呂艷芳，張紫卿，梁倩倩，李營(yíng)，劉欣欣，李學(xué)鵬*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 200240）

高兒茶酚（Homocatechol），又稱3，4-二羥基甲苯，化學(xué)式為C7H8O2，是一種芳香族衍生物，槲皮素代謝的產(chǎn)物，可通過(guò)還原木質(zhì)素衍生的香草醛，然后脫甲基來(lái)制備[1-2]，結(jié)構(gòu)見圖1。其用途大致可分為3 類：第1 類，可作為中間體制造蘋果型香料、農(nóng)藥、染料等[3]；第2 類，可用于殺菌防腐[3]；第3 類，可用于醫(yī)藥領(lǐng)域制備具有醫(yī)藥活性的化合物，并且該物質(zhì)在抗氧化方面有良好的應(yīng)用[4-5]。Applová 等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)高兒茶酚能有效抑制血小板聚集，甚至比臨床上使用的抗血小板藥物阿司匹林療效更好。Hsiao 等[7]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高兒茶酚能夠縮短熱陣痛時(shí)間，刺激多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，促進(jìn)皮膚神經(jīng)再生。Fukuhara 等[8]通過(guò)給大鼠側(cè)腦室靜脈注射高兒茶酚，發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)防大鼠的慢性疼痛并產(chǎn)生抗抑郁作用。劉春麗等[9]和肖卓炳等[10]通過(guò)研究荔枝果肉和獼猴桃變軟與其多酚氧化酶的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)在多種底物中，高兒茶酚與其多酚氧化酶能較好地結(jié)合。

圖1 高兒茶酚的3D（a）和2D（b）結(jié)構(gòu)圖Fig.1 3D（a）and 2D（b）structures of homocatechol

蛋白質(zhì)是生物體最重要的大分子之一，是一切生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。若小分子參與生物代謝或者可以改變生物大分子的某種理化性質(zhì)，則研究二者間的相互作用，揭示其作用機(jī)理很有意義。牛血清白蛋白（BSA）分子質(zhì)量為66.4 ku，是一種球狀心形蛋白[11-12]。因其與人血清白蛋白是同源蛋白[13-14]，故可廣泛用于蛋白質(zhì)與小分子互作的研究。姚惠芳等[15]、孫艷輝等[16]運(yùn)用光譜法研究篤斯越橘花青素和綠原酸與BSA 的互作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篤斯越橘花青素主要依靠靜電作用力，綠原酸主要依靠疏水作用力與BSA 發(fā)生作用，其猝滅類型均為靜態(tài)猝滅。

本文從熱力學(xué)角度研究高兒茶酚與BSA 的結(jié)合作用。研究二者結(jié)合后BSA 的三維結(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)的變化。利用分子對(duì)接技術(shù)分析二者的結(jié)合位點(diǎn)，旨在為高兒茶酚的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（≥98%），北京中生瑞泰科技有限公司；高兒茶酚（≥99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)（UV2550），日本島津；熒光分光光度計(jì)（970CRT），上海棱光公司；冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（S-4800），日本日立公司；電熱恒溫水浴鍋（DK8D），上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫外光譜法測(cè)定高兒茶酚與BSA 的相互作用 在7 支試管中分別加入2.5 mg/mL，BSA 溶液0.5 mL，接著加入2×103μmol/L 高兒茶酚溶液（0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL），最后用PBS 緩沖液（pH 7.4）定容5 mL，使BSA 終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，高兒茶酚的終濃度分別為0，20，40，60，80，100 μmol/L 和120 μmol/L?；靹蚝?于298 K 下靜置10 min。紫外光譜掃描范圍200～600 nm。

1.3.2 熒光光譜法測(cè)定高兒茶酚與BSA 的相互作用 取24 支試管，分為3 組，每組8 支。按1.3.1節(jié)的方法配制溶液，使BSA 終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，高兒茶酚的終濃度分別為0，20，40，60，80，100，120 μmol/L 和140 μmol/L。將混合后的3組樣品分別置298，310 K 和320 K 恒溫水浴中10 min。熒光檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)281 nm，掃描范圍280～450 nm，狹縫寬度均為5 nm。

1.3.3 熒光猝滅與熱力學(xué)計(jì)算公式 在1.3.2 節(jié)基礎(chǔ)上，通過(guò)Stern-Volmer 方程（1）對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分析其猝滅類型[17]。通過(guò)公式（2）計(jì)算其結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[18]。根據(jù)方程（3）、（4）計(jì)算高兒茶酚與BSA 互作的熱力學(xué)參數(shù)[19]。

式中：F0和F——加入高兒茶酚前、后BSA的熒光強(qiáng)度；Ksv——?jiǎng)討B(tài)猝滅常數(shù)；Kq——猝滅速率常數(shù)；τ0——猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均壽命（10-8s）；Ka1和Ka2——分別為T1、T2溫度下的結(jié)合常數(shù)；R——?dú)怏w常數(shù)（8.314×10-3kJ/mol）[20]。

1.3.4 同步熒光法測(cè)定高兒茶酚與BSA 的相互作用 方法同1.3.1 節(jié)。熒光光譜掃描條件：激發(fā)波長(zhǎng)281 nm，掃描范圍200～400 nm，Δλ 分別為15 nm 和60 nm，狹縫寬度均為1 nm。

1.3.5 高兒茶酚對(duì)BSA 形態(tài)的影響 在3 支試管中分別加入0.25 mg/mL BSA 溶液0.5 mL，接著加 入2×102μmol/L 高兒茶酚溶液（0，0.05，0.10 mL），用去離子水定容5 mL，使BSA 終質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL，高兒茶酚的終濃度分別為0，2，4 μmol/L?；旌先芤河?98 K 下靜置10 min，在培養(yǎng)皿中放入導(dǎo)電硅片，吸取10 μL 樣品溶液平鋪在硅片上，放入35 ℃烘箱中直至樣品完全干燥。將樣品粘貼在樣品臺(tái)上，噴金后掃描電鏡觀察。

1.3.6 分子對(duì)接研究高兒茶酚與BSA 的結(jié)合 BSA的晶體結(jié)構(gòu)（ID：4F5S）從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，利用PyMol 軟件對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行前處理。配體高兒茶酚的2D 結(jié)構(gòu)由Chem Draw 軟件繪制，通過(guò)Chem3D 軟件對(duì)其優(yōu)化，將能量?jī)?yōu)化后的配體保存為PDB 格式文件，然后利用Auto Dock-vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，最后用Discovery Studio（簡(jiǎn)稱DS）、PyMol 軟件作圖，查看對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 高兒茶酚與BSA 相互作用的紫外吸收光譜分析

從圖2a 可以看出高兒茶酚的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在279 nm 處，隨著高兒茶酚濃度的增加，它的吸光值由0.032 增至0.357，而其吸收波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生改變。從圖2b 可以看出，當(dāng)不添加高兒茶酚時(shí)，BSA 在277 nm 處有一個(gè)由BSA 的色氨酸（Trp）與酪氨酸（Tyr）殘基的芳雜環(huán)π-π*躍遷引起的吸收峰[21]。加入高兒茶酚后，當(dāng)其濃度為20～80 μmol/L 時(shí)，BSA 的吸光值由0.125 增至0.333，且波長(zhǎng)從277 nm 紅移至279 nm，說(shuō)明高兒茶酚與BSA 形成了復(fù)合物，在這個(gè)過(guò)程中BSA 結(jié)構(gòu)內(nèi)部的Trp 與Tyr 殘基暴露在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面，使BSA 的疏水性增強(qiáng)，空間構(gòu)象發(fā)生改變[22-23]。當(dāng)高兒茶酚濃度超過(guò)80 μmol/L 時(shí)，BSA 的吸光值增加，其波長(zhǎng)仍保持不變，說(shuō)明二者結(jié)合較好，復(fù)合物的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，二者之間發(fā)生相互作用[24]。

2.2 高兒茶酚與BSA 相互作用的熱力學(xué)分析

2.2.1 高兒茶酚與BSA 相互作用的熒光光譜分析 通常蛋白質(zhì)的熒光是由色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸殘基（Phe）引起的[25]。由圖3 可知，當(dāng)BSA 質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，3 種溫度下，不添加高兒茶酚的BSA 分別在347，349 nm和345 nm 處有一個(gè)強(qiáng)熒光發(fā)射峰。添加高兒茶酚后，3 個(gè)溫度下BSA 的熒光強(qiáng)度隨高兒茶酚濃度的增加均呈下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度為298 K 和310 K時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)藍(lán)移的現(xiàn)象；溫度為320 K時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)先紅移后藍(lán)移，這說(shuō)明高兒茶酚與BSA 發(fā)生了相互作用[26]，且BSA 的峰形和強(qiáng)度沒(méi)有發(fā)生明顯變化，表明高兒茶酚的加入沒(méi)有破壞發(fā)色團(tuán)[27]，僅使蛋白質(zhì)周圍的微環(huán)境發(fā)生改變，內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，蛋白質(zhì)的疏水性增強(qiáng)。

圖3 298（a）、310（b）和320 K（c）時(shí)不同濃度的高兒茶酚與BSA 相互作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of the interaction between BSA and homocatechol of different concentrations at 298（a），310 K（b）and 320 K（c）

2.2.2 高兒茶酚對(duì)BSA 的猝滅類型的判定 動(dòng)態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)（Ksv）隨著溫度的上升而增大，靜態(tài)猝滅反之[28-30]。3 個(gè)溫度下，[Q]與F0/F 擬合出來(lái)的曲線線性關(guān)系良好（圖4）。由表1 可知，隨著溫度的升高，Ksv由4.80×103L/mol 增至1.663×104L/mol，推測(cè)高兒茶酚對(duì)BSA 的熒光猝滅過(guò)程是動(dòng)態(tài)猝滅；又因其Kq值由0.480×1012L/（mol·s）增至1.663×1012L/（mol·s），大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)閾值（2.0×1010L/（mol·s））[31]。這表明二者在結(jié)合的過(guò)程中也存在靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度條件下高兒茶酚與BSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1 Sterne-Volmer quenching constants of the interaction between homocatechol and BSA at different temperatures

圖4 298，310 K 和320 K 時(shí)高兒茶酚和BSA相互作用的Stern-Volmer 擬合圖Fig.4 Sterne-Volmer plot of the interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

2.2.3 高兒茶酚與BSA 作用的結(jié)合位點(diǎn)與結(jié)合常數(shù) 在2.2.2 節(jié)分析中發(fā)現(xiàn)，二者結(jié)合過(guò)程中存在靜態(tài)猝滅。根據(jù)公式（2），以lg[（F0-F）/F]為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)繪制雙對(duì)數(shù)圖（圖5），對(duì)它們的結(jié)合方式進(jìn)行分析。由表2 可知，隨著溫度的升高，高兒茶酚與BSA 之間的Ka值不斷增大，尤其是當(dāng)溫度為320 K 時(shí)，Ka達(dá)到1.535×106L/mol，遠(yuǎn)大于5.908×102L/mol，說(shuō)明高兒茶酚能與BSA 形成復(fù)合物，且溫度升高顯著提高了復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)一步證明高兒茶酚對(duì)BSA 的猝滅以動(dòng)態(tài)猝滅為主[32-33]。在298，310 K 和320 K 時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.763，1.197 和1.518 接近于1，說(shuō)明二者之間至少存在1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。從數(shù)值上看，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)有增大的趨勢(shì)，均未超過(guò)2，推測(cè)隨著溫度的升高，二者的結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)超過(guò)一個(gè)[34]。綜上所述，高兒茶酚對(duì)BSA 的猝滅可能是以動(dòng)態(tài)猝滅為主，也有靜態(tài)猝滅的過(guò)程。

圖5 298，310 K 和320 K 時(shí)高兒茶酚與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)圖Fig.5 Double logarithmic plot of the interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

表2 298，310 K 和320 K 高兒茶酚和BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Binding constants and number of binding sites of interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

2.2.4 高兒茶酚與BSA 的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型 由表3 可知，3 個(gè)溫度下的吉布斯自由能（ΔG）均為負(fù)數(shù)，表明高兒茶酚與BSA 之間的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；熵變（ΔS）和焓變值（ΔH）分別為1 002.567 J/（mol·K）和282.779 kJ/mol，均大于0，說(shuō)明二者在結(jié)合過(guò)程中熵增明顯，屬于吸熱反應(yīng)，且溫度升高有助于增加復(fù)合物的穩(wěn)定性，疏水作用力是該反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力[35-37]。這與楊榮榮等[38]研究的槲皮素與BSA 結(jié)合的作用力類型，俞波等[39]研究酒石酸美托洛爾與BSA 的相互作用力類型相同。

表3 高兒茶酚和BSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interaction between homocatechol and BSA

2.3 高兒茶酚與BSA 相互作用的同步熒光光譜分析

同步熒光光譜中Δλ 為15 nm 和60 nm 時(shí)，分別反映蛋白質(zhì)中酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基的光譜特征，它們的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)與周圍環(huán)境的極性有關(guān)[40]。從圖6a、6b 可以看出，當(dāng)不加入高兒茶酚時(shí)，BSA 的Tyr 和Trp 殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在303 nm 和346 nm 處；隨著加入的高兒茶酚濃度的增大，Tyr 與Trp 殘基的熒光峰分別紅移了1 nm 和3 nm；Tyr 殘基的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)；Trp 殘基的熒光強(qiáng)度則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其峰形均無(wú)明顯變化，這表明高兒茶酚的加入不僅引起Tyr 與Trp 殘基周圍的微環(huán)境發(fā)生改變，還會(huì)降低其疏水性，使肽鍵的伸展程度有所增加。由2.2.3 節(jié)可知，高兒茶酚與BSA 之間至少存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，從Tyr 與Trp 殘基熒光峰的紅移程度來(lái)看，推測(cè)出高兒茶酚結(jié)合在BSA 的Trp 殘基附近。

圖6 高兒茶酚與BSA 相互作用的同步熒光光譜：Δλ=15 nm（a）；Δλ=60 nm（b）Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of the interaction between homocatechol and BSA：Δλ=15 nm（a）and Δλ=60 nm（b）

2.4 BSA 與高兒茶酚相互作用前、后微觀形態(tài)變化

從圖7a 可以看出不添加高兒茶酚時(shí)，BSA 呈近似正方體，分布均勻，存在蛋白顆粒聚集現(xiàn)象。圖7b（2 μmol/L）與圖7a 比較，添加高兒茶酚后，BSA 的聚集現(xiàn)象減少了，說(shuō)明高兒茶酚的加入，促進(jìn)了BSA 在溶液中的溶解，因此圖7b 中蛋白質(zhì)顆粒比較分散。當(dāng)高兒茶酚濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒開始聚集，如圖7c（4 μmol/L）所示。從這個(gè)結(jié)果推測(cè)，高兒茶酚濃度在一定范圍，可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解；當(dāng)高兒茶酚濃度高于2 μmol/L 時(shí)，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。

圖7 高兒茶酚與BSA 相互作用的掃描電鏡圖（×20.0 K）Fig.7 Scanning electronic microscopy images of interaction between homocatechol and BSA（×20.0 K）

2.5 高兒茶酚與BSA 相互作用的分子對(duì)接分析

分子對(duì)接結(jié)果表明，結(jié)合能量越低，大分子與小分子之間結(jié)合越緊密[41]。根據(jù)表4 可知，第3 種模型的結(jié)合能為-5.0 kcal/mol，有4 個(gè)疏水鍵和2個(gè)氫鍵，表明高兒茶酚與BSA 能夠緊密結(jié)合。王曉霞等[42]研究了鹽酸四環(huán)素與BSA 相互作用，其結(jié)合位點(diǎn)在亞結(jié)構(gòu)域IIA（siteⅠ）。另外，小分子與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)通常存在于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 和ⅢA的子域中，即位點(diǎn)siteⅠ與siteⅡ[43]。由圖8a 可知，高兒茶酚結(jié)合在BSA 亞結(jié)構(gòu)域IIA 的疏水腔中（位點(diǎn)siteⅠ）；從圖8b、8c 可以看出，高兒茶酚與BSA 結(jié)合后，形成的化學(xué)鍵主要是疏水鍵，這一結(jié)論與熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。高兒茶酚通過(guò)疏水相互作用與BSA中的Ala209、Ala212、Leu346 和Leu480 結(jié)合，鍵長(zhǎng)分別為4.20，5.28，4.27 ? 和5.32 ?。從圖8c 還可看出，高兒茶酚與BSA 結(jié)合的過(guò)程中還形成兩個(gè)常規(guī)氫鍵（O···H-X），一個(gè)是Lys350 的羧基氧與高兒茶酚羥基的氫形成的，鍵長(zhǎng)為4.41 ?；另一個(gè)是與Glu353 羧基氧形成的，鍵長(zhǎng)為5.06 ?，這些氫鍵在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中起重要的作用。以范德華力結(jié)合作用的氨基酸殘基有Val481、Leu330、Ala349、Arg208、Leu326，雖然范德華力是一種較弱的作用力，但是對(duì)維持復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到支持作用。高兒茶酚被氨基酸殘基形成的疏水口袋包圍著，結(jié)合在Trp213 附近（圖8c），通過(guò)疏水作用力與BSA 相互結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)一步說(shuō)明高兒茶酚能夠猝滅BSA 的內(nèi)源熒光，該結(jié)果與熒光光譜試驗(yàn)結(jié)論相同。

表4 高兒茶酚和BSA 相互作用主要對(duì)接結(jié)果Table 4 Main docking results of interaction between homocatechol and BSA

圖8 高兒茶酚與BSA 相互作用的分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking diagram of interaction between homocatechol and BSA

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，高兒茶酚對(duì)BSA 的猝滅過(guò)程是以動(dòng)態(tài)猝滅為主，也存在靜態(tài)猝滅。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算得出，ΔS、ΔH 為正值，ΔG 為負(fù)值，推測(cè)高兒茶酚與BSA 形成的復(fù)合物主要以疏水作用力來(lái)維持穩(wěn)定，二者結(jié)合過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n 接近于1，且隨著溫度的升高不斷增大，這說(shuō)明高兒茶酚在BSA 上至少存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。2 μmol/L 的高兒茶酚能夠促進(jìn)蛋白的溶解，而當(dāng)高兒茶酚濃度高于2 μmol/L 時(shí)，部分蛋白又重新發(fā)生聚集。從分子對(duì)接結(jié)果看，高兒茶酚在BSA的疏水性口袋結(jié)構(gòu)內(nèi)部存在一個(gè)結(jié)合位（siteⅠ），距離Trp213 很近。結(jié)合光譜試驗(yàn)結(jié)果，加入高兒茶酚改變了BSA 的Tyr 和Trp 殘基周圍的微環(huán)境，最終猝滅Tyr 和Trp 殘基的內(nèi)源熒光。