劉東紅，利婕，牛瑞浩，忻啟譜，朱青青，徐恩波

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 浙江大學(xué) 智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 杭州310058 3 浙江大學(xué) 長三角智慧綠洲創(chuàng)新中心 浙江嘉興314102 4 浙江大學(xué) 南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地 杭州310058 5 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州 310058）

全球肉類消費(fèi)需求量增長與肉制品生產(chǎn)力限制的不平衡問題日益凸顯。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）預(yù)測，到2050 年，全球肉類需求將達(dá)到4.55 億t；對比2018—2020 年，未來10 年全球肉類蛋白質(zhì)消費(fèi)量將增長14%[1]?，F(xiàn)有肉類生產(chǎn)供應(yīng)鏈存在諸多隱患，如人畜共患?。ㄈ缒崤敛《?、甲型流感）擴(kuò)大風(fēng)險(xiǎn)，COVID-19 疫情爆發(fā)影響肉類加工廠等[2]。此外，畜牧業(yè)產(chǎn)生的甲烷（動物腸道和糞便發(fā)酵）和一氧化二氮是最主要的溫室氣體，前者對全球變暖的影響比二氧化碳高28 倍[3]。而到2025 年，世界人口預(yù)計(jì)超過90 億，這意味著食物、水、耕地需求將持續(xù)過載[4]。與動物肉相比，細(xì)胞培養(yǎng)肉有助于人類在解決饑餓問題的同時(shí)，保護(hù)水源、土地和能源。因此，細(xì)胞培養(yǎng)肉作為替代蛋白來源之一，被賦予解決當(dāng)前肉業(yè)生產(chǎn)效能不足以及公共衛(wèi)生、環(huán)境退化和動物福利等諸多社會問題的新使命。

細(xì)胞培養(yǎng)肉也稱人造肉，是一種通過組織工程技術(shù)生產(chǎn)的仿真模擬肉類，最初依賴于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域干細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)基礎(chǔ)（如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、體外骨骼肌移植等），并通過交叉技術(shù)迭代實(shí)現(xiàn)可食用肉類組織的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展。細(xì)胞培養(yǎng)肉的歷史可追溯到1999 年，被譽(yù)為“細(xì)胞培養(yǎng)肉教父”的威廉·范·埃倫（Willem van Eelen）申請了第1 項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)肉專利。2013 年，馬斯特里赫特大學(xué)的Mark 教授展示了首個(gè)培養(yǎng)肉漢堡，85 g 造價(jià)卻高達(dá)330 000 美元[5]。之后，細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)開始蓬勃發(fā)展，其生產(chǎn)流程也逐漸明確并主要涉及4 個(gè)部分：1）肌肉、脂肪細(xì)胞（或內(nèi)皮細(xì)胞）的分離和培養(yǎng)；2）增殖和分化培養(yǎng)基配方的研制；3）支架材料的篩選和優(yōu)化；4）組織化成型方式的設(shè)計(jì)。如今，越來越多商業(yè)公司為畜禽肉類（如豬肉、牛肉、雞肉等）和海洋食品的肉類替代物提供了開發(fā)方案，學(xué)術(shù)界也對此迸發(fā)出強(qiáng)烈的研究熱情，致力于高密度、批量化以及營養(yǎng)全面、質(zhì)構(gòu)風(fēng)味近似的培養(yǎng)肉科學(xué)基礎(chǔ)研究。

然而，我國細(xì)胞培養(yǎng)肉研發(fā)仍處于起步階段，有不少重大技術(shù)挑戰(zhàn)尚未解決，如高傳代及永生化細(xì)胞系建立、多階段生長培養(yǎng)基優(yōu)化、高通量生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、仿生細(xì)胞支架構(gòu)建等技術(shù)[6]。其中，培養(yǎng)肉細(xì)胞支架旨在支持自然組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)模擬，在一定程度上模仿其生化特征，并促進(jìn)其形成具有肉類力學(xué)特性組織[7]。細(xì)胞培養(yǎng)肉支架技術(shù)更新發(fā)展迅速，各種新型的組織成型方法不斷涌現(xiàn)。本文介紹培養(yǎng)肉三維培養(yǎng)的各種支架材料及細(xì)胞感知機(jī)制，探討細(xì)胞肉組織成型的最新技術(shù)及所面臨的挑戰(zhàn)，為培養(yǎng)肉的支架選擇和組織成型技術(shù)提供科學(xué)參考。

1 細(xì)胞感知與三維培養(yǎng)

1.1 三維培養(yǎng)細(xì)胞的力學(xué)感知

細(xì)胞體外三維培養(yǎng)（3D culture）是組織工程和類器官制造的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞培養(yǎng)肉形成具有一定力學(xué)性質(zhì)的支撐性結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，其體外三維培養(yǎng)模型中細(xì)胞的生長環(huán)境更加接近真實(shí)組織內(nèi)的微環(huán)境。在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)（2D）過程中，單層細(xì)胞一般在平坦的固體表面生長，然而，細(xì)胞的接觸抑制行為，很難在孔板平面上形成復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，并且二維平面的硬度大于胞外基質(zhì)硬度，貼壁后的細(xì)胞被過度拉伸后會導(dǎo)致細(xì)胞基因與蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，使其形態(tài)差別于組織中真實(shí)細(xì)胞形態(tài)[8]。三維培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞支架充當(dāng)了體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的角色，其首要作用是為三維空間中的細(xì)胞黏附提供一定的力學(xué)支撐，從而促進(jìn)三維組織的形成。

三維環(huán)境中細(xì)胞感知支架強(qiáng)度，進(jìn)而著床并分化為不同組織的過程被稱為 “機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”（如圖1 所示）[9]。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制能夠使細(xì)胞感知機(jī)械刺激并作出反應(yīng)，從而調(diào)整胞內(nèi)成分以滿足不同胞外微環(huán)境硬度需求。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)胞膜上的特異性序列結(jié)合，進(jìn)而與細(xì)胞核建立物理連接，并啟動從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。細(xì)胞膜表面機(jī)械受體即整聯(lián)蛋白[10]，通過ECM中常見的RDG 序列（由精氨酸、甘氨酸和天冬氨組合而成）[11]來感知ECM 硬度（壓/拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的ECM 形變）和流體流動（間質(zhì)流體的剪切應(yīng)力）的變化。為了平衡膜黏附蛋白與微絲、微管之間的錯(cuò)位力，細(xì)胞激活肌動球蛋白介導(dǎo)的收縮并重新排列細(xì)胞骨架。在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)充當(dāng)“橋梁”的作用，將細(xì)胞-胞外基質(zhì)界面產(chǎn)生的機(jī)械張力傳導(dǎo)到細(xì)胞核。

圖1 細(xì)胞中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制示意圖[9]Fig.1 Schematic representation of mechanotransduction mechanisms in cells[9]

1.2 支架結(jié)構(gòu)與細(xì)胞行為

細(xì)胞支架除為細(xì)胞黏附提供一定的力學(xué)支撐外，還為細(xì)胞提供足夠的生長空間以及物質(zhì)交換通道。雖然支架的組成和表面化學(xué)性質(zhì)決定其細(xì)胞生物相容性，但是支架的結(jié)構(gòu)特征如孔徑、形態(tài)和孔隙度等，對細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化能力也起著重要的調(diào)節(jié)作用[12]。除了允許細(xì)胞穿透外，支架結(jié)構(gòu)還將允許營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣流入，并利于去除細(xì)胞產(chǎn)生的廢物以增加細(xì)胞存活率。Griffon 等[13]發(fā)現(xiàn)較小的孔徑（＜100 μm）使細(xì)胞最大程度黏附，播種3 d 后觀察到較多的細(xì)胞數(shù)量。中等尺寸的孔徑（100～300 μm）更有利于細(xì)胞增殖分化，長期培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量增多且檢測到更多的分化標(biāo)志物。然而，孔徑過大反而會導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少。Lee 等[14]向500 μm 孔徑支架中播種細(xì)胞，在7d 后幾乎觀察不到細(xì)胞，這說明在靜態(tài)播種條件下，大孔徑雖然會增加細(xì)胞在空間中的穿透能力，但是也相應(yīng)地減小了細(xì)胞和支架間的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞難以附著。此外，支架的孔隙形態(tài)同樣會對細(xì)胞行為造成影響，如Caliari 等[15]使用馬肌腱細(xì)胞，通過定向凝固膠原蛋白-糖胺聚糖支架重建了三維的肌腱組織平臺。在此定向孔支架上培養(yǎng)肌腱細(xì)胞，可觀察到更強(qiáng)的細(xì)胞附著、代謝活性和排列能力。這可能是由于定向孔中的細(xì)胞更具流動性，能為細(xì)胞擴(kuò)散和增殖提供更大空間，同時(shí)保持均勻的營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞活性。與此相反，孔隙率較小的支架不能為細(xì)胞提供充足空間使細(xì)胞遷移和增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞聚集并因此呈現(xiàn)較低的活性。

從生物學(xué)的角度來看，大孔隙率的支架結(jié)構(gòu)在細(xì)胞穿透并防止細(xì)胞溢出方面起著關(guān)鍵作用。適當(dāng)?shù)奈⒖紫独跔I養(yǎng)物質(zhì)的交換，并能吸附充足的特定蛋白質(zhì)來滿足細(xì)胞的生長需求。然而，較大的孔隙率不利于保持機(jī)械性能，隨著孔隙率的增加，機(jī)械性能往往呈指數(shù)下降[16]。總之，對于細(xì)胞培養(yǎng)肉而言，因不同種動物的組織結(jié)構(gòu)及機(jī)械性質(zhì)差異，故滿足相應(yīng)種子細(xì)胞最適生長條件的三維支架制造仍需進(jìn)行大量測試驗(yàn)證。

2 細(xì)胞培養(yǎng)支架材料

2.1 支架材料選擇的一般性原則

術(shù)語“支架”最早出現(xiàn)在組織工程領(lǐng)域，指經(jīng)過加工的具有適當(dāng)形狀、尺寸、物理性質(zhì)的結(jié)構(gòu)材料，其與細(xì)胞、生長因子和其它生物活性分子結(jié)合，促進(jìn)組織修復(fù)和再生[17]。因此，支架作為一種三維的細(xì)胞培養(yǎng)平臺，通過再現(xiàn)細(xì)胞的原生三維微環(huán)境，促進(jìn)更自然的細(xì)胞行為和組織形成。作為組織形成的模板，支架材料通常模擬細(xì)胞外基質(zhì)，保證細(xì)胞的有效黏附、增殖和分化[18]。除生物相容性外，組織工程支架材料性能優(yōu)化通常還集中在生物降解性，以及包括孔隙率、材料強(qiáng)度、可變結(jié)構(gòu)與形態(tài)等[19]。

在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，由于肉類的主要成分是肌細(xì)胞形成的肌纖維組織及脂肪細(xì)胞形成的脂質(zhì)，因此培養(yǎng)肉的支架材料側(cè)重于通過多種細(xì)胞共培養(yǎng)和支架結(jié)構(gòu)適度支撐的方式來培養(yǎng)骨骼肌組織。這與再生醫(yī)學(xué)中生物人工肌肉研究領(lǐng)域有著類似的技術(shù)原則[20]。同時(shí)，支架材料也必須是多孔結(jié)構(gòu)，以滿足連續(xù)的介質(zhì)灌注要求，從而模擬自然組織的血管。此外，細(xì)胞培養(yǎng)肉的支架應(yīng)有助于產(chǎn)品形成的理想感官特性，并具備可食用安全性（尤其是支架作為最終產(chǎn)品的部分組織）。支架也可通過培養(yǎng)或后續(xù)加工中移除的方式，避免在最終產(chǎn)品中殘留[21]。綜上，細(xì)胞培養(yǎng)肉支架材料應(yīng)滿足多孔性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、適度的支架結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能、良好的加熱性質(zhì)等要求（圖2a）。而根據(jù)支架材料最終的應(yīng)用形態(tài)，可以分為水凝膠支架、脫細(xì)胞的組織或器官，以及包括三維多孔支架、纖維和微球支架在內(nèi)的其它預(yù)成型支架[22]。

2.2 水凝膠支架

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物材料，可以容納大量的水分子。其制備方式包括共價(jià)鍵合、光化聚合、高溫凝膠、低溫凝膠以及其它方式如物理交聯(lián)、疏水相互作用、靜電作用、結(jié)晶或氫鍵結(jié)合等（圖2b）[23]。水凝膠材料通常具有生物相容性良好，機(jī)械性能可調(diào)節(jié)，降解率可預(yù)測等優(yōu)點(diǎn)[24-25]。同時(shí)，其與細(xì)胞外基質(zhì)含水量以及自然組織力學(xué)性能相似，可為種子細(xì)胞提供一個(gè)良好的遷移增殖分化平臺[26]。此外，水凝膠良好的親水性[27]，其物理空間封裝細(xì)胞的能力顯著，因而在干細(xì)胞三維培養(yǎng)領(lǐng)域有著廣泛的研究。例如，水凝膠用于脂肪源性干細(xì)胞的培養(yǎng)，目前已在成骨分化、肌肉再生、心臟分化、神經(jīng)分化、皮膚再生等領(lǐng)域發(fā)揮作用[23]。此外，F(xiàn)uruhashi 等[28]在水凝膠模塊中制造毫米厚的牛肌肉組織，其肌管沿長軸方向排列，可在電刺激的作用下收縮，具有適當(dāng)?shù)娜忸惿硖匦院褪澄锾匦浴?/p>

圖2 （a）培養(yǎng)肉支架的基本制造條件[21]；（b）細(xì)胞相容性水凝膠及其細(xì)胞界面復(fù)雜的化學(xué)相互作用[33]Fig.2 （a）General conditions of manufacturing cultured meat scaffolds[21]；（b）Multiple chemical interactions in the complexity of cytocompatible hydrogels and their cell interfaces[33]

天然水凝膠及其衍生材料包括明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸等，具有細(xì)胞信號傳導(dǎo)能力，可以在細(xì)胞間產(chǎn)生相互作用，然而，仍存在機(jī)械強(qiáng)度低，結(jié)構(gòu)降解不受控制，免疫原性未知等問題。膠原水凝膠可對同種或異種移植細(xì)胞進(jìn)行保存和免疫保護(hù)[29]。海藻酸鹽水凝膠珠包裹的軟骨細(xì)胞顯示出高活力，軟骨基質(zhì)沉積，低水平的軟骨細(xì)胞肥大，在培養(yǎng)7 d 內(nèi)細(xì)胞增殖逐漸增加，并通過相應(yīng)的信號和激素刺激后模擬了天然生長板軟骨的組織結(jié)構(gòu)，建立了一種可調(diào)的體外系統(tǒng)[30]。

合成水凝膠材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇等，這些材料降解性能和微觀結(jié)構(gòu)雖可控，但缺乏相應(yīng)的生物組分[31]。因此，天然材料和合成材料改性復(fù)配制備支架的方法引起廣泛的關(guān)注。甲基丙烯酸明膠水凝膠結(jié)合了天然和合成水凝膠的優(yōu)點(diǎn)，保留了明膠的大部分功能氨基酸基序，可以通過定制合成工藝或添加各種天然或化學(xué)合成的生物材料來滿足特定的生物功能和機(jī)械可調(diào)性要求，目前已可以保證誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等多種干細(xì)胞移植與組織修復(fù)時(shí)的活性[32]。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，甲基丙烯酸明膠水凝膠尚存在培養(yǎng)殘留與食用安全性問題。

2.3 脫細(xì)胞組織、器官支架

脫細(xì)胞的組織或器官是指通過化學(xué)（表面活性劑、酸、堿）或酶（如胰蛋白酶）或機(jī)械力（如凍融、攪拌、超聲、超臨界CO2、靜水壓力）等方式分離和移除細(xì)胞成分[34]，殘余骨架即天然細(xì)胞外基質(zhì)材料作為三維支架。動物來源的脫細(xì)胞組織的主要成分是膠原蛋白、層交連蛋白和纖維連接蛋白[35]；植物來源的主要成分則是纖維素骨架、果膠和半纖維素[36]。以上成分在其研究中均被證明具有細(xì)胞相容性。

由于肌肉組織生長的定向特性，細(xì)胞培養(yǎng)肉為了實(shí)現(xiàn)組織成型需要肌肉纖維的單向排列，研究表明在分化前對齊成肌細(xì)胞有利于生成排列的肌管[37]。而排列的方法包括用電或機(jī)械的主動刺激，以及被動調(diào)節(jié)支架力學(xué)性能，如改變剛度，引入促進(jìn)細(xì)胞排列的表面路徑等[38，39]。如圖3a 所示，去細(xì)胞和脫鈣的魚鱗衍生支架表面存在徑向凹槽和環(huán)脊，可以模擬細(xì)胞培養(yǎng)的三維微環(huán)境，同時(shí)魚鱗主要成分是羥基磷灰石和Ⅰ型膠原纖維，與骨細(xì)胞外基質(zhì)相似，利于細(xì)胞擴(kuò)散和增殖。結(jié)果表明，魚鱗具有較高的細(xì)胞相容性，可增強(qiáng)細(xì)胞黏附和增殖，并引導(dǎo)細(xì)胞沿脊通道遷移[40]。脫細(xì)胞植物葉保留了其自然的條紋形貌，可以支持成肌細(xì)胞的貼附、增殖、排列和分化；肌細(xì)胞單軸自排列，這一特征在分化成肌管后仍可保留，為骨骼肌和其它各向異性組織培養(yǎng)提供了一種廉價(jià)、可持續(xù)的支架制造方法[22]。

2.4 其它預(yù)成型功能支架

2.4.1 三維多孔支架 用水凝膠包覆肌細(xì)胞制備的培養(yǎng)肉，與傳統(tǒng)肉品質(zhì)相比還有一定差距[41]。具有特定形狀和相連孔徑結(jié)構(gòu)的三維多孔支架模型，不僅可以控制空間形狀，還可確保氣體、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的交換[42]，在制備高度結(jié)構(gòu)和有組織的肉類中具有極大優(yōu)勢。三維多孔支架可以通過冷凍干燥、靜電紡絲、3D 打印、熔融沉積、溶劑澆鑄等技術(shù)加工而成[21]。制備支架的材料可分為天然材料（如食品動物源和植物源的多糖及蛋白）、合成材料（如聚乳酸等聚合物以及體外重組蛋白等）[43]。例如，利用殼聚糖和海藻酸鈉靜電相互作用，通過冷凍干燥制備3D 可食用殼聚糖-海藻酸鈉-膠原/明膠支架。該支架具有外部多孔的蜂窩結(jié)構(gòu)，接種豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的蛋白和肌源性基因表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)分化后可以形成細(xì)胞骨架[44]。再如用聚乳酸打印模具并進(jìn)行反向鑄造，脫模制備的PDMS 模具用以混合膠原培養(yǎng)豬肌肉干細(xì)胞，結(jié)果顯示形成了結(jié)構(gòu)組織的肌管[45]。

植物蛋白具有類似肌肉的纖維結(jié)構(gòu)，通常用來制備模仿肉質(zhì)地的“素肉”。其應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)肉中，可以提供整體質(zhì)構(gòu)韌性。植物曾被認(rèn)為缺乏動物細(xì)胞經(jīng)典黏附蛋白的真正同源物，而對細(xì)胞基質(zhì)黏附分子的研究揭示了動物、真菌和植物分子之間的序列相似性[24]。目前，有研究表明花生拉絲蛋白多孔支架可以用于豬平滑肌細(xì)胞的黏附和生長[46]，同時(shí)可以促進(jìn)豬脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)PPARγ、FABP4、Plin1 基因和蛋白[47]。此外，有研究證明組織化大豆蛋白多孔支架可以支持細(xì)胞附著和增殖（如圖3b），并將其應(yīng)用于牛衛(wèi)星肌細(xì)胞、牛平滑肌細(xì)胞和牛內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，從而創(chuàng)建了3D 工程化牛肌肉組織的培養(yǎng)模型[48]。

2.4.2 類纖維和微球支架 目前哺乳動物細(xì)胞肉大多是非結(jié)構(gòu)化的，為了模擬真正的肉組織，可以應(yīng)用各種組織工程技術(shù)如細(xì)胞薄片工程、細(xì)胞纖維工程、3D 打印等[49]。組織工程領(lǐng)域基于纖維調(diào)控的策略在體外創(chuàng)建三維復(fù)雜組織具有良好的發(fā)展前景（圖3c）。有研究證明，使用雙同軸層流的微流控裝置制造的水凝膠纖維包裹細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞，可以重建活組織的內(nèi)在形態(tài)和功能，同時(shí)還可通過編織和卷曲組裝成具有各種空間模式的宏觀結(jié)構(gòu)[50]。在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，擠壓明膠纖維可以促進(jìn)牛主動脈平滑肌細(xì)胞和兔骨骼成肌細(xì)胞貼附增殖，同時(shí)短長度纖維促進(jìn)細(xì)胞聚集，長纖維促進(jìn)肌肉組織形成[51]。Kang 等[49]采用顆粒狀結(jié)冷膠浴和明膠浴的方法進(jìn)行肌腱-凝膠集成生物打印，制備出3 種牛細(xì)胞纖維：肌肉、脂肪組織和毛細(xì)血管，3 種細(xì)胞在分化過程中可保持良好的纖維結(jié)構(gòu)并組裝形成類牛排樣組織。

圖3 （a）制備脫細(xì)胞和脫鈣魚鱗支架過程的示意圖[40]；（b）組織化大豆蛋白支架的微觀結(jié)構(gòu)及生物相容性[48]；（c）結(jié)冷膠、明膠支架運(yùn)用于肌腱-凝膠支撐浴打印[49]Fig.3 （a）Schematic diagram of the process of preparing decellularized and decalcified fish scale scaffolds[40]；（b）Microstructure and biocompatibility of textured soybean protein scaffolds[48]；（c）Granular gellan gum bath and granular gelatin bath used in tendon-gel integrated bioprinting[49]

微載體是直徑為數(shù)百微米的微型三維培養(yǎng)支架，是一種高效、可伸縮的細(xì)胞擴(kuò)張平臺。理想的微載體需具有比表面積大、細(xì)胞親和力高、生物降解性或可食用性等特點(diǎn)[52]。Zhang 等[53]將淀粉通過離子交換與DEAE 偶聯(lián)合成淀粉微球，適合貼壁哺乳動物單細(xì)胞的生長。在旋轉(zhuǎn)瓶中運(yùn)用可食用的三維多孔明膠微載體培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)生可伸縮擴(kuò)張，并在沒有肌源性試劑的情況下觸發(fā)了自發(fā)肌生成。此外，Liu 等[54]利用3D 打印模具和TG 酶將微組織組裝成具有相似力學(xué)性能和高蛋白量的厘米級肉丸。

3 培養(yǎng)肉支架組織成型

細(xì)胞培養(yǎng)肉支架組織成型需要滿足一定的孔隙率，合適的孔徑或通道大小，適宜的支架尺寸和厚度，以及支撐細(xì)胞生長與支架成型的楊氏模量等結(jié)構(gòu)屬性，且與細(xì)胞的來源與生長要素差異有關(guān)。由于細(xì)胞大小、遷移要求和物質(zhì)運(yùn)輸，孔徑的最低要求被認(rèn)為是100 μm[55-56]，對于成肌細(xì)胞和成脂細(xì)胞需要的孔隙分別為50～150 μm 和40～400 μm[57]。一般而言，宏觀的工程化組織培養(yǎng)肉才能真正意義地被稱為“肉”，這不僅需要細(xì)胞能在支架材料上成功增殖與分化，還需要借助如微載體成型、靜電紡絲成型、生物3D 打印成型等一定的組織成型方法。

3.1 微載體成型

細(xì)胞微載體是用于細(xì)胞治療和組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)和物質(zhì)傳遞的微尺度聚合微粒[58]。Yang 等[59]報(bào)道了一種RGD 肽功能化殼聚糖微球支架用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的快速增殖，使其在體外能夠形成組織化血管；Anton 等[60]制備了直徑571 μm 的殼聚糖微球支架，并能支持小鼠骨骼細(xì)胞C2C12 成肌細(xì)胞、兔平滑肌細(xì)胞、羊成肌纖維細(xì)胞等的黏附和快速增殖。在細(xì)胞培養(yǎng)肉方面，清華大學(xué)的研究人員利用可食用的多孔明膠微載體（如圖4a），結(jié)合攪拌式生物反應(yīng)器，在體外高效、規(guī)模化擴(kuò)增出豬原代肌肉星形細(xì)胞（即豬骨骼肌干細(xì)胞），并誘導(dǎo)其分化和成熟；隨后，利用3D 打印肉球模具和食品級谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，將百微米尺度的豬肌肉微組織組裝成數(shù)厘米大小的人造豬肉丸[54]。

圖4 （a）模板微球成型的人造肉丸[54]；（b）靜電紡絲明膠成型的組織肌肉[61]；（c）生物3D 打印成型的類牛排組織[49]；（d）水凝膠堆疊成型的類牛肉組織[57]Fig.4 （a）Artificial meatballs formed by template microspheres[54]；（b）Engineered tissue muscles formed by electrospinning gelatin[61]；（c）Steak-like tissue with marble texture formed by 3D bioprinting[49]；（d）Beef-like tissue formed by stacking hydrogel[57]

3.2 靜電紡絲成型

靜電紡絲技術(shù)是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、可調(diào)的工藝，將其用于組織成型時(shí)，能誘導(dǎo)植入的細(xì)胞對齊，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的伸長[62]和肌肉組織生成[63]，形成明顯的纖維結(jié)構(gòu)。Deng 等[64]報(bào)道了一種靜電紡絲制備的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維膜。哈佛大學(xué)的研究人員利用浸沒旋轉(zhuǎn)噴射紡紗（iRJS）紡制了食品級的明膠纖維（圖4b），并將兔肌肉細(xì)胞和牛平滑肌細(xì)胞植入其中生長，得到一個(gè)大小約4 cm3，1.5 mm 厚的成型肉，紋理剖面分析表明其更接近于絞碎的牛肉而非兔或牛肉的整塊肌肉。雖然肌肉纖維排列性良好，但是其結(jié)構(gòu)仍未達(dá)到傳統(tǒng)全切肉制品的組織結(jié)構(gòu)密集程度[61]。

3.3 3D 打印成型

三維打印技術(shù)也被稱為增材制造技術(shù)，作為一種可在各種尺度上定位細(xì)胞位置并可從多種材料中大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的工具，近年來受到廣泛關(guān)注。生物墨水的3D 打印可通過噴墨、激光輔助生物打印、投影式光固化和擠出等多種方式實(shí)現(xiàn)。其中，基于擠出的生物3D 打印操作簡單、成本低、加工安全，且易實(shí)現(xiàn)多種用途、商業(yè)化及應(yīng)用推廣，是目前食品領(lǐng)域最受歡迎的打印制造方式[65]。常用的擠出式生物3D 打印材料因需要具備剪切稀化的非牛頓流體特性，故以水凝膠基質(zhì)的生物墨水為主[66]。同時(shí)，擠出式生物3D 打印墨水還應(yīng)具備最小的巴勒斯效應(yīng)（Barus effect），以保證材料從噴嘴中擠出后不會過度膨脹[67]。Li 等[68]通過擠出式3D 打印和光固化打印細(xì)胞化的Gel-MA-20%絲素蛋白生物墨水，制備出具有多層的豬骨骼肌組織。Bolívar-Monsalve 等[69]通過連續(xù)共擠出方式打印海藻酸鹽和載有C2C112 明膠甲基丙烯酰-海藻酸鹽生物墨水生成含多層纖維骨骼肌微組織。

隨著研究人員對仿生結(jié)構(gòu)研究的深入，部分試驗(yàn)驗(yàn)通過3D 生物打印技術(shù)以模仿真實(shí)的排列方式，進(jìn)而制備組織化的細(xì)胞培養(yǎng)肉。日本大阪大學(xué)的研究人員利用一種支撐浴3D 打印及肌腱-凝膠生物3D 打印技術(shù)（如圖4c），構(gòu)建了72 根細(xì)胞纖維（42 塊肌肉，28 個(gè)脂肪組織和2 條毛細(xì)血管），并仿照真實(shí)和牛細(xì)胞纖維染色后的圖像進(jìn)行手工排列堆疊，最終得到直徑為5 mm、長度為10 mm 的具有大理石紋路的人造牛排[49]。浙江大學(xué)劉東紅團(tuán)隊(duì)通過生物3D 打印技術(shù)模擬真實(shí)魚肉組織結(jié)構(gòu)，基于大黃魚成肌干細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞的增殖分化構(gòu)建出類組織化的細(xì)胞培養(yǎng)魚片[70]。

3.4 其它成型方法

除上述的微載體成型、靜電紡絲成型和3D 打印成型方法外，還有一些如細(xì)胞片工程等方式可將細(xì)胞微組織組裝成型為厘米級或毫米級的組織化人造肉（圖4d）。Shahin-Shamsabadi 等[71]利用無血清細(xì)胞片工程培養(yǎng)C2C12 成肌細(xì)胞和3T3-L1前脂肪細(xì)胞，將18 片細(xì)胞片進(jìn)行堆疊構(gòu)建出一個(gè)寬1 cm，厚1～2 mm 的組織化人造肉。Simsa 等[72]通過纖維蛋白凝膠中植入牛衛(wèi)星細(xì)胞，以血紅蛋白和肌紅蛋白構(gòu)建一個(gè)與熟牛肉顏色相似的13 mm×1.4 mm×2.3 mm 的工程化人造肉。Ben-Arye等[48]在多孔組織化大豆蛋白支架中植入牛衛(wèi)星細(xì)胞、內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)4 d 后通過染色觀察到成型的肌管，制得一個(gè)寬6 mm，厚1～2 mm 的類牛肉薄片，并與市售的牛肌肉有著相似的楊氏模量和極限拉伸強(qiáng)度。Furuhashi 等[73]將膠原蛋白、纖維蛋白和基質(zhì)組成的ECM 水凝膠植入牛成肌細(xì)胞，堆疊在柱子中促進(jìn)收縮排列，利用脈沖培養(yǎng)14 d，構(gòu)建了與商業(yè)牛肉具有相似斷裂力的毫米級類牛肉組織。

4 總結(jié)與展望

由于日益加劇的人口壓力、資源限制和環(huán)境劣變，以及全球肉類消費(fèi)需求的不斷增長，傳統(tǒng)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展逐漸成為一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。細(xì)胞培養(yǎng)肉作為替代蛋白的新興技術(shù)，其依據(jù)動物肌肉組織生長機(jī)理，利用干細(xì)胞由體外三維培育而成，被認(rèn)為是最有可能解決未來肉品生產(chǎn)難題和消費(fèi)困境的方案之一，在解決當(dāng)前肉業(yè)生產(chǎn)效能不足以及公共衛(wèi)生、環(huán)境退化和動物福利等問題方面展現(xiàn)了巨大的潛力。

在細(xì)胞培養(yǎng)肉制備過程中，由于細(xì)胞對三維環(huán)境存在“機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”，支架的組成、表面化學(xué)性質(zhì)以及孔徑、孔隙度在內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征均對細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此，細(xì)胞培養(yǎng)肉支架材料應(yīng)滿足多孔性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、適度的支架結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能、良好的加熱性質(zhì)等原則及要求。常見的細(xì)胞培養(yǎng)三維支架材料包括水凝膠支架、脫細(xì)胞的組織或器官，以及三維多孔支架、纖維和微球在內(nèi)的其它預(yù)成型功能支架。細(xì)胞在支架材料上成功增殖與分化后，還需設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)成型方法使其形成宏觀的工程化組織培養(yǎng)肉，目前微載體成型、靜電紡絲成型、生物3D 打印成型等技術(shù)已被研究證實(shí)為可行的培養(yǎng)肉組織成型手段。

總之，培養(yǎng)肉被認(rèn)為是未來替代傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)模式的技術(shù)發(fā)展方向之一，目前仍處于初期階段，缺乏工業(yè)化生產(chǎn)基礎(chǔ)。此外，還有一些基本問題需要解決，包括高表達(dá)細(xì)胞系、大規(guī)模生物反應(yīng)器、低成本無血清培養(yǎng)基與支架、高效組織成型工程的建立[74，75]，以及相應(yīng)的食品安全性和質(zhì)構(gòu)風(fēng)味特性的調(diào)控。隨著生物、材料與食品技術(shù)的進(jìn)一步融合發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)肉有望成為一種高效生產(chǎn)、綠色環(huán)保且無需動物屠宰的可持續(xù)肉類制造策略，從而緩解未來人口和肉類需求增長帶來的壓力。

致謝

本研究得到浙江大學(xué)上海高等研究院繁星科學(xué)基金資助（SN-ZJU-SIAS-004）。