魏禎禎，宋程威，郭麗麗，郭琪，侯小改

‘鳳丹’牡丹基因的克隆及表達分析

魏禎禎，宋程威，郭麗麗，郭琪，侯小改*

(河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471023)

為克隆‘鳳丹’()花瓣衰老相關(guān)基因的序列，分析其編碼蛋白性質(zhì)，探索其在不同發(fā)育時期花瓣、不同組織和不同品種的表達模式及對乙烯的響應，采用RT–PCR技術(shù)，從‘鳳丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相關(guān)基因。該基因?qū)儆贏P2/ERF家族，其開放閱讀框(ORF)為636 bp，編碼1個由211個氨基酸殘基組成的蛋白，含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，不包含跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白相對分子質(zhì)量約為53 000，理論等電點(pI)為5.13，為不穩(wěn)定蛋白，具有親水性；qRT–PCR分析結(jié)果表明，基因在露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期均有表達，主要在‘鳳丹’露色期的花瓣和葉片中表達；在早花‘鳳丹’突變株系中表達量最高；基因在早花‘鳳丹’突變株系與‘鳳丹’中的序列相同，不存在堿基差異；基因?qū)σ蚁┯许憫浔磉_量隨處理時間和生育進程的延長呈逐漸升高的趨勢，推測該基因可能與乙烯誘導后導致花衰老進程相關(guān)。

‘鳳丹’牡丹；；基因克隆；表達分析

基因?qū)儆贏P2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族ERF亞家族的B4類，編碼的蛋白含有1個由58個基因組成的保守AP2結(jié)構(gòu)域，在抵抗大豆疫霉、抵御非生物脅迫、調(diào)節(jié)花衰老、促進愈傷組織形成和根生長等植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[1–3]。KHASKHELI等[4]在玫瑰中發(fā)現(xiàn)基因的表達受乙烯誘導，在萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等大多數(shù)花器官的衰老過程中表達量上調(diào)，采用VIGS技術(shù)使基因沉默，加速了玫瑰花的衰老，并且在花衰老過程中細胞分裂素含量呈降低的趨勢，與細胞分裂素有關(guān)9個基因()，()，，()，，()，，()和的表達水平也隨之降低，但這種衰老過程可以通過外源細胞分裂素處理得到恢復。

牡丹(Andr.)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬()植物，原產(chǎn)于中國，是傳統(tǒng)觀賞植物，被廣泛栽植，觀賞價值高，市場需求量大[5–6]。目前關(guān)于牡丹花期調(diào)控的研究多注重于通過栽培、生長調(diào)節(jié)劑等手段延長花期，對其分子機制的研究不多[7–10]。本研究以‘鳳丹’花瓣為試驗材料，克隆獲得‘鳳丹’基因序列，采用生物信息學技術(shù)對PoERF113蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)等進行預測分析，運用實時熒光PCR技術(shù)研究基因的時空表達模式與不同花期、不同組織和不同品種的相關(guān)性及對乙烯的響應，并對基因在早花‘鳳丹’突變株系與‘鳳丹’中的基因序列進行比對，以期為后續(xù)基因的相關(guān)功能研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　植物材料

九年生早花‘鳳丹’種植于河南科技大學實驗園區(qū)內(nèi)；早花‘鳳丹’突變株系種植于洛陽隋唐植物園；晚花‘蓮鶴’種植于洛陽國際牡丹園。

1.2　試驗方法

1.2.1總RNA提取及cDNA的合成

取‘鳳丹’葉片、莖、花萼和不同時期(露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期)的花瓣和用10 mg/L外源乙烯整株噴施圓桃期‘鳳丹’后第1、2、4、8天的花瓣以及早花‘鳳丹’突變株系、‘蓮鶴’半開期的花瓣，采用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)完成總RNA的提?。徊捎肞rimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit獲取cDNA。

1.2.2‘鳳丹’基因的克隆

從前期得到的‘鳳丹’三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出基因序列，利用Primer Premier 5.0設計基因克隆及實時熒光定量PCR特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。50 μL PCR擴增體系包括2 μL cDNA模板、1 μL TransStart FastPfu DNA Polymerase、10 μL 5×Trans Start FastPfu Buffer、4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、2 μL 引物–F和2 μL–R(10 μmol/L)、29 μL ddH2O。反應程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)；72 ℃延伸7 min?；騊CR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與pMD18–T Vector載體連接后轉(zhuǎn)至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，利用M13引物進行普通PCR檢測，篩選出陽性單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1　PoERF113基因克隆及qRT–PCR分析引物

1.2.3‘鳳丹’基因生物信息學分析

利用Translate(http://web.expasy.org/translate/)對基因推導的氨基酸序列進行分析；根據(jù)基因的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，運用ProtParam(https://web.expasy.org/ protparam/)分析PoERF113蛋白特性理化性質(zhì)；運用在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)分析PoERF113蛋白保守結(jié)構(gòu)域；運用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析PoERF113蛋白親疏水性；運用NetPhos(http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析PoERF113蛋白磷酸化位點；運用TMHHMM(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM–2.0/)分析PoERF113蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；運用SPOMA(https://npsa–prabi.ibcp.fr/cgi– bin/secpred_sopma.pl)和SWISS–MODEL(https:// www.swissmodel.expasy.org/interactive)預測蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4基因的表達模式分析

根據(jù)測序所得的基因的ORF序列，通過Primer Premier 5.0設計特異性引物，進行qRT–PCR試驗。以基因為內(nèi)參基因，使用寶生物工程(大連)有限公司的實時熒光定量試劑盒(TB GreenTM Premix Ex Taq II) 檢測基因的表達量，每個樣品設置3個生物學重復。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量[11]；運用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理與分析；運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析；運用Origin 8.0繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　‘鳳丹’PoERF113基因的克隆及推導的氨基酸序列

提取‘鳳丹’花瓣的總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示條帶明亮、清晰，28S帶的亮度約為18S帶亮度的1.5～2.0倍，RNA質(zhì)量較好(圖1)。

M　DL2000 DNA Marker；1　總RNA。

以‘鳳丹’花瓣為材料提取花瓣組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，利用特異性引物PoERF113–F和PoERF113–R進行擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2)顯示：在約750 bp處發(fā)現(xiàn)1條清晰的特異性條帶，與目的片段預測條帶大小一致，該基因長706 bp。通過NCBI(National Center for Biotechnology Information)在線工具對其包含的開放閱讀框進行分析，ORF為636 bp，編碼211個氨基酸殘基，ORF序列及推導的氨基酸序列如圖3所示。

M　DL2000 DNA Marker；1　PoERF113基因。

圖3　‘鳳丹’PoERF113基因推導的氨基酸序列

2.2　‘鳳丹’PoERF113蛋白的預測分析

2.2.1‘鳳丹’PoERF113蛋白特性分析及保守結(jié)構(gòu)域預測

利用ProtParam對候選基因進行蛋白特性分析，結(jié)果表明該蛋白的相對分子質(zhì)量為53 000，理論等電點(pI)為5.13，脂肪系數(shù)為28.93，不穩(wěn)定系數(shù)為52.83，大于40，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

利用NCBI中CDD(cyclic delay diversity，循環(huán)延遲分集)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對PoERF113蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域預測。結(jié)果(圖4)表明，該基因編碼的蛋白具有AP2超家族結(jié)構(gòu)域和特殊的DNA結(jié)合位點，屬于AP2家族一員。

圖4　PoERF113基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果

2.2.2‘鳳丹’PoERF113蛋白親/疏水性預測和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

運用Protscale對PoERF113蛋白進行親疏水性分析，結(jié)果(圖5)顯示，疏水氨基酸(正值)少于親水氨基酸(負值)，表明該蛋白為親水性蛋白。

圖5　PoERF113蛋白親疏水性預測分析結(jié)果

通過TMHMM對基因進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果(圖6)表明，該基因編碼蛋白的1～231位氨基酸定位于細胞膜表面，推測PoERF113蛋白可能不包含跨膜結(jié)構(gòu)。

圖6　PoERF113蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.3‘鳳丹’PoERF113蛋白磷酸化位點分析

磷酸化主要集中在Tyr(酪氨酸)、Ser(絲氨酸)、Thr(蘇氨酸)殘基上，這些殘基上具有游離的羥基，且本身不帶電荷，磷酸化后的蛋白質(zhì)具有電荷，引起結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性的變化。NetPhos預測結(jié)果(圖7)表明，基因編碼的氨基酸序列中有19個Ser位點、10個Thr位點、4個Tyr位點。

圖7　PoERF113蛋白磷酸化位點分析結(jié)果

2.2.4‘鳳丹’PoERF113蛋白高級結(jié)構(gòu)預測分析

運用SOPMA預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖8)顯示，PoERF113蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)中α–螺旋包含54個氨基酸，延伸鏈包含29個氨基酸，β–轉(zhuǎn)角包含12個氨基酸，無規(guī)則卷曲包含116個氨基酸。如圖9所示，PoERF113蛋白的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果保持一致。

圖8　PoERF113蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

圖9　PoERF113蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.3　‘鳳丹’PoERF113蛋白系統(tǒng)進化樹分析

將基因的氨基酸序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，采用bBLAST x算法，選擇10條同源性較高的氨基酸序列進行多序列比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，這10條序列分別為美國山核桃(，KAG2678378.1)，楊梅(，KAB1217539.1)，大葉櫟(，XP 030937739.1)，蘋果(，XP 017183622.1)，非洲相思子(，XP 027360534.1)，葡萄(，CBI15759.3)，藤堤(，XP 034672620.1)，南瓜(，XP 021622666.1)，菠菜(，XP 021844726.1)，藜麥(，XP 021731943.1)，利用MEGA X軟件分析‘鳳丹’牡丹基因與其他物種的進化關(guān)系，比對結(jié)果如圖10所示。從圖10可以看出，‘鳳丹’基因與南瓜、菠菜、葡萄的親緣關(guān)系較近，與美國山核桃、楊梅等植物親緣關(guān)系較遠。

圖10　‘鳳丹’PoERF113蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果

2.4　‘鳳丹’PoERF113基因表達模式分析

為確定基因在‘鳳丹’牡丹花發(fā)育不同時期花瓣中的表達情況，利用熒光定量PCR技術(shù)，以基因為內(nèi)參基因，測定其在露色期、初開期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期花瓣的相對表達量。結(jié)果(圖11)表明，基因在‘鳳丹’牡丹各個花發(fā)育階段中均有表達，且不同花期的相對表達量存在差異。在露色期花瓣的相對表達量最高，初開期花瓣中的相對表達量最低。

柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

為分析基因在組織中的表達模式，選取同時期葉片、莖、花萼和花瓣進行qRT–PCR，以‘鳳丹’牡丹的花瓣為對照。結(jié)果(圖12)表明，基因在‘鳳丹’葉片、莖、花萼和花瓣中均有表達，在 ‘鳳丹’葉片的基因的表達量極顯著高于莖、花萼和花瓣中的表達量，說明基因主要在葉片中表達。

柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

為明確基因的表達特性，利用qRT–PCR技術(shù)對早花‘鳳丹’突變株系、早花‘鳳丹’和晚花‘蓮鶴’中基因的表達進行分析。結(jié)果(圖13)表明，基因在早花‘鳳丹’、晚花‘蓮鶴’的花瓣中均有表達。在早花‘鳳丹’突變株系的相對表達量最高，約為‘鳳丹’的相對表達量的4.88倍，約為‘蓮鶴’的相對表達量的6.54倍。

柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

采用10 mg/L的外源乙烯處理‘鳳丹’牡丹花瓣，發(fā)現(xiàn)基因的表達量隨處理時間的延長逐漸上升(圖14)，且表達量存在顯著差異性?；蛟谔幚淼?天時相對表達量最高，約為處理第1天的10倍，表明基因能被乙烯誘導表達，推測基因可能參與了乙烯信號傳導途徑。

柱上不同字母示處理間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5　早花‘鳳丹’突變株系及‘鳳丹’PoERF113基因序列比對

為進一步探究基因在花期調(diào)控中的功能，以早花‘鳳丹’突變體花瓣cDNA為模板，采用相同的引物與擴增條件進行RT–PCR擴增，利用DNAMAN 6.0對基因在自然狀態(tài)下‘鳳丹’和早花‘鳳丹’突變株系中的序列進行比對。結(jié)果表明，早花‘鳳丹’突變株系基因與‘鳳丹’的序列不存在差異，2條序列的ORF框完全相同。

3　結(jié)論與討論

APETALA2/ERF(Apetala2/Ethylene–responsive factor，AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子家族作為最早被鑒定與乙烯響應基因相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，且在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著不同的功能[12–14]。研究人員在擬南芥、桃、蘋果等多種植物進行了全基因組的鑒定及相應功能的研究，在擬南芥中鑒定出122個AP2/ERF家族成員[15]，在桃中鑒定出131個AP2/ERF家族成員[16]，在蘋果中鑒定出259個AP2/ERF家族成員[17]，在柑橘中鑒定出126個AP2/ERF家族成員[18]。

本研究通過克隆得到‘鳳丹’牡丹基因，并對該基因編碼的氨基酸序列進行了一系列生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贏P2/ERF家族，編碼蛋白含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，不包含跨膜結(jié)構(gòu)，為不穩(wěn)定蛋白，與易萍等[19]鑒定出的芒果基因特征相符?；蛟诼渡凇⒊蹰_期、半開期、盛開期、始衰期、衰敗期均有表達，但主要在露色期的花瓣中表達，與玫瑰基因在開花的第五個階段(花朵完全綻放)表達量達到高峰的表達模式不同[4]。前人研究結(jié)果表明，同源基因在不同物種中的時空表達既有共性又有差異。蜻蜓鳳梨基因在外葉、心葉、莖、根中均有表達，但表達量較低，成熟的根中的表達量高于幼根，在花器官中表達量維持在較低水平[20]。本試驗結(jié)果顯示，基因在‘鳳丹’的葉片、花瓣、莖、萼片中均有表達，在葉片中的相對表達量最高，在莖中的相對表達量最低，這暗示基因可能主要調(diào)控葉片的生長發(fā)育。

花衰老是一個高度程序化的過程，由多方面因素共同作用，伴隨著植物體內(nèi)內(nèi)源激素、自由基代謝、細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)解體和膜系統(tǒng)的降解等一系列生理生化過程[21]。植物激素可以調(diào)節(jié)植物開花進程，乙烯、茉莉酸和脫落酸作為植物花衰老促進劑，生長素和細胞分裂素類激素發(fā)揮抑制花衰老的作用[22]。乙烯在植物生長和衰老中起重要作用，在花衰老期間，乙烯的積累成為促進植物衰老的關(guān)鍵步驟[23]。研究表明，外源乙烯處理‘洛陽紅’切花可以促進其內(nèi)源乙烯的生成[24]；對于乙烯依賴型植物，內(nèi)源乙烯的生成將導致植物花衰老[25]；對于乙烯不依賴型植物，外源乙烯的應用不會引導其產(chǎn)生大量的內(nèi)源乙烯，但也可以促進花衰老[26]。研究表明，擬南芥、蜻蜓鳳梨等多個物種的同源基因均響應乙烯處理。外源乙烯處理6～24 h內(nèi)，擬南芥基因表達量呈逐漸上升的趨勢[2]。外源乙烯處理1 h后，蜻蜓鳳梨基因在幼株和成株外葉、心葉、莖中表達量上升，響應乙烯誘導[20]。本研究中用乙烯噴施‘鳳丹’植株，基因?qū)σ蚁┯兴憫?，處理后，基因表達量升高，這與AGUSTí等[27]在柑橘()中的研究結(jié)果類似。推測該基因可能與乙烯誘導后導致花衰老進程相關(guān)。

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Cloning and expression analysis ofgene in‘Fengdan’

WEI Zhenzhen，SONG Chengwei，GUO Lili，GUO Qi，HOU Xiaogai*

(College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471023, China)

To investigate the petal senescence-related geneof ‘Fengdan’ () expression patterns in petals, different tissues and different varieties at different flowering stages and their response to ethylene, we did cloning analyzed its coded protein properties in this study. First, we used RT-PCR technology to clone thepetal senescence related genegene from ‘Fengdan’. The gene belongs to AP2/ERF family. Its open reading frame(ORF) is 636 bp, encoding a protein consisting of 211 amino acid residues. It contains one AP2 conservative domain and does not contain transmembrane structure. The molecular weight of the protein is about 53 000, and the theoretical isoelectric point (pI) is 5.13. It is unstable protein and hydrophilic. The results of qRT-PCR analysis showed thatgene was expressed in the open color stage, the first open stage, the half open stage, the full bloom stage, the first decline stage, and the decline stage, mainly in the petals and leaves of ‘Fengdan’ in the open color stage; The highest expression was found in ‘Fengdan’ mutant strain of Zaohua; The sequence ofgene in the ‘Fengdan’ mutant line of Zaohua was the same as that in ‘Fengdan’ and there was no base difference;gene was responsive to ethylene, and its expression level gradually increased with the extension of treatment time and growth process. It was speculated that this gene might be related to the process of flower senescence induced by ethylene. This experiment laid a preliminary foundation for further study on the function ofgene and its molecular mechanism in peony petal senescence and florescence regulation.

‘Fengdan’;; gene cloning; expression analysis

Q786；S685.11

A

1007-1032(2022)06-0659-07

魏禎禎，宋程威，郭麗麗，郭琪，侯小改．‘鳳丹’牡丹基因的克隆及表達分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2022，48(6)：659–665．

WEI Z Z，SONG C W，GUO L L，GUO Q，HOU X G．Cloning and expression analysis ofgene in‘Fengdan’[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：659–665．

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2022–10–27

2022–11–06

國家自然科學基金項目(U1804233)；河南省創(chuàng)新型科技人才隊伍建設工程(202101510003)；河南省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(2021–24)

魏禎禎(1996—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事牡丹抗旱栽培與分子生物學研究，z35089658@163.com；*通信作者，侯小改，博士，教授，主要從事牡丹栽培生理生態(tài)與分子生物學研究，hkdhxg@haust.edu.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2022.06.005

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正