.6.5，Molecular Devices)操作。在100 μL 細胞增殖培養(yǎng)基中，用Vero 81 細胞(5×104個/ 孔) 接種微孔，制備平板。將平板孵育48 h 或直至Vero 81 細胞≥90%融合。使用成像細胞儀估計融合率(%)，透射光暴露時間為5 ms，焦點調(diào)整為60 μm。拒絕孔不符合融合要求的平板。

每個試驗平板(即陽性對照、PEDV 抗體陽性血清；陰性對照、PEDV 抗體陰性血清；病毒對照和細胞對照、病毒接種培養(yǎng)基)中均包括內(nèi)部對照(一式四份檢測；100 μL/孔)。PEDV 抗體陽性和陰性血清對照來自PEDV 接種或陰性對照豬，檢測前，將所有血清樣本(包括陽性和陰性對照)在56 ℃下滅活30 min。將病毒接種培養(yǎng)基以1 ∶20 稀釋，然后用1 ∶10 稀釋的PEDV 貯備病毒(3.16×105TCID50/mL)以1 ∶1稀釋，以1 ∶40 稀釋樣本。

樣本在37 ℃下孵育1 h，然后將150 μL血清-病毒混合物轉(zhuǎn)移至96 孔HTNT 板中，該板含有已用清洗培養(yǎng)基(含1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基)預(yù)清洗3 次的融合Vero 81 細胞。將平板在37 ℃下孵育1.5 h，然后用清洗培養(yǎng)基清洗一次，并用病毒接種培養(yǎng)基清洗一次。

向各孔加入150 μL 病毒接種培養(yǎng)基，并將平板在37 ℃下孵育20～24 h。然后移除培養(yǎng)基，用100 μL 80%丙酮(4 ℃)固定細胞15 min，并風(fēng)干(22～25 ℃)。

用PBS(pH 7.4；美國Grand Island 生物制品集團公司)清洗平板一次，并用1 ∶100稀釋的PEDV 核蛋白(N) 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標記的腹水(SD6-29 克??；美國Medgene Labs公司) 在37 ℃下染色1 h。用PBS 清洗平板4 次。在成像細胞儀上以541 nm 波長讀取HTNT 板，單部位讀數(shù)，15～30 ms 曝光時間，20 μm 焦點。將響應(yīng)讀取為總熒光強度(total fluorescence intensity，TFI)，然后將其標準化為：

總熒光值(total fluorescence ratio，TFR)=100-樣本TFI 平均值×100÷陰性對照TFI 平均值

HTNT 平板需滿足特定的質(zhì)量標準：抗體陽性血清對照TFI=0.1～7.0，抗體陰性血清對照TFI ≥70，病毒對照TFI ≥100，病毒對照孔染色陽性，細胞對照孔無陽性染色。不符合這些標準的平板的結(jié)果舍棄。

HTNT 檢測的樣本(一式兩份) 使用FFN 程序檢測PEDV 中和抗體。簡言之，熱滅活血清樣本在含TPCK 處理胰蛋白酶(1.5 μg/mL)的MEM中稀釋2 倍(1 ∶10～1 ∶1 280)。將血清樣本與細胞培養(yǎng)適應(yīng)的PEDV(100 FFU/100 μL)以1 ∶1 混合，37 ℃下孵育1 h。將混合物加入含Vero 81 細胞匯合單層的96 孔板中，37 ℃下孵育2 h。孵育后，用含有TPCK 處理的胰蛋白酶(1.5 μg/mL)的MEM 再次洗滌平板，孵育20～24 h。用80%丙酮(22～25 ℃)固定平板，用FITC 結(jié)合的單克隆抗體SD6-29 染色，并用熒光顯微鏡觀察。中和終點滴度定義為相對于對照組熒光聚焦減少90%的最高血清稀釋度。認為中和終點滴度≥1 ∶20 的血清樣本為PEDV中和抗體陽性。

2 結(jié)果

使用Fisher 精確檢驗比較PEDV HTNT與FFN 陽性血清的比例。FFN 和HTNT 檢測試劑的診斷靈敏度和特異性估計值是根據(jù)每種檢測試劑的一系列臨界值的受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析(SAS V.9.4)得出的，假設(shè)＜7 DPI 采集的血清樣本為陰性，≥14 DPI 采集的樣本為陽性。

DPI -7 和DPI 0 采集的個體豬糞便樣本(n=20) 經(jīng)RT-rtPCR 檢測為PEDV陰性，而DPI 7 采集的接種物和豬糞便樣本(n=20) 為RT-rtPCR 陽性。PEDV IgG ELISA 結(jié)果顯示，到DPI 14 時，所有豬均發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。接種后幾天，在豬中觀察到水樣腹瀉，但未觀察到其他臨床體征，所有豬均順利恢復(fù)。DPI 4～42之間采集的159 份血清樣本均經(jīng)HTNT 和FFN檢測(圖1)。在DPI 7 檢測到首次中和抗體應(yīng)答(HTNT 和FFN)。在DPI 21(HTNT 和FFN)達到峰值后，中和抗體濃度下降(HTNT)或保持穩(wěn)定(HTNT)至DPI 42。在一系列臨界值內(nèi)估計FFN 和HTNT 診斷靈敏度和特異性(表1)

使用≥1 ∶20，10 的FFN 臨界值，在DPI 0 觀察到1 個假陽性結(jié)果(表2)。此后，8/20頭(40%) 豬在DPI 7 時為FFN 陽性，19/20頭(95%)在DPI 14 時為FFN 陽性，20/20 頭(95%)在DPI 21 時為FFN 陽性(表2)?？傮w而言，如估計值和重疊的95%置信區(qū)間所示，在觀察期間，試驗性能幾乎相同(表1)。

3 討論

用于檢測中和抗體的基于成像細胞計數(shù)的系統(tǒng)能夠可視化和測量細胞、定量反應(yīng)以及捕獲和存儲數(shù)據(jù)或圖像。在HTNT PEDV 試驗中，使用高通量成像細胞儀標準化細胞融合、讀取反應(yīng)和評價平板對照?；诳陀^測量的標準化讀取方案和計算消除了試驗過程中的人體主觀性和變異性，并將96 孔板的讀取時間縮短至＜4 min。因此，成像細胞計數(shù)可為檢測多種病原體的中和抗體提供更客觀、快速和半自動的方法。