玉山江 ·艾克木，哈麗達·木沙，王曉騰，鄭 靜

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院干一科，新疆 烏魯木齊 830054; 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部綜合科，新疆 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，白蛋白尿是評估DN進展的重要指標之一[1]。而研究發(fā)現(xiàn)腎足細胞超微結(jié)構(gòu)的改變及其相關(guān)分子表達的變化在DN的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，主要表現(xiàn)為腎足細胞的數(shù)量減少，且合并腎足細胞代償性的肥大與足突胞體增寬，從而導(dǎo)致腎小球濾過屏障的通透性增加引發(fā)蛋白尿[2-3]。西紅康具有益氣養(yǎng)陰、滋補肝腎與活血化瘀的功效。前期的研究證實其可有效減少DN患者微量白蛋白排出，達到良好的治療效果并顯著提高患者生活質(zhì)量[4]。本研究擬通過動物實驗探討西紅康對2型糖尿病腎病腎臟足細胞結(jié)構(gòu)的影響，從病理學(xué)角度探究西紅康保護腎臟、降低尿蛋白的作用機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級8周齡雄性Wistar大鼠50只，體重200～220 g，全部飼養(yǎng)自我院實驗動物中心。晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidationprotein products，AOPPs)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒、鏈脲佐菌素(STZ)與微量尿白蛋白測定試劑盒購自美國 Sigma 公司；固定試劑(3%戊二醛、1%鋨酸)與脫水劑(50%、70%、90%的乙醇，90%的丙醇，90%的乙醇∶90%的丙酮=1∶1 混合液)購自南京建成生物工程研究所。包埋劑(Epon812 環(huán)氧樹脂)；光影染色液(0.5%的甲苯胺藍)與電子染色劑(醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛)購自中生北控生物科技股份有限公司。西紅康購自我院中藥房，并將其熬制成中藥湯劑，塑料無菌包裝。

1.2 分組及模型建立 將50只SPF級8周齡雄性Wistar大鼠分為空白對照組(n=10)和 DN模型組(n=40)，測量記錄每只大鼠的初始體重。給予空白對照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，而DN模型組則予以高脂高糖飲食喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，DN模型組以小劑量STZ(15～25 mg/kg)腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功)，而空白對照組大鼠給予等體積0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液注射。將造模成功的DN大鼠隨機平均分為四組：模型對照組(n=10)、西紅康小劑量組(n=10)、西紅康中劑量組(n=10)與西紅康大劑量組(n=10)，給予各組大鼠普通飼料喂養(yǎng)外，西紅康小、中、大劑量治療組分別給予西紅康3、6、12 g/(kg·d) 湯劑灌腸，空白對照組和模型對照組每日給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌腸，共飼養(yǎng)30 d。

1.3 動物取材及指標測定 干預(yù)結(jié)束后，大鼠剪尾取靜脈血，用血糖儀測空腹血糖(FBG)水平，在根據(jù)AOPPs ELISA試劑盒說明書，按順序加入標本、標準樣、帶有辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，然后溫育并且徹底地洗滌，顯色后應(yīng)用酶標儀在吸收波長為450 nm波長下測定其吸光度，即可以計算出樣品AOPPs的濃度；收集12 h夜尿后嚴格按照微量尿白蛋白測定試劑盒說明書操作，根據(jù)其濁度結(jié)果得出樣品中尿微量白蛋白(Microalbumin，mALB)水平。大鼠禁食12 h后，麻醉狀態(tài)下解剖取出腎臟，取一部分腎皮質(zhì)組織放于甲醛固定液中保存，標上編號送檢。經(jīng)脫水、滲透、包埋后切片，染色于電鏡下觀察。觀察足細胞計數(shù)、足突平均寬度(FPW)及足突融合率、腎小球基底膜平均厚度(GBM)平均厚度，具體如下：①足細胞計數(shù)：每例至少觀察3個腎小球，隨機選取10個視野，計數(shù)足細胞個數(shù)。②足突寬度：測定足突兩側(cè)膜間的距離在裂化膜水平上，算出其平均值。③足突融合率：首先量出GBM總長度，標為X，然后量出 GBM 上足突合的總長度，設(shè)為Y，再用Y除以X，即為融合率。④GBM：將GBM 分成若干個點，然后在每點GBM測定其厚度，再相加各點服M的厚度設(shè)為X，其測定的點數(shù)設(shè)為Y，最后用X除以Y，即為各組GBM的平均厚度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗和Fisher精確檢驗；計量資料用均數(shù)±標準差表示并采用獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 空白對照組與DN模型組各項生化指標比較 DN模型組體重、FBG、FINS、HOMR-IR、TG、TC、mALB與AOPPs水平較空白對照組均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 空白對照組與DN模型組各項生化指標比較

2.2 不同劑量西紅康對大鼠FBG、mALB與AOPPs水平的影響 干預(yù)治療30 d后，各劑量西紅康治療組與模型對照組比較，F(xiàn)BG、mALB與AOPPs水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但各劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同劑量西紅康對大鼠FBG、mALB與AOPPs水平的影響

2.3 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 干預(yù)治療30 d后，各劑量西紅康治療組與模型對照組比較，足細胞計數(shù)、足突寬度、足突融合率與GBM均明顯增高或降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西紅康大劑量組、西紅康中劑量組與西紅康小劑量組比較，足細胞計數(shù)、足突寬度、足突融合率、GBM差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著西紅康劑量的增加，大鼠腎小球GBM增厚、足突斷裂、排列不整齊與足突融合(如圖1中箭頭所示)等現(xiàn)象明顯減輕。見表3。

表3 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結(jié)構(gòu)的影響(熒光染色，×400)

3 討 論

DN患者腎活檢中早期特征性的病理變化是腎小球病變，主要病變?yōu)閺浡阅I小球硬化、結(jié)節(jié)性腎小球硬化和腎小球基底膜增厚[5]。彌漫性腎小球硬化是光鏡下最早可觀察到的病理變化，而隨著DN病程的進展，彌漫性腎小球硬化逐漸發(fā)展為結(jié)節(jié)性腎小球硬化，而結(jié)節(jié)性病變也稱為 Kimmelstiel-Wilson 結(jié)節(jié)，可在約25%的晚期DN患者中觀察到[6]。彌漫性腎小球硬化與結(jié)節(jié)性腎小球硬化實際上是DN的兩個階段，與彌漫性腎小球硬化比較，已發(fā)展到結(jié)節(jié)性腎小球硬化的DN患者的腎功能損害更嚴重，且病程也更長，預(yù)后更差[7]。雖然腎小球病變一直是DN研究的重點，但最新的研究發(fā)現(xiàn)腎小球外病變也對疾病的發(fā)生與進展有重要的影響，腎小管間質(zhì)病變包括腎小管萎縮、間質(zhì)性炎癥和腎小管間質(zhì)纖維化，同樣與腎功能損害密切相關(guān)[8-9]。DN是一種糖尿病性微血管病，因此腎小球入小動脈和腎小球出小動脈也會發(fā)生玻璃樣變，而腎小球出小動脈玻璃樣變也是DN與高血壓腎病的鑒別要點[10-11]。實際上腎小球內(nèi)皮細胞損傷、足細胞損傷等異常病變也和DN的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。

本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量西紅康干預(yù)后，大鼠AOPPs和尿微量白蛋白水平較前均明顯減少組，但是西紅康大劑量組、西紅康中劑量組對大鼠腎小球GBM增厚、足突斷裂、排列不整齊、足突融合等現(xiàn)象的改善作用明顯優(yōu)于西紅康小劑量組，這說明西紅康可減少尿白蛋白，改善腎功能，對DN的防治有重要的意義。目前臨床上西醫(yī)治療老年糖尿病腎病短期療效肯定，但長期治療效果不明確[14]。西紅康具備益氣養(yǎng)陰與補腎活血的作用，不僅可有效調(diào)節(jié)血糖與血壓，同時還可提高免疫力，對人體的血液循環(huán)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)等均具有良好的調(diào)理作用[15]。當DN患者的腎臟足細胞密度和總數(shù)因受損傷凋亡、脫落減少，殘留的足細胞足突會發(fā)生代償性的增寬、融合與肥大，這會導(dǎo)致腎小球通透性增加，進而發(fā)生彌漫性腎小球硬化與結(jié)節(jié)性腎小球硬化[16-18]。蛋白尿的發(fā)生和足突融合、足突間隙增寬密切相關(guān)，而蛋白尿又會導(dǎo)致足細胞損傷，形成惡性循環(huán)，腎足細胞發(fā)生損傷后會發(fā)生足突融合、消失，胞體縮小及濾過屏障電荷減少，甚至形成假囊，最終導(dǎo)致足細胞凋亡、脫落以及腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)和功能變化[19-20]。

綜上所述，西紅康可降低2型糖尿病腎病大鼠的FBG、AOPPs與mALB水平，還可有效改善其腎足細胞超微結(jié)構(gòu)，達到保護腎臟的作用。