宋晨，閆璐

（邯鄲睿川科技有限公司，河北 邯鄲 056000）

1 概況

白術(shù)為蒼術(shù)屬多年生植物，現(xiàn)代研究表明其根莖含有黃酮、多糖、揮發(fā)油和內(nèi)酯類等成分，具有抗菌、抗氧化等生物活性。舒暢等優(yōu)化了白術(shù)黃酮的提取溫度、液料比、提取時間，并測定出其抗氧化性能。武宇芳等通過超聲輔助提取白術(shù)黃酮,并采用DPPH 法測定了抗氧化活性。吳銘等利用超聲輔助提取了白術(shù)多糖，提取率為8.52 %，同時測定了白術(shù)多糖DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除率。黃小千等由水蒸氣蒸餾法提取了白術(shù)揮發(fā)油并研究其化學(xué)成分。王建成利用正交試驗考察了乙醇體積分數(shù)、溶劑用量、提取時間及提取次數(shù)對白術(shù)內(nèi)脂提取工藝的影響?，F(xiàn)有研究多集中于單個成分提取及表征，但多成分連續(xù)提取更具有工業(yè)意義。探討水提法提取白術(shù)，同時收集揮發(fā)油，水提濾渣進一步經(jīng)醇提得醇提物，優(yōu)化提取工藝并測定水提物、醇提物抗氧化性，以期為白術(shù)綜合利用提供參考。

2 實驗部分

2.1 試劑及儀器

白術(shù)生品，河北安國藥材市場；蘆丁標準品，中國食品藥品檢定研究所；DPPH，分析純，和光純業(yè)工業(yè)株式會社；過氧化氫、水楊酸、硫酸亞鐵、維C、葡萄糖、蒽酮等均為市售分析純。

微波萃取儀，XH-100，北京祥鵠科技有限公司；可見分光光度計，722S，上海儀電分析儀器有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 白術(shù)提取及工藝優(yōu)化

白術(shù)粉碎過40 目篩。稱取白術(shù)粉于三頸燒瓶中，以蒸餾水為溶劑，按一定液料比（mL/g），直接蒸餾規(guī)定時間，期間收集揮發(fā)油。結(jié)束后抽濾合并濾液濃縮得水提物，經(jīng)苯酚-硫酸法鑒定其主要為多糖。濾渣經(jīng)抽濾后，不經(jīng)烘干直接稱重，以一定液料比（mL/g） 加入95%乙醇，設(shè)定微波功率600 W，萃取一定時間，溫度設(shè)置為78 ℃，結(jié)束后趁熱過濾合并濾液濃縮，得醇提物，經(jīng)鹽酸-鎂粉法鑒定其主要為黃酮。

在預(yù)實驗及單因素實驗基礎(chǔ)上，以白術(shù)與水用量比、水提時間、白術(shù)與醇用量比、微波時間四因素來設(shè)計正交實驗優(yōu)化黃酮提取工藝。正交實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素與水平設(shè)計Table 1 Orthogonal design factors and levels

2.2.2 提取物定量分析

2.2.2.1 多糖測定

五只試管分別加入不同濃度葡萄糖溶液2 mL，濃H2SO45.00 mL、5%苯酚1.00 mL，搖勻，100 ℃加熱0.5 h 后冷卻。以蒸餾水做參比，490 nm 波長下測各溶液吸光度，繪制標準曲線。移取提取后未濃縮水提液1.0 mL 稀釋到一定濃度測定吸光度，平行3 次，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算被測液多糖濃度，白術(shù)多糖的得率計算式如下：

式中：C0為最終稀釋的多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為多糖稀釋倍數(shù)；V 為多糖溶液的體積，mL；m為白術(shù)質(zhì)量，g。

2.2.2.2 黃酮測定

配置：0.2 g/L 蘆丁標準液、100 g/L 的Al(NO)3溶液、40 g/L 的NaOH 溶液和50 g/L 的NaNO2溶液。以蘆丁為標準，按參考文獻程序顯色，檢測波長為510 nm，95%乙醇做參比繪制蘆丁標準曲線。移取提取后未濃縮醇提液1.00 mL 稀釋到一定濃度測定吸光度，平行3 次，根據(jù)蘆丁標準曲線計算被測液黃酮濃度。參考白術(shù)多糖得率計算方程，計算白術(shù)黃酮得率。

2.2.3 抗氧化能力的測定

2.2.3.1 對羥基自由基的清除作用

以維C 作對照，測定白術(shù)水提物和醇提物對OH 的清除能力。配置5、17、27、33、39、50 μg/mL 維C、白術(shù)水提物和醇提物溶液。取FeSO4溶液1.0 mL 于試管中，分別加1.0 mL 水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 的H2O2溶液、1.0 mL 蒸餾水，在37℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水作參比測510 nm波長處吸光度A0；以不同濃度的維C 溶液代替蒸餾水，其余同上測吸光度Ax；以蒸餾水代替H2O2作試劑空白測吸光度Ax0。白術(shù)水提物和醇提物測定同維C。

2.2.3.2 對DPPH·的清除作用

以維C 為對照，測定白術(shù)水提物和醇提物對DPPH·清除率。取五只試管分別加入2.0 mL 濃度分別8、16、24、32、40 μg/mL 的維C 溶液，加入2.0 mL 濃度為0.05 mg/mL 的DPPH 溶液，搖勻、室溫于暗處反應(yīng)25 min，測520 nm 處的吸光度Ai；平行測定2.0 mL DPPH 溶液和2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度A0，試劑空白的吸光度A1。

DPPH 自由基清除率（%） =（1-（Ai—A1） /A0） ×100，白術(shù)水提物和醇提物測定同維C。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線

葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：Y=-0.058 1+57.55 X，R=0.993 42；蘆丁標準曲線線性回歸方程為：Y=9.133 04X，R=0.999 04。

3.2 正交實驗結(jié)果

依正交表1進行實驗，通過葡萄糖、蘆丁標準曲線法計算多糖得率、黃酮得率，及兩者之和。結(jié)果如表2所示。本提取工藝中，揮發(fā)油為水提副產(chǎn)物，且揮發(fā)油含量較低，暫未列為實驗指標。白術(shù)水提步驟不受黃酮提取步驟影響，因此多糖得率亦不作為優(yōu)化指標，同理多糖、黃酮二者之和亦不作為優(yōu)化指標。但實驗可見，蒸餾時間對多糖得率影響較大，物料比影響較小。延長時間可提高多糖得率。黃酮得率受所有因素影響，因此以黃酮得率為正交實驗優(yōu)化指標，正交條件下多糖和黃酮得率及兩者之和見表2。

表2 正交條件下多糖和黃酮得率及兩者之和Table 2 Flavone,polysaccharide,and total yield under orthogonal condition

黃酮得率正交實驗分析見表3。

表3 黃酮得率正交實驗分析Table 3 Flavone yield orthogonal test analysis

由表3可見，實驗9（A3B3C2D1） 黃酮得率為0.42%，為設(shè)計實驗中最高得率；分析各因素各水平平均得率，最優(yōu)工藝應(yīng)為A3B3C3D1。由極差分析可得，影響黃酮得率的因素由大到小為：料液（水） 比＞蒸餾時間＞料液（醇） 比＞微波時間。

最佳工藝驗證，A3B3C3D1即料液（水） 比為1∶20（mL/g），蒸餾時間5 h，料液（醇） 比1∶20（mL/g），微波時間4 min。黃酮得率0.44%，多糖得率30.42%，兩者之和為30.86 %，水、醇總提取物得率35.21%。同時收集揮發(fā)油為副產(chǎn)物。

3.3 白術(shù)水提物和醇提物的抗氧化活性

3.3.1 提取物對·OH 的清除作用

提取物對·OH 的清除作用如圖1所示。

由圖1可知，提取物對·OH 的清除作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，50 μg/mL 白術(shù)水提物對·OH 清除率達21.96%，此時醇提物清除率為18.89%，白術(shù)水提物比醇提物略高，低濃度時，兩者差異明顯，隨質(zhì)量濃度逐漸升高，兩者清除率越來越接近。低濃度時二者清除性能與維C 差距不大，隨濃度升高二者性能較維C 差距變大，總體二者均沒有維C 的清除性能強。

圖1 提取物對·OH的清除作用Fig.1 OH free radical scavenging effect of different extracts

3.3.2 提取物對DPPH·的清除作用

提取物對DPPH·的清除作用如圖2所示。

圖2 提取物對DPPH·的清除作用Fig.2 DPPH free radical scavenging effect of different extracts

由圖2可知，提取物對DPPH·的清除作用，實驗濃度范圍內(nèi)，對DPPH·清除率白術(shù)水提物比醇提物高且差異較明顯。在8～24 μg/mL 水提物和醇提物對DPPH·清除率差別逐漸增大，＞24 μg/mL 后兩者的差別逐漸減小。但整體二者較維C清除能力差，且差距較大。對比圖1、圖2發(fā)現(xiàn)，白術(shù)水提物和醇提物對DPPH·的清除能力稍弱于對·OH 的清除能力。

4 結(jié)語

對白術(shù)進行綜合提取，首先以蒸餾水為溶劑，采用直接蒸餾，收集揮發(fā)油及主要成分為多糖的白術(shù)水提物。濾渣經(jīng)抽濾后，不經(jīng)烘干直接加入95%乙醇，進行醇提得白術(shù)醇提物，其主要成分為黃酮。以黃酮得率為考察指標，由正交實驗法確定了最優(yōu)工藝參數(shù)，即料液（水)比為1 ∶20（mL/g），蒸餾時間5 h，料液（醇） 比1 ∶20（mL/g），微波時間4min。此條件下，黃酮得率0.44%，多糖得率30.42%，兩者之和30.86%，水、醇總提取物得率35.21%。全工藝以黃酮為控制組分，影響黃酮得率的因素由大到小為：料液（水）比＞蒸餾時間＞料液（醇） 比＞微波時間。該工藝前期水提不影響后期醇提產(chǎn)物及總提取物得率，提高了藥材利用率。

該工藝所得提取物抗自由基作用明顯，其中，50μg/mL 白術(shù)水提物對·OH 清除率達21.96%，此時醇提物清除率為18.89%；40μg/mL 白術(shù)水提物對DPPH·清除率達17.62%，此時醇提物清除率為12.85%。白術(shù)水提物與醇提物低濃度時對·OH 清除性能與維C 差距不大；二者對DPPH·的清除能力稍弱于其對·OH 的清除能力。