楊 雪，韓 剛，余明瓊，彭 婧，張 晶

(1.唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.開灤總醫(yī)院泌尿外科，河北 唐山 063000)

輸尿管是人體泌尿系統(tǒng)很重要的結(jié)構(gòu)，當(dāng)輸尿管出現(xiàn)梗阻時會造成尿液引流受阻，從而出現(xiàn)腎積水以及輸尿管擴張等情況[1-2]。輸尿管梗阻往往會造成腎功能的損害，因此要進(jìn)行積極的治療[3-4]。生地黃是清熱涼血藥，具有養(yǎng)陰生津的作用,對多種腎臟疾病具有調(diào)控作用[5-6]。例如其可通過調(diào)控核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)或者AMPK通路對糖尿病腎病大鼠腎臟損傷發(fā)揮干預(yù)作用[7-8]，但是其是否在輸尿管梗阻引發(fā)的腎臟纖維化中發(fā)揮作用尚不清晰。Wnt蛋白(Wnt)/非典型性受體酪氨酸激酶(Atypical receptor tyrosine kinase，ROR2)信號通路是決定細(xì)胞命運的經(jīng)典通路，在多種腫瘤和肝臟疾病中有較深入研究[9-10]，但是其在腎臟疾病尤其是輸尿管梗阻引發(fā)的腎纖維化中的作用尚不清晰，明確生地黃水提液是否能夠通過調(diào)控Wnt-5a/ROR2信號通路發(fā)揮腎保護(hù)作用對臨床機制研究具有重要意義。因此本研究將通過不同劑量生地黃水提液干預(yù)輸尿管梗阻模型大鼠，探究不生地黃水提液對大鼠腎臟的影響及其機制，為臨床輸尿管梗阻輔助治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：90只8周齡雄性SPF級SD大鼠(220±20)g，購于北京智飛綠竹生物制藥有限公司[SYXK(京)2021-0070]。大鼠飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃，相對濕度55%～75%，噪音85 dB以下，氨濃度20 PPm以下，通風(fēng)換氣12次/h。本實驗通過唐山市協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2 實驗藥品與試劑:生地黃(批號：170302011)，使用時稱取生地黃200 g，加水適量，煎煮3次，每次0.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至含原藥材0.32 g/ml，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫畸}酸咪達(dá)普利片(達(dá)爽)，(國藥準(zhǔn)字H19990153)；戊巴比妥鈉，(≥98%)購于天津市津華化工廠；蘇木精和伊紅購于美國sigma公司。

1.1.3 實驗儀器:SYD-K2080切片機購于沈陽譽德電子儀有限公司；包埋劑(Optimal cutting temperature compound，OCT)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；實驗動物手術(shù)器械購于玉研儀器公司；顯微鏡購于北京普瑞賽司儀器有限公司；Western blot電泳儀購于美國Bio-Rad公司；Bright-發(fā)光成像儀購于美國賽默飛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 輸尿管梗阻模型的建立：腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，當(dāng)大鼠麻醉好后平放并固定于手術(shù)臺上，大鼠左側(cè)肋腰點區(qū)域為術(shù)區(qū)，去除大鼠肋腰點區(qū)域約1 cm為半徑大小的腹毛，充分暴露術(shù)區(qū)，備皮后在左腹部術(shù)區(qū)開1.5 cm大小手術(shù)切口，逐層打開皮層、肌層，確定腎臟位置，翻開腸襻，暴露腎臟下極并用玻璃分針游離輸尿管，在輸尿管上端接近腎臟下極處與中下1/3處兩個地方分別用4-0醫(yī)用縫合線結(jié)扎，結(jié)扎后從兩個結(jié)扎點之間剪斷,復(fù)原臟器位置并用青霉素局部給藥，然后逐層縫合腹壁，并用碘伏棉球消毒縫合后術(shù)區(qū)。對照組手術(shù)除不結(jié)扎輸尿管，也不離斷輸尿管，其他操作一致。

1.2.2 大鼠分組及給藥方式：造模后將造模大鼠隨機分為模型組、鹽酸咪噠普利組和生地黃水提液低劑量組、生地黃水提液中劑量組、生地黃水提液高劑量組，每組15只，根據(jù)《實驗動物管理與實用技術(shù)手冊》及《中藥藥理研究方法學(xué)》將實驗動物與人之間的給藥劑量進(jìn)行“等效”換算,鹽酸咪噠普利組和生地黃水提液低劑量組、生地黃水提液中劑量組、生地黃水提液高劑量組分別給予鹽酸咪噠普利0.9 g/(kg·d)和生地黃水提液0.8、1.6、3.2 g/(kg·d)，模型組和對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)2周，2周后進(jìn)行各組實驗。

1.2.3 HE染色檢測腎臟病理變化：取各組大鼠腎臟組織的石蠟包埋組織，用石蠟切片機切4 μm厚度切片，60 ℃烘箱5 min；二甲苯Ⅰ脫蠟20 min，二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，二甲苯、梯度乙醇各1 min，自來水沖洗15 s；蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min， 1%鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗1 min；1%稀氨水10 s，自來水洗1 min；伊紅染色1 min，自來水洗30 s；依次運用不同濃度乙醇脫水1 min，再用95%乙醇漂色1 min，無水乙醇脫水5 min，最后放入二甲苯Ⅰ3 min，二甲苯Ⅱ3 min；中性樹膠封片后顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 Masson染色檢測腎臟纖維化水平：將經(jīng)過包埋及制片等前期處理的腎臟切片依次進(jìn)行Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，后流水沖洗，置于1%鹽酸乙醇分化液15 s，后流水沖洗，Masson麗春紅染色10 min后，乙酸溶液浸泡洗滌1 min，再磷鉬酸溶，液分化2 min，乙酸溶液浸泡洗滌1 min，甲苯胺藍(lán)染色液染色3～5 min；95%乙醇溶液脫水5 min，無水乙醇脫水2次，每次2 min；二甲苯透明2次，每次5 min，中性樹膠固封切片，將Masson染色后切片置于顯微鏡下放大200倍視野下拍照。

1.2.5 Western blot 檢測大鼠腎臟組織纖維化marker及WNT通路分子蛋白表達(dá)：收集各組大鼠腎臟組織在冰上勻漿器內(nèi)勻漿，用1 ml RIPA蛋白裂解液在冰上提取總蛋白，采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行測定。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后分裝于EP管，儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為：濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓110 V 1.5 h，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉。加入特異性一抗CollagenⅠ(1∶10000，ab138492，abcam，英國)、α-SMA(1∶10000，ab108424，abcam，英國)、Vimentin(1∶5000，ab92547，abcam，英國)，WNT5a(1∶1000，ab179824，abcam，英國)，ROR2(1 μg/ml，ab190145，abcam，英國)和β-actin(1∶5000，ab6276，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況及腎重/體重比值比較 對照組大鼠在假手術(shù)后初期出現(xiàn)暫時性食欲降低，術(shù)后精神狀態(tài)恢復(fù)良好，反應(yīng)靈敏，食欲良好，皮毛光亮緊密，大便正常呈顆粒狀，體重增長正常。模型組大鼠在模型制備中后期大鼠出現(xiàn)食欲不佳，體重增長低于對照組，精神狀態(tài)較差，反應(yīng)遲鈍，皮毛干枯稀疏，萎靡少動。各給藥組大鼠在精神狀態(tài)、飲食、活動情況等方面未見明顯差異，表現(xiàn)均介于假手術(shù)組及模型組之間。同時如表1所示，通過比較各組大鼠腎重/體重比值，與對照組相比，模型組大鼠腎重/體重比值顯著升高，與模型組相比，生地黃水給藥組大鼠腎重/體重比值均降低，并具有一定的劑量依賴效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠腎重/體重比值比較

2.2 不同劑量生地黃水提液干預(yù)對大鼠腎臟組織的影響 通過HE染色確定各組大鼠腎臟病理變化水平，如圖1所示。與對照組比較，模型組腎臟組織的皮質(zhì)和髓質(zhì)均變薄、腎小管擴張、上皮細(xì)胞脫落并伴有空泡變性、腎小球萎縮，具有炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，生地黃各劑量組大鼠腎臟組織的腎小球相對充盈，局部出現(xiàn)球囊粘連、腎小管擴張程度及小管上皮細(xì)胞空泡變性均有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少，且具有一定劑量依賴性。

圖1 各組大鼠腎臟病理表現(xiàn)(HE染色，×200)

2.3 不同劑量生地黃水提液干預(yù)對大鼠腎臟纖維化的影響 通過Masson染色結(jié)果確定各組大鼠腎臟纖維化水平，如圖2所示。與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織間質(zhì)藍(lán)染程度較高，表明纖維化嚴(yán)重。與模型組比較，生地黃各劑量組大鼠腎臟組織藍(lán)染減少，表明纖維化程度減輕，并呈一定劑量依賴性。

圖2 各組腎臟纖維化病理表現(xiàn)(Masson 染色，×200)

2.4 不同劑量生地黃水提液對腎臟組織纖維化標(biāo)志物CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)的影響 見表2。通過Western blot實驗探究不同濃度生地黃水提液對腎臟組織CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明與對照組相比，模型組CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)升高，與模型組相比生地黃水提液各劑量給藥組大鼠CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平降低，并且具有一定的劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠腎臟CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平比較

2.5 不同劑量生地黃水提液對腎臟組織Wnt信號通路蛋白表達(dá)的影響 見表3。通過Western blot實驗探究不同濃度生地黃水提液對腎臟組織Wnt5a和ROR2表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明與對照組相比，模型組Wnt5a和ROR2表達(dá)升高，與模型組相比，生地黃水提液各劑量給藥組大鼠Wnt5a和ROR2水平降低，并且具有一定的劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠腎臟Wnt5a和ROR2表達(dá)水平比較

3 討 論

輸尿管梗阻通常是指輸尿管管腔直徑變小，從而導(dǎo)致輸尿管出現(xiàn)堵塞，排尿出現(xiàn)異常的情況，引起輸尿管梗阻的原因有很多，可能是局部出現(xiàn)了感染，也有可能是有息肉等原因[11-12]。輸尿管梗阻若不及時治療，會引發(fā)嚴(yán)重的腎臟損傷和腎纖維化，對患者腎功能造成惡性影響[13-14]。生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用，可以很好地祛除體內(nèi)的內(nèi)熱，改善腸道燥熱所引起的便秘，對咽喉疼痛和口干舌燥也有很好的緩解作用。臨床上也常使用生地黃來治療糖尿病、高血壓、蕁麻疹、過敏性紫癜、風(fēng)濕熱、心律失常等病癥[15-16]。研究表明生地黃可以通過干預(yù)超氧化物歧化酶和丙二醛的表達(dá)，參與氧化應(yīng)激通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[17]，也有研究表明生地黃可通過NF-κB/NLRP3信號通路改善高脂飼料并鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟發(fā)揮積極的干預(yù)作用[18],但是生地黃是否對輸尿管梗阻引發(fā)的腎纖維化發(fā)揮保護(hù)作用尚不清晰。本研究通過不同劑量生地黃水提液干預(yù)大鼠輸尿管梗阻模型探究生地黃水提液對輸尿管梗阻后大鼠腎臟纖維化的影響，HE染色和Masson染色結(jié)果表明生地黃水提液對腎臟損傷有積極作用，可以降低炎癥因子的浸潤，并且顯著降低了腎臟組織的纖維化水平；同時本研究通過Western blot分析了纖維化關(guān)鍵生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，結(jié)果證實輸尿管梗阻后大鼠腎臟組織CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平顯著升高，這與組織病理學(xué)結(jié)果相一致，同時，當(dāng)大鼠使用生地黃治療后，CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平顯著降低，這與Masson染色結(jié)果相一致，由此提示出生地黃水提液有助于輸尿管梗阻后腎臟功能的恢復(fù)，對腎臟纖維化的抑制具有積極干預(yù)作用，其機制與抑制CollagenⅠ、α-SMA、Vimentin表達(dá)水平相關(guān)。

Wnt蛋白在發(fā)育、組織動態(tài)平衡、多種疾病的發(fā)生中起到了關(guān)鍵的作用[19]。研究表明ROR2在多種腫瘤實體中的過度表達(dá)，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在癌癥研究中受到越來越多的關(guān)注，活躍的Wnt/ROR信號與推動腫瘤發(fā)展和進(jìn)展的過程有關(guān)，如細(xì)胞增殖、存活、侵襲或治療抵抗[20]，但是Wnt/ROR信號通路與腎臟疾病的研究較少，因此本研究集中探究了Wnt/ROR信號通路在輸尿管梗阻引發(fā)的腎纖維化中的表達(dá)變化。通過Western blot證明模型組Wnt5a和ROR2表達(dá)升高，生地黃水提液各劑量給藥組大鼠Wnt-5a和ROR2水平降低，并且具有一定的劑量依賴性，這與腫瘤學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的疾病過程中Wnt/ROR2 高表達(dá)相一致，提示W(wǎng)nt/ROR2信號通路的異常激活在腎臟疾病中也發(fā)揮著重要作用，生地黃的干預(yù)抑制Wnt/ROR2信號通路，可能抑制了腎臟細(xì)胞的異常病變，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上，本研究表明生地黃水提液對大鼠輸尿管梗阻引發(fā)的腎纖維化具有積極意義，其機制可能與抑制異常激活的Wnt-5a信號通路有關(guān)。本研究可以進(jìn)一步通過體外細(xì)胞學(xué)實驗探究生地黃水提液對腎臟細(xì)胞的作用，為臨床治療提供分子依據(jù)。