李春翼，王啟明，張馳，雷小娟，趙吉春，2，明建，2*

（1 西南大學食品科學學院 重慶400715 2 西南大學 食品貯藏與物流研究中心 重慶 400715）

麥醇溶蛋白（gliadin，G）是從小麥中提取的一種植物源醇溶性蛋白質。植物源蛋白具有價格親民、資源豐富、環(huán)境無污染等優(yōu)點，被認為是食品工業(yè)中替代動物蛋白的潛在來源之一[1]。鑒于G的兩親性，可以自組裝成納米顆粒。G 還可以自組裝形成廣泛的中間結構，通常用于藥物或生物活性物質的輸送[2]。在多種黃酮類化合物中，蘆?。╮utin，R）（3'，4'，5'，7'-四羥基黃酮-3-蕓香苷）是槲皮素和鼠李糖-葡萄糖二糖的一種糖基化形式，在蕎麥中含量豐富，又稱蘆苷、槲皮素-3-O-蘆丁苷、維生素P、槐花素，其名字來源于富含蘆丁的植物蘆塔（Ruta graveolens L）[3]。蘆丁的主要缺點是生物利用度受限，歸因于水溶性低、穩(wěn)定性差、膜透性有限，觀察到的體外效應并不總是能轉化為臨床試驗[4]。研究發(fā)現(xiàn)，多酚結合在蛋白質的疏水位點上能改變蛋白質結構，因為只有弱的疏水位點才能留在蛋白質表面，從而引起蛋白質折疊和功能的可能性轉變[5]。鑒于蕎麥和小麥在日常生活中的混合食用以及多谷物產(chǎn)品的出現(xiàn)，G 與R 不可避免地存在相互作用，且有關二者間強烈的相互作用已有文獻[6]報道。

多酚類物質對食品加工條件很敏感，特別是對熱處理。巴氏殺菌或高溫滅菌可能會導致多酚的氧化，這些化合物顯著損失或降解[7]。此外，氧化酚類具有通過各種物理化學途徑與周圍的大分子，包括蛋白質相互作用的潛力，導致食品生產(chǎn)和隨后的貯藏過程中發(fā)生質量惡化[8]。另外，對蛋白質-多酚互作領域的基礎研究通常是在環(huán)境溫度附近進行。在這種條件下，二者的相互作用本質上主要是非共價的（氫鍵、范德華爾力和疏水效應）。然而，還應考慮工業(yè)加工過程中高溫的影響，以便利用高溫條件下蛋白質-多酚化合物相互作用的研究結果有效地指導加工產(chǎn)品。由于蛋白質的結構特征（如構象狀態(tài)或靈活性）會影響其功能[9-10]，包括界面吸附行為和乳化特性，因此，需要探討構象狀態(tài)、靈活性與食物蛋白質功能特性之間的聯(lián)系。

本文研究不同熱處理對G、R 相互作用的影響，通過多光譜技術分析兩者相互作用。通過同步熒光、紫外掃描光譜、拉曼光譜表征蛋白質結構的差異，旨在為G 的結構修飾，改善蛋白功能特性，蛋白質的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥醇溶蛋白，美國sigma 公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；大豆油，九三糧油工業(yè)集團有限公司；其它試劑均為分析純級，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設備

ZEN3690 馬爾文激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機，北京松原華興科技有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；F-2500 熒光分光光度計，日本日立；2450FW 紫外掃描儀，日本Shimadzu 公司；DXR2 激光拉曼光譜儀，美國Thermo Fisher 公司；DSC25 差示量熱掃描儀，美國TA 公司。

1.3 方法

1.3.1 復合物的制備 制備G-R 復合物，參考Filippidi 等[11]的方法。在磁力攪拌下將0.1 g G 和0.01 g R 分別于0.05 L 0.01 mol/L 醋酸溶液，0.05 L 60%（體積分數(shù)）乙醇溶液中分散，于冷藏條件下儲存12 h 后按體積比1∶1 混勻。將0.1 L 所得溶液滴入轉速為10 000 r/min 的0.3 L 水溶液中。均質完成后，所得溶液分別經(jīng)25，60，80，100 ℃處理30 min，冰水浴中冷卻，停止反應。對冷卻后的部分液體留樣檢測，一部分樣品凍干后進行固體樣測定。不加蘆丁的相同條件下制備對照樣品。

1.3.2 粒徑、電位測定 用malvern 激光粒度分析儀（ZEN3690，UK）測定熱處理的G-R 懸浮液的粒度分布及電位值。用去離子水按1:50 的比例稀釋懸浮液，設置溶劑的折射率為1.33。對每個樣液至少測定3 次。

1.3.3 同步熒光光譜 固定282 nm 處的激發(fā)波長，測量同步熒光。設置波長差Δλ 分別為15 nm和60 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均5.0 nm，掃描速度1 500 nm/min。

1.3.4 紫外光譜測定 參考王麗穎[6]方法，以純化水作為空白，將一定量的樣品置樣品池中，測定掃描波長190～400 nm 范圍的紫外吸收光譜。

1.3.5 拉曼光譜分析 將樣品置玻片上，激發(fā)波長785 nm。儀器設置為物鏡20 倍，光斑尺寸1 μm，針孔寬度50 μm，激光能量15 mW，背景曝光4.2 s，曝光次數(shù)42，光柵為400 刻度/nm，收集波數(shù)500～4 000 cm-1范圍的光譜。使用OMNIC 8.2（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）軟件校正基線、平滑以及數(shù)據(jù)歸一化處理（以1 003 cm-1為內(nèi)標）。分析G 的二硫鍵結構。

1.3.6 熱穩(wěn)定性分析 用差示掃描量熱儀（Differential scanning calorimetry,DSC）分析復合物熱穩(wěn)定性[11]。將2.0 mg 試樣放入鋁鍋中，鋁蓋密封，以10 ℃/min 的速度從40 ℃加熱到100 ℃。空白鋁鍋為對照。用分析軟件從各熱曲線上計算變性點的峰值溫度。

1.3.7 乳化活性與乳化穩(wěn)定性測定 將樣品與大豆油5 ∶9（體積比）混合后在10 000 r/min 的轉速下分散3 min。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）參考Shen 等[12]的方法。取10 μL 乳液稀釋于6 mL SDS（0.1 mg/mL）溶液中，在500 nm處測定吸光度。分別根據(jù)方程（1）和（2）計算EAI和ESI 的值。

式中，DF——稀釋因子；C——樣品的初級質量濃度（g/mL）；λ——乳液中 油的體積分數(shù)；A0——納米乳液在0 min 時的吸光度；A1——納米乳液在10 min 時的吸光度；t——10 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)為3 次重復，用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)。使用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)ANOVA 做差異顯著性分析與t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 粒徑電位分析

如表1 所示，麥醇溶蛋白粒徑338.55 nm，多分散指數(shù)較高，溶液分布不均勻。然而，加熱后G溶液的尺寸發(fā)生較大的變化，樣品粒度分布向較大值方向移動。熱處理導致熱聚集現(xiàn)象的發(fā)生。這一結果與文獻[13]報道的一致。60 ℃條件下G-R溶液粒徑較G 有所下降，表明蘆丁有助于G 溶液粒徑的減小，且常溫下G-R 粒徑相較于G 減小，蘆丁的添加對熱誘導的蛋白質聚集產(chǎn)生抑制作用。顆粒的減小主要是由于蛋白質-多酚相互作用增強所致[13]。在加熱前，G 保持原生狀態(tài)，大部分疏水結構域被埋在核內(nèi)，導致與蘆丁的相互作用較弱。然而，加熱帶來蛋白質變性和結構重排，暴露更多隱藏的疏水氨基酸殘基以及多肽鏈解卷[11]，從而大大加強了G 和R 之間的相互作用，產(chǎn)生更緊湊的復合物。此外，R 的負電荷也在增加靜電排斥和阻止進一步聚集方面發(fā)揮作用。80 ℃條件下G 粒徑有所減小，聚集或絮凝的液滴變少，與潘成磊等[14]的研究結果相似。100 ℃條件下，G-R的粒徑相較于G 增加了25.40%，溫度達100 ℃后，R 可連接蛋白質分子，形成更大的復合物[15]。另外，熱處理以及與蘆丁復合后所有樣品的PDI顯著降低，表明樣品尺寸分布變得更窄。

表1 熱誘導后麥醇溶蛋白與蘆丁的猝滅參數(shù)、結合常數(shù)以及結合位點Table 1 Quenching parameters,binding constants and binding sites of wheat gliadin and rutin at different temperatures

Zeta 電位分析表明，添加蘆丁和熱處理均顯著提高了麥醇溶蛋白溶液的絕對Zeta 電位值。通常，較高的凈負電荷或正表面電荷導致較大的靜電斥力，從而抑制聚集，增強體系的穩(wěn)定性。另外，因蛋白質表面凈負電荷增加而產(chǎn)生的強靜電斥力，也會削弱非極性基團之間的疏水作用[16]。熱處理后，隨著加工溫度的升高（至100 ℃），絕對Zeta電位明顯下降，這與Ren 等[13]的研究一致。熱誘導導致電荷發(fā)生重排，部分帶電基團進入蛋白質的內(nèi)部，失去對表面電荷貢獻的能力[13]。

從上述結果看出，蘆丁與麥醇溶蛋白結合對熱誘導的蛋白質聚集體形成起抑制作用，這涉及一個復雜的變性、解離和再聚集過程。結合位點的凈正電荷被蘆丁分子上的負電荷所取代，導致蛋白質聚集體的凈負電荷增加，從而增強蛋白質溶液的膠體穩(wěn)定性[17]。

2.2 同步熒光光譜

同步熒光被廣泛用作研究蛋白質熒光團微環(huán)境變化。設定激發(fā)波長（λex）及發(fā)射波長（λem）的固定波長差為Δλ=15 nm、Δλ=60 nm，分別反映Trp和Tyr 殘基的微環(huán)境變化[18]。Δλ=15 nm、Δλ=60 nm 時其熒光強度均隨蘆丁濃度的增加而降低；當Δλ=15 nm 時，最大吸收波長沒有變化；當Δλ=60 nm 時，色氨酸最大發(fā)射波長出現(xiàn)紅移：25 ℃（276.5→279.5 nm），60 ℃（276→279.5 nm），80 ℃（277→279.5 nm），100 ℃（276.5→279 nm），證實色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）都參與G 熒光的猝滅。R的加入，使蛋白質熒光強度降低，Trp 殘基的熒光強度猝滅強于Tyr 殘基，這表明Trp 的熒光貢獻更強，此現(xiàn)象取決于激發(fā)波長的設置以及兩種氨基酸的相對含量[19]。此外，受蘆丁的影響，Trp 的微環(huán)境極性增加，疏水性降低。

圖1 不同溫度下麥醇溶蛋白/蘆丁相互作用的同步熒光光譜圖Fig.1 The synchronous fluorescence spectroscopy of gliadin-rutin after thermal processings

2.3 紫外掃描光譜

蛋白質的結構及化學變化可通過紫外光譜表征。為了進一步探究麥醇溶蛋白和蘆丁間的相互作用，紫外-可見光譜法利用從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的電子躍遷的特點對吸收光譜進行了監(jiān)測[20]。吸收峰出現(xiàn)在207 nm 及270 nm 左右的波長處，分別表示多肽骨架結構C=O 和氨基酸殘基的吸收[21]。如圖2 所示，未經(jīng)熱處理的麥醇溶蛋白溶液中，在270 nm 附近有一個最大特征吸收峰，對應于色氨酸（Trp）（285 nm）和酪氨酸（Tyr）（277 nm）氨基酸殘基的振動。與蘆丁復合后，G 的吸收峰明顯增加，歸因于這兩個組分之間共價共軛復合物的形成[22]。同樣地，熱處理條件下制備的G-R 溶液表現(xiàn)出明顯高于單一蛋白質溶液的紫外-可見吸收強度，這歸因于兩種組分之間形成了共價結合物[22]。熱誘導后，麥醇溶蛋白組峰強度相對于未經(jīng)熱處理組有所下降（見圖2），這可能是G 結構出現(xiàn)聚集，發(fā)色基團被包裹，從而使紫外光吸收基團減少。由麥醇溶蛋白與蘆丁復合物的紫外吸收可知，熱處理同樣導致吸收峰強度降低，而處理溫度為80 ℃和100 ℃時，該處的峰強度相較于60 ℃處理組有所上升，歸因于G 結構舒展，發(fā)色基團向外翻轉，Trp 和Tyr 殘基暴露。在所有樣品中，峰的位置稍有變化，證實G 氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變。上述結果表明，溫度變化影響麥醇溶蛋白內(nèi)氨基酸殘基的結構和微環(huán)境，從而進一步影響它們與蘆丁的相互作用。

圖2 熱誘導后麥醇溶蛋白/蘆丁復合物的紫外光譜圖Fig.2 The ultraviolet-visible spectroscopy of gliadin-rutin after thermal processings

2.4 側鏈氨基酸分析

用拉曼光譜儀對結構進行分析，通過吸收峰的位置和強度可以表征氨基酸側鏈的構象[23]。760 cm-1處的譜帶起源于色氨酸殘基中蒽環(huán)的振動，可以表征Trp 的微環(huán)境，而760 cm-1（I760）處譜帶的強度反映氫鍵強度和Trp 的暴露程度。I760的下降表明Trp 殘基處于疏水微環(huán)境中，它們對形成更無序的結構有貢獻，而增加值表明Trp 參與親水環(huán)境的氫鍵[24]。如表2 所示，加熱溫度為80 ℃時，G-R 復合物的I760達到最大值0.93，這是由于蛋白質結構展開導致Trp 暴露在更親水的環(huán)境中。當繼續(xù)加熱時，G-R 復合物I760的減少歸因于麥醇溶蛋白在95 ℃處的聚合，將Trp 埋在一個更疏水的微環(huán)境中。25 ℃時，與原麥醇溶蛋白相比，蘆丁的加入使I760減小（0.34），表明Trp 殘基處于疏水微環(huán)境中，這與熒光光譜的結果一致。

850 cm-1和830 cm-1處的酪氨酸（Tyr）雙峰提供了Tyr 殘基中酚羥基的氫鍵信息。當850 cm-1處的譜帶強度高于830 cm-1處時，Tyr 暴露在分子表面，酚羥基作為弱氫鍵的供體或受體，I850/I830值在1.25 左右。如酚羥基作為強氫鍵受體，I850/I830值為2.50。當850 cm-1處的帶強低于830 cm-1處時，Tyr 殘基被埋在參與分子間和分子內(nèi)相互作用的分子內(nèi)[25]。如表2 所示，麥醇溶蛋白I850/I830值為1.06，表明原麥醇溶蛋白酪氨酸暴露在分子表面，形成弱氫鍵。Tyr 作為疏水氨基酸，存在于分子表面，使得疏水性更強。熱處理后，I850/I830值均呈現(xiàn)減小的趨勢，表明熱處理使暴露的氨基酸減小，其中60 ℃和80 ℃處理的麥醇溶蛋白以及100 ℃處理的G-R 復合物中的酪氨酸處于包埋狀態(tài)，參與蛋白聚合過程中分子內(nèi)或分子間氫鍵的形成。

表2 不同溫度下麥醇溶蛋白與蘆丁復合物的酪氨酸色氨酸微環(huán)境Table 2 Tyrosine tryptophan microenvironment of gliadin-rutin complex at different temperatures

2.5 二硫鍵構象分析

二硫鍵（S-S）是蛋白質維持三級結構的關鍵。蛋白構象的變化可以通過測定二硫鍵拉伸振動來評估。S-S 鍵的對稱伸縮振動受S-S 橋中C 原子構象的影響[26]。根據(jù)C-S-S-C 原子結構的不同，490～550 cm-1區(qū)域由以下構象組成：旁-旁-旁式（gauche-gauche-gauche，g-g-g）（500～510 cm-1），旁-旁-反式（guache-gauche-trans，g-g-t）（515～525 cm-1）和反-旁-反式（trans-gauche-tran，t-gt）（535～545 cm-1）[27]。g-g-g 構象被認為能量最為穩(wěn)定。由圖3 可知，麥醇溶蛋白的二硫鍵構象gg-g、g-g-t、t-g-t 占比分別為12.06%，74.68%，13.26%，g-g-t 構象占主要比例。與蘆丁復合后，G的g-g-g 構象有所增加（12.06%→22.90%），表明其穩(wěn)定性提高。熱誘導處理后，G-R 復合物的gg-t、t-g-t 含量減少和g-g-g 構象增加，表明麥醇溶蛋白在熱誘導后形成更穩(wěn)定的S-S 鍵構象，這可以解釋為異常蛋白質折疊和亞基聚集過程中出現(xiàn)的多肽鏈位移[28]。

圖3 不同溫度下麥醇溶蛋白與蘆丁復合物的二硫鍵構象Fig.3 Disulfide bond conformation of gliadin rutin complex at different temperatures

2.6 熱穩(wěn)定性分析

DSC 以測量分子熱變性的變化來表征蛋白質的穩(wěn)定性。熱圖4 顯示廣泛的吸熱轉變。與蘆丁復合后，麥醇溶蛋白的峰值溫度從63.31 ℃升到64.23 ℃。峰值溫度的升高可能與蘆丁通過不同的鍵與麥醇溶蛋白連接有關，比如氫鍵和范德華力[29]。在蘆丁與麥醇溶蛋白結合的情況下，麥醇溶蛋白的結構更加致密。以上結論表明蘆丁可增強麥醇溶蛋白的穩(wěn)定性。相較于未經(jīng)熱處理的樣品，熱處理的麥醇溶蛋白（60，80，100 ℃處理后分別降至61.21，61.52，61.78 ℃）以及麥醇溶蛋白-蘆丁復合物（60，80，100 ℃處理后分別降至63.11，62.05，63.13 ℃）的變性溫度均有所降低，可能的原因是熱處理破壞了有利于G 的化學鍵及相互作用力，導致G 的結構展開，致熱穩(wěn)定性降低[30]。不同的加熱溫度對復合物的變性溫度無顯著影響。

圖4 熱誘導后麥醇溶蛋白與蘆丁復合物的差示掃描量熱譜圖Fig.4 Differential scanning calorimetry of wheat gliadin rutin complex at different temperatures

2.7 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質吸附到油-水界面的能力可用乳化性表征。乳化性能可用乳化活性指數(shù)（EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）評價。EAI 表示每單位質量蛋白質穩(wěn)定的界面面積，而ESI 用于衡量乳狀液濁度[31]。由表3 可知，經(jīng)不同溫度處理，G-R 復合物的乳化活性提高1.96%（60 ℃），20.59%（80 ℃）。熱誘導后，G 結構展開，疏水殘基在G 表面聚集，有利于O/W 界面的生成，G 乳化力增強。隨著處理溫度的增加（100 ℃），暴露出的疏水殘基增多，在G 分子間形成新的非共價鍵，使G 分子聚集（這與粒徑測定的結果一致），O/W 界面的穩(wěn)定性下降，G 乳化能力變低。乳化穩(wěn)定性變化趨勢與乳化活性一致，復合物穩(wěn)定性經(jīng)熱誘導后，提高了13.80%（60℃），27.49%（80 ℃），這可能歸因于經(jīng)熱誘導，G 結構部分展開，疏水基團暴露，油滴表面的蛋白存在疏水相互作用，界面膜的強度得到增強，油滴間難以聚結[32]，從而ESI 增加。

表3 不同溫度下麥醇溶蛋白與蘆丁復合物的乳化活性與乳化穩(wěn)定性Table 3 Emulsifying activity and emulsifying stability of gliadin-rutin complex at different temperatures

3 結論

通過反溶劑法制備G-R 復合物，然后做熱誘導處理，對G 及G-R 復合物的結構產(chǎn)生影響。熱處理導致熱聚集，蘆丁的加入使顆粒粒徑有所減小。溫度的變化影響麥醇溶蛋白內(nèi)氨基酸殘基的結構和微環(huán)境，從而進一步影響它們與蘆丁的相互作用。熱處理使G 的酪氨酸趨于埋藏在G 內(nèi)部結構，熱誘導條件下與蘆丁形成復合物后，麥醇溶蛋白的g-g-t 構象趨于減小，向g-g-g 與t-g-t 構象轉變。蘆丁可增強麥醇溶蛋白的熱穩(wěn)定性，而熱處理削弱了蛋白熱穩(wěn)定性。80 ℃處理后復合物乳液乳化性與乳化穩(wěn)定性最高。