黃國(guó)，張江江，田澤鵬，羅小雪，孫書(shū)境，隋曉楠*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的食源性植物蛋白，因完整的氨基酸組成、優(yōu)良的功能特性和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。根據(jù)沉降系數(shù)大豆蛋白被細(xì)分為2S、7S、11S 和15S 蛋白，其中7S 和11S 蛋白作為大豆蛋白的主要儲(chǔ)藏蛋白，其含量占大豆蛋白的70%～80%[2]。7S 蛋白（約180 ku）是一種三聚體糖蛋白，由3 個(gè)糖基化亞基α（67 ku），α'（71 ku）和β（50 ku）通過(guò)疏水及靜電相互作用連接[3-4]；而11S（約360 ku）蛋白是一種六聚體非糖蛋白，由亞基酸性多肽A（35 ku）和堿性多肽B（20 ku）通過(guò)二硫鍵連接而成的三聚體進(jìn)一步聚合形成的六聚體[5-6]。近年來(lái)，以食源性蛋白為乳化劑的乳液體系被廣泛研究。大豆蛋白因良好的表面活性及安全性而被用作乳化劑。7S/11S蛋白作為大豆蛋白的主要蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)、組分的變化會(huì)引起乳化特性差異。7S 蛋白較小的分子量，較高的柔韌性，可以很快移動(dòng)到油-水界面形成乳液[7]；而11S 蛋白中高分子量和亞基中較多的二硫鍵限制了其在油滴表面的吸附能力，不能在界面處快速重排并迅速暴露與油相相互作用的疏水區(qū)域，使得11S 蛋白的乳化效果不如7S 蛋白[8]。11S 蛋白較高的聚集度和較多的二硫鍵的特性使其在凝膠功能上優(yōu)于7S 蛋白。這些表明大豆蛋白的不同組分因具有不同的功能而在食品加工中發(fā)揮不同的作用。7S/11S 蛋白之間結(jié)構(gòu)和功能的差異性可能會(huì)影響乳液特性[9]。Puppo 等[10]研究表明7S 蛋白對(duì)整體大豆蛋白乳液起關(guān)鍵作用，在600 MPa下，7S 蛋白乳液液滴絮凝形成結(jié)構(gòu)化乳液，因而具有非常高的表觀黏度；而11S 蛋白乳液微觀結(jié)構(gòu)的未發(fā)生變化。Keerati-U-Rai 等[11]發(fā)現(xiàn)11S 蛋白在大豆蛋白穩(wěn)定的乳液中的剪切稀化行為發(fā)揮了主要作用，與7S 蛋白穩(wěn)定的乳液相比，較大的液滴尺寸、較高的絮凝程度和較高的蛋白質(zhì)含量都有助于11S 蛋白乳液稠度指數(shù)的提高。此外，由于乳液是一種熱力學(xué)失穩(wěn)的混合膠體體系，特別是在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中，乳液往往會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的絮凝失穩(wěn)現(xiàn)象，降低了乳液的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響食品的感官特性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

有研究表明在乳液中添加多酚類(lèi)化合物可以改善乳液的穩(wěn)定性，以多酚與蛋白的復(fù)合體系構(gòu)建的新型乳化劑的研究近年來(lái)引起業(yè)界極大的興趣[12]。EGCG 是綠茶中含量最高、活性最強(qiáng)的兒茶素，其特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒等，同時(shí)也被廣泛地添加于食品之中[13]。EGCG 通過(guò)氫鍵與疏水相互作用與蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其乳液的穩(wěn)定性。趙思明等[14]研究表明EGCG與大豆分離蛋白（Soy protein isolates，SPI）之間依靠疏水作用結(jié)合，并降低了SPI 的β-折疊含量。β-乳球蛋白-EGCG 復(fù)合物能夠在油-水界面發(fā)生結(jié)構(gòu)變化并趨于展開(kāi)，形成薄而帶電的界面膜，從而穩(wěn)定乳液[15]。祝鋼等[16]研究發(fā)現(xiàn)EGCG 與SPI 之間的相互作用增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的抗氧化性；以SPIEGCG 復(fù)合物制備的Pickering 乳液具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，乳液液滴分布均勻，不易聚集。雖然大量研究表明EGCG 的加入能夠改善大豆蛋白乳液的穩(wěn)定性[17-19]，并明晰了EGCG 與7S/11S 蛋白的相互作用[20-21]，但是相關(guān)研究未涉及EGCG 與7S/11S 蛋白的相互作用對(duì)蛋白乳液穩(wěn)定性的影響。明確EGCG 與7S/11S 蛋白的相互作用，不僅可以了解7S/11S 蛋白穩(wěn)定的乳液的特性差異，還可能通過(guò)開(kāi)發(fā)蛋白-多酚復(fù)合乳化劑來(lái)提高蛋白乳液穩(wěn)定性。

基于此，本文在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在中性條件下構(gòu)建大豆蛋白-EGCG 復(fù)合體系，通過(guò)測(cè)定復(fù)合體系三維熒光光譜、熱穩(wěn)定性等探究其相互作用。以其為乳化劑，制備O/W 型乳液。通過(guò)測(cè)定乳液的粒徑分布、色差、液滴形態(tài)，觀察儲(chǔ)藏期分層情況及界面蛋白分布等，研究EGCG 對(duì)7S/11S 蛋白乳液穩(wěn)定性差異的影響，為EGCG 調(diào)控大豆蛋白乳液穩(wěn)定性提供理論依據(jù)，也為大豆蛋白-多酚穩(wěn)定乳液食品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（綏農(nóng)53 號(hào)），國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心；福臨門(mén)玉米油，中糧佳悅（天津）有限公司。

EGCG（純度≥98%），西安通澤生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；所用試劑均為分析純級(jí)；試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-6000 型熒光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；DSC Q2000 差示掃描量熱儀，美國(guó)TA 公司；NANO ZS90 粒度及電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；BX53 正置顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；Mastersize 2000 粒度分布儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；ZE-600 色差計(jì)，日本色電工業(yè)株式會(huì)社；SPCH-EP-IC-10-60 高壓微通道射流均質(zhì)機(jī)，英國(guó)Homogenising Systems Ltd 公司；T25 高速均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA 公司。

1.3 方法

1.3.1 伴大豆球蛋白與大豆球蛋白的制備 參考Nagano 等[22]的方法并稍作修改。大豆經(jīng)萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，按料液比1 ∶3（g/mL）將大豆粉用正己烷脫脂。室溫下攪拌2 h，重復(fù)脫脂5 次，干燥得到脫脂大豆粉。將脫脂大豆粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水中，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.5，室溫?cái)嚢? h 后離心（4 ℃，10 000×g，30 min），向上清液中添加0.98 g/L 干燥后的亞硫酸氫鈉，攪拌使其充分溶解。用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至6.4，置4 ℃冰箱保持過(guò)夜，經(jīng)離心（4 ℃，6 500×g，20 min）得到11S 沉淀物。為獲得7S 蛋白，在離心后的上清液中加入固體NaCl 使其濃度為0.25 mol/L，并用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH值至5.0，攪拌1 h 使其充分溶解，然后離心（4 ℃，10 000×g，30 min）除去沉淀物。向上清液添加等體積的冰冷水，用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至4.8，靜置1 h 后離心（4 ℃，6500×g，20 min）得到7S 沉淀物。

將5 次水洗后的7S/11S 沉淀物重新分散于10 倍的去離子水中溶解并調(diào)節(jié)pH 值至7.5，將蛋白溶液透析48 h（3 500 u），凍干，備用。經(jīng)杜馬斯法（N×6.25）測(cè)定獲得的（91.01±0.05）%和（95.90±0.12）%的7S/11S 蛋白。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分析，制備的7S/11S 蛋白純度分別為（80.07 ±0.13）%，（93.43±0.06）%。

1.3.2 伴大豆球蛋白/大豆球蛋白-EGCG 復(fù)合物的制備 將EGCG、7S/11S 蛋白分別溶解于磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.0）中攪拌2 h，而后將避光的EGCG 溶液超聲脫氣，與7S/11S 蛋白溶液在4 ℃冰箱中放置過(guò)夜12 h，以確保充分水化。將EGCG、7S/11S 蛋白溶液按比例混合，最終配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的7S/11S 蛋白，蛋白與EGCG 質(zhì)量比為1∶0 和2∶1 的混合溶液。避光攪拌2 h，確保充分反應(yīng)。將混合溶液透析48 h（3 500 u），除去游離的EGCG，然后，冷凍干燥獲得7S/11S 蛋白-EGCG 復(fù)合物。

1.3.3 三維熒光光譜測(cè)定 為了描述蛋白-多酚的相互作用，使用三維熒光光譜技術(shù)來(lái)測(cè)量峰位置和峰強(qiáng)度值的相應(yīng)變化。將7S/11S 蛋白及其EGCG 復(fù)合物溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）中，最終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。室溫下勻速攪拌2 h后4 ℃放置過(guò)夜12 h，以確保充分水化。取出，恢復(fù)室溫后進(jìn)行三維熒光光譜測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）設(shè)置為200～350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）為200～500 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬帶均為5 nm，掃描速度2 000 nm/min。

1.3.4 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 參考Ren 等[23]的方法并稍作修改。取5 mg 的EGCG、7S/11S 蛋白及其EGCG 復(fù)合物放入空白坩堝中，加入20 μL PBS（0.01 mol/L，pH 7.0），壓片放置過(guò)夜平衡。用Q2000 差示掃描量熱儀測(cè)定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，以空白坩堝為對(duì)照，測(cè)定溫度20～100 ℃，加熱速度10 ℃/min。采用機(jī)身自帶軟件記錄數(shù)據(jù)及處理DSC 曲線。

1.3.5 蛋白顆粒粒徑分布及ζ-電位的測(cè)定 參考Sui 等[24]的方法，使用NANO ZS90 粒度及電位分析儀對(duì)大豆蛋白及其EGCG 復(fù)合物進(jìn)行粒徑分布及電位測(cè)定。用PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）將樣品稀釋至0.1 mg/mL，過(guò)0.45 μm 水系膜，避免顆粒聚集。其中粒徑分布設(shè)置參數(shù)：折射率分別為1.46和1.33，吸收參數(shù)為0.001。ζ-電位采用激光多普勒電泳光散射技術(shù)測(cè)量，將稀釋后蛋白溶液注入兩端加有電壓的電泳池中，使用Helmholtz-Smoluchowski 方程從試驗(yàn)確定的電泳遷移率直接積分計(jì)算ζ-電位，溫度設(shè)置為25 ℃。

1.3.6 乳液的制備 將EGCG、7S/11S 蛋白分別溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）中攪拌2 h，而后將避光的EGCG 溶液超聲脫氣，與7S/11S 蛋白溶液在4 ℃冰箱中放置過(guò)夜12 h，以確保充分水化。將EGCG、7S/11S 蛋白溶液按比例混合，使其混合溶液包含最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的7S/11S 蛋白及0.00%，0.01%，0.02%和0.03%的EGCG。室溫下避光攪拌2 h，確保充分反應(yīng)。將玉米油按照油水體積比1∶4 添加至混合溶液中，經(jīng)T 25 高速均質(zhì)機(jī)預(yù)乳化（10 000 r/min，2 min），高壓均質(zhì)（150 MPa，4 次）處理后得到新鮮乳液。使用0.1 mol/L HCl/NaOH 將乳液pH 值調(diào)節(jié)至7.0，而后加入0.02%疊氮化鈉抑制微生物生長(zhǎng)。

1.3.7 乳液色差的測(cè)定 使用ZE-600 色差計(jì)測(cè)定7S/11S 蛋白乳液的色差。測(cè)定前使用白板以及光源器件對(duì)儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。測(cè)定參數(shù)包括亮度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）和總色差（ΔE）?？偵睿é）計(jì)算公式：

式中：L0、a0、b0——分別是不添加EGCG 對(duì)照樣品的亮度值、紅度值和黃度值；Li、ai、bi——分別是添加EGCG 樣品的亮度值、紅度值和黃度值。

1.3.8 乳液液滴尺寸及其粒徑分布的測(cè)定 采用Mastersize 2000 粒度分布儀測(cè)定乳液液滴尺寸。儀器參數(shù)設(shè)置：顆粒折射率1.473，顆粒吸收率0.001，分散劑為水，分散劑折射率1.330。采用d4，3、d3，2表示乳液液滴尺寸。

1.3.9 乳液顯微鏡及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性觀察 將制備好的新鮮乳液用PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）適當(dāng)稀釋?zhuān)酶咚黉鰷u振蕩器混勻，移取10 μL 稀釋乳液滴在載玻片上，在顯微鏡下觀察。將新鮮乳液置于2.5 cm×2.4 cm×10 cm 的樣品瓶中觀察，室溫避光儲(chǔ)藏60 d，期間記錄樣品分層情況。

1.3.10 乳液界面蛋白組成的測(cè)定 參考Maneephan 等[25]的方法測(cè)定吸附在界面上的蛋白質(zhì)組成。將新鮮乳液離心（25°C，20 000×g，30 min），小心地從離心管頂部刮除乳霜并在濾紙上干燥，然后，重新分散在PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）中至初始體積。重復(fù)離心步驟3 次，確保除去未吸附蛋白。將最后一次的乳液分散液做SDS-PAGE 凝膠電泳分析。取80 μL 分散液加到20 μL 不含還原劑的5×上樣緩沖液中，沸水浴3 min 變性處理并離心（25°C，10 000×g，10 min），備用。取10 μL 上清液等分試樣裝入含有12%分離膠與5%濃縮膠中，用于蛋白質(zhì)分離。對(duì)濃縮膠、分離膠分別調(diào)節(jié)電壓為60，120 V。用含R-250 考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行浸染，用含冰乙酸及甲醇的脫色液洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)結(jié)果與分析

9.5 軟件繪制圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維熒光光譜結(jié)果分析

采用三維熒光光譜技術(shù)深入了解多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的微環(huán)境和構(gòu)象變化。通過(guò)比較添加和不添加EGCG 的7S/11S 蛋白的光譜變化，可以獲得有關(guān)7S/11S 蛋白構(gòu)象和微環(huán)境變化的有用信息。如圖1 所示，Peak I 的“指紋型”峰是典型的色氨酸、酪氨酸殘基的熒光峰，而Peak II 的“指紋型”峰主要揭示了蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)的熒光行為[26]。11S 蛋白具有較高含量的色氨酸與酪氨酸，與7S 蛋白相比，顯示出更高的熒光強(qiáng)度[3]。添加EGCG，導(dǎo)致7S/11S 蛋白的兩種峰形變得稀疏，顏色變淺，說(shuō)明EGCG 的加入使氨基酸特征熒光峰與多肽鏈骨架峰均有不同程度的降低，表明色氨酸、酪氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生變化，多肽鏈發(fā)生解折疊，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變得伸展[27]。11S 蛋白的稀疏程度要高于7S 蛋白，表明EGCG 與11S 蛋白的互作強(qiáng)度要強(qiáng)于7S 蛋白，使11S 蛋白熒光強(qiáng)度下降更多。以上變化表明EGCG 與7S/11S 蛋白之間存在相互作用，兩者形成復(fù)合物，并改變7S/11S蛋白的微環(huán)境和三級(jí)構(gòu)象，這與Ren 等[23]的研究結(jié)果一致，表明7S/11S 蛋白的Peak I 和II 熒光在很大程度上被花青素-3-葡萄糖苷猝滅，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的解折疊，誘導(dǎo)氨基酸微環(huán)境由疏水向親水轉(zhuǎn)變。

圖1 7S（a）/11S（b）蛋白及其EGCG 復(fù)合物的三維熒光等高線圖Fig.1 Three-dimensional fluorescence contour map of 7S（a）/11S（b）protein and its EGCG complex

2.2 熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性是了解EGCG 與7S/11S 蛋白相互作用的另一方式。如圖2 所示，與7S 蛋白相比，11S 蛋白表現(xiàn)出更高的熱轉(zhuǎn)變溫度，這是由于11S蛋白含有較高含量的含硫氨基酸，能夠形成較多的二硫鍵以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)所致[28]。在圖2a 中，出現(xiàn)微小的11S 蛋白的變性峰，這是因?yàn)樵?S 蛋白提取時(shí)，殘留著少量的11S 蛋白，這與A?ón 等[29]的報(bào)道一致。當(dāng)添加EGCG 時(shí)，7S/11S蛋白的變性轉(zhuǎn)變溫度Td和變性焓ΔH 發(fā)生不同程度的改變，EGCG 與7S/11S 蛋白的相互作用可能使蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)展開(kāi)，從而降低了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。在蘋(píng)果幼果多酚-豬胰腺α-淀粉酶[30]、桑樹(shù)多酚-肌原纖維蛋白[31]等多酚-蛋白相互作用中也報(bào)道了類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。此外，11S 蛋白的Td、ΔH 比7S 蛋白下降的多，表明EGCG 與11S 蛋白具有更強(qiáng)的相互作用，這與三維熒光的結(jié)果是一致的。

圖2 7S（a）/11S（b）蛋白及其EGCG 復(fù)合物的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of 7S（a）/11S（b）protein and its EGCG complex

2.3 蛋白顆粒粒徑分布及ζ-電位

粒徑分布如圖3a 所示，所有樣品均呈單峰分布狀態(tài)。當(dāng)添加EGCG 后，7S/11S 蛋白的粒徑分布均向粒徑大的方向移動(dòng)。大粒徑方向的移動(dòng)暗示蛋白之間可能發(fā)生解折疊和聚集。有研究表明，茶多酚與大豆蛋白間的相互作用可能會(huì)形成高分子量的大顆粒，進(jìn)一步導(dǎo)致聚集體的形成[32]。這可能是由于EGCG 具有多個(gè)酚羥基，可與蛋白發(fā)生交聯(lián)作用；其中，EGCG 充當(dāng)交聯(lián)劑，使蛋白質(zhì)發(fā)生一定的聚集現(xiàn)象[33]。在Ren 等[34]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，黑豆皮提取物多酚的加入使SPI 顆粒的粒徑增大，并且隨著多酚濃度的增加，多酚作為蛋白質(zhì)分子的架橋劑，形成粒徑更大的復(fù)合物。由于11S蛋白具有較高的聚集度，在EGCG 的作用下，可能形成更大的聚集體，與7S 蛋白相比，11S 蛋白粒徑變化更為明顯，這與OCHNIO 等[35]的結(jié)果一致：當(dāng)葉酸作用于7S/11S 蛋白時(shí)，蛋白平均粒徑增加；11S 蛋白似乎更易于自組裝，被葉酸誘導(dǎo)形成更廣泛的聚集體。ζ-電位是決定膠體粒子帶電基團(tuán)之間相互作用強(qiáng)度的重要因素，結(jié)果如圖3b 所示。大豆蛋白的ζ-電位的絕對(duì)值因添加EGCG 而增加，這歸因于在pH 7.0 時(shí)添加帶負(fù)電荷的EGCG，中和了部分帶正電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)。該結(jié)果表明EGCG 可能包圍大豆蛋白質(zhì)分子的表面，進(jìn)而改變其表面電荷分布，進(jìn)一步增強(qiáng)了粒子間的靜電斥力，相對(duì)提高了分散體的穩(wěn)定性。這與Zhou 等[36]的研究結(jié)果相似，添加EGCG 提高了SPI 的ζ-電位，EGCG-SPI 的交聯(lián)可形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中，靜電排斥力對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響小于交聯(lián)引起的影響。隨著ζ-電位的增加，蛋白質(zhì)顆粒的粒徑也增加。在Peng 等[37]對(duì)EGCG 與7S 蛋白的相互作用研究中也觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象。

圖3 7S/11S 蛋白及其EGCG 復(fù)合物的粒徑分布（a）及ζ-電位（b）Fig.3 Particle size distribution（a）and ζ-potential（b）of 7S/11S protein and its EGCG complex

2.4 乳液色差

大豆蛋白乳液食品的可接受性高度取決于乳液食品的顏色特性。如表1 所示，與不添加EGCG的7S/11S 蛋白乳液相比，添加EGCG 的7S/11S 蛋白乳液顯示出較低的亮度值L*，更高的紅度值a*和黃度值b*。EGCG 因自身的顏色效應(yīng)，故作為食品添加劑添至7S/11S 蛋白乳液，使7S/11S 蛋白乳液中呈現(xiàn)一定的紅色[38]。當(dāng)EGCG 為最大添加量時(shí)，7S/11S 蛋白乳液的L*沒(méi)有顯著差異，而7S 蛋白乳液的a*高于11S 蛋白乳液，7S 蛋白乳液的b*和ΔE 低于11S 蛋白乳液。這種乳液產(chǎn)品顏色的差異可能影響消費(fèi)者對(duì)大豆蛋白乳液食品的選擇。

表1 不同濃度的EGCG 對(duì)7S/11S 蛋白乳液的顏色及其液滴尺寸的影響Table 1 Effect of different EGCG concentrations on the color and emulsion droplet size of 7S/11S protein emulsion

2.5 乳液粒徑及其分布

顆粒的體積加權(quán)平均直徑（d4，3）及表面積加權(quán)平均直徑（d3，2）對(duì)乳液液滴的聚集狀態(tài)高度敏感。d3，2值可以提供大多數(shù)顆粒的尺寸信息；而d4，3值可以提供大聚集體的尺寸信息，因?yàn)樗鼘?duì)大顆?；蚓奂w的存在高度敏感[39]。兩者常被用于乳液穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。較小的液滴可能有利于乳液穩(wěn)定性的提高。由表1 及圖4 可知，對(duì)于7S 蛋白乳液，添加EGCG 導(dǎo)致乳液液滴粒徑分布向左移動(dòng)，d4，3值逐漸降低，d3，2值變化不明顯。當(dāng)EGCG 添加量為0.02%，d4，3值為1.429 μm 時(shí)，達(dá)到最小值。同樣的，對(duì)于11S 蛋白乳液，乳液液滴粒徑分布變化 與7S 蛋白類(lèi)似，其d4，3、d3，2值逐漸降低。當(dāng)EGCG 添加量為0.02%，d4，3值為29.639 μm 時(shí)，達(dá)到最小值，d3，2值為6.536 μm。相比于7S 蛋白，11S蛋白乳液液滴粒徑較大，這與Keerati-U-RAI 等[11]的研究一致，表明7S/11S 蛋白具有不同的界面特性，其粒徑和分子結(jié)構(gòu)的差異影響乳液液滴的尺寸和穩(wěn)定性。7S 蛋白由于自身分子量小，聚集度低，能夠快速吸附到油-水界面形成穩(wěn)定的乳液，因此乳化能力強(qiáng)，粒徑較小。而11S 蛋白分子量高，聚集度高，導(dǎo)致其吸附到油-水界面的速率相對(duì)較慢，并且，11S 蛋白剛性的球狀結(jié)構(gòu)在油-水界面處難以展開(kāi)，極大地保持了完整的球形結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致乳液液滴高度絮凝，出現(xiàn)較多的乳液液滴聚集狀態(tài)。另一方面，11S 蛋白的不良的溶解度，當(dāng)作為以凝膠能力主導(dǎo)的大豆蛋白時(shí)，其乳液液滴粒徑>10 μm，乳液樣品黏稠、不易流動(dòng)，在高壓均質(zhì)作用下可能發(fā)生部分凝膠作用，形成凝膠型乳液[40]。Puppo 等[10]也報(bào)道了類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，凝膠型乳液的形成可能有利于乳液穩(wěn)定性的提高。添加EGCG 后，在EGCG 的作用下，7S/11S 蛋白分子部分結(jié)構(gòu)展開(kāi)，在油-水界面發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，親水、疏水基團(tuán)重新排布使乳液液滴界面結(jié)構(gòu)變得緊湊，從而降低蛋白乳液液滴的尺寸，并改善了絮凝的程度，這與Tian 等[41]的研究結(jié)論較一致。Li 等[42]研究表明，與單獨(dú)的米糠蛋白相比，兒茶素-米糠蛋白復(fù)合物展開(kāi)的結(jié)構(gòu)，在均質(zhì)化過(guò)程中更能有效減小乳液液滴尺寸，阻止液滴聚合。

圖4 不同濃度的EGCG 對(duì)7S（a）/11S（b）蛋白乳液液滴粒徑分布的影響Fig.4 Effect of different EGCG concentrations on the particle size distribution of 7S（a）/11S（b）protein emulsion droplets

2.6 乳液顯微鏡觀察結(jié)果及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

乳液樣品經(jīng)高速漩渦稀釋后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡標(biāo)尺測(cè)算的乳液液滴大小可能與激光粒度儀測(cè)定的數(shù)據(jù)不一致。如圖5 光學(xué)顯微鏡圖像所示，7S/11S 蛋白單獨(dú)穩(wěn)定的乳液中出現(xiàn)液滴的絮凝，這與圖4 的結(jié)果較一致。隨著EGCG 濃度的增加，乳液液滴尺寸減小，特別是當(dāng)EGCG 含量為0.02%時(shí)，7S/11S 蛋白乳液液滴較小，分布較為均勻，液滴絮凝狀態(tài)得到改善。圖6 為7S/11S 蛋白及其EGCG 復(fù)合乳液在60 d 儲(chǔ)藏期的分層情況，7S 蛋白單獨(dú)穩(wěn)定的乳液液滴絮凝程度較低，1 周后出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，而隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，分層情況逐漸加劇。添加EGCG 后，7S 蛋白乳液的乳析程度減弱，乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性得到改善。這表明EGCG 能夠提高7S 蛋白乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，這是由于EGCG使7S 蛋白結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，7S 蛋白牢牢吸附于油-水界面處并形成穩(wěn)定的界面膜，從而削弱了液滴的絮凝作用。據(jù)報(bào)道，花青素的加入使SPI 乳液界面膜牢固，提高了SPI 的乳化性及乳化穩(wěn)定性，并在儲(chǔ)存過(guò)程中表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性[12，43]。與7S 蛋白相比，11S 蛋白及其EGCG 復(fù)合乳液由于較大的液滴尺寸，在制備1d 后觀察到乳析現(xiàn)象。此后，這些樣品的分層位置在60d 的儲(chǔ)藏期間沒(méi)有移動(dòng)，表明這些乳液中沒(méi)有發(fā)生進(jìn)一步的乳化。11S蛋白由于在溶液中不良的聚集狀態(tài)，因此很少作為穩(wěn)定乳液的乳化劑，然而，在儲(chǔ)存期間，能夠?yàn)槿橐禾峁┝己玫膬?chǔ)藏穩(wěn)定性[44]。雖然添加EGCG能使11S 蛋白乳液乳滴減小，但是對(duì)11S 蛋白乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性無(wú)明顯影響。這可能是由于添加EGCG 濃度較低，11S 蛋白乳液液滴主要以大尺寸存在。較大的乳液液滴在儲(chǔ)存期間容易發(fā)生絮凝耗竭，導(dǎo)致乳析現(xiàn)象。Zhu 等[45]同樣發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象：低濃度的大豆皂苷（0.05%至0.2%）添加至11S蛋白乳液中，液滴d4，3略有下降，并觀察到顯著的相分離；而添加高濃度（0.25%）的大豆皂苷時(shí)，蛋白乳液液滴d4，3最小，乳液未出現(xiàn)相分離現(xiàn)象。

圖5 不同濃度EGCG 下7S（a）/11S（b）蛋白乳液的光學(xué)顯微鏡圖片F(xiàn)ig.5 Optical microscopy of 7S（a）/11S（b）protein emulsion droplets with different EGCG concentrations

圖6 不同濃度的EGCG 下7S（a）/11S（b）蛋白乳液60 d 儲(chǔ)藏期觀察Fig.6 Observation of 60 days storage period of 7S（a）/11S（b）protein emulsion with different EGCG concentrations

2.7 乳液界面蛋白SDS-PAGE 的結(jié)果

SDS-PAGE 凝膠電泳用于研究EGCG 對(duì)7S/11S 蛋白乳液界面蛋白組成的影響。如圖7 所示，7S 蛋白乳液界面蛋白主要由7S 蛋白固有3 個(gè)亞基：α＇，α 和β 組成，而11S 蛋白乳液界面蛋白主要由酸性A 和堿性B 亞基組成。隨著EGCG 濃度的增加，7S/11S 蛋白乳液的界面蛋白亞基保持完整，7S/11S 蛋白的固有亞基能夠吸附于乳液界面并保持乳液穩(wěn)定[46]。這些結(jié)果表明：添加EGCG后，7S/11S 蛋白乳液的穩(wěn)定性不受界面蛋白組成的影響。這與Hu 等[47]的研究結(jié)果一致：高壓均質(zhì)后，SPI 亞基均存在于油相中且保持完整，SPI 乳液界面蛋白亞基不影響乳液的穩(wěn)定性。除此之外，凝膠頂部顯示出一定的蛋白聚集體，這是由于蛋白乳液界面處的一些界面蛋白具有致密的界面層，這使得它們無(wú)法通過(guò)濃縮和分離凝膠[48]。致密的界面層可能會(huì)改善的乳液穩(wěn)定性。對(duì)于所研究的EGCG-7S/11S 蛋白復(fù)合乳化劑穩(wěn)定的乳液，7S/11S 蛋白和EGCG 均在界面處吸收，可能形成有助于乳液穩(wěn)定的混合物致密層。

圖7 不同濃度的EGCG 下7S/11S 蛋白乳液的界面蛋白組成Fig.7 Interfacial protein composition of 7S/11S protein emulsion with different EGCG concentrations

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了中性條件下EGCG 與7S/11S蛋白間的相互作用形成的大豆蛋白-EGCG 復(fù)合物對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：1）三維熒光光譜及熱穩(wěn)定性顯示EGCG 與7S/11S 蛋白發(fā)生相互作用，引起蛋白質(zhì)多肽鏈解折疊，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性降低，蛋白質(zhì)顆粒粒徑增大，ζ-電位增高，且11S 蛋白與EGCG 比7S 蛋白互作更強(qiáng)，變化更加明顯。2）EGCG 的加入使得蛋白乳液亮度降低，紅度值、黃度值增加，在一定程度上改善了7S/11S蛋白乳液的絮凝程度，使得蛋白乳液液滴尺寸減小，分布較為均勻；11S 蛋白乳液仍以較大聚集的液滴存在。3）在儲(chǔ)藏期間，11S 蛋白乳液穩(wěn)定性?xún)?yōu)于7S 蛋白，EGCG 的添加提高了7S 蛋白乳液的穩(wěn)定性，而對(duì)11S 蛋白乳液無(wú)明顯影響。此外，

EGCG 沒(méi)有改變7S/11S 蛋白乳液界面蛋白的亞基分布，7S/11S 蛋白乳液的穩(wěn)定性不受界面蛋白組成的影響。