俞 燕，鄭艷輝，田海軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的慢性微血管并發(fā)癥之一，是一種慢性進(jìn)行性腎臟疾病，最終將導(dǎo)致終末期腎損傷的發(fā)生[1]。在全球范圍內(nèi)，DM的患病率約為9.3%，我國(guó)DM患者約1.16億，其中可能發(fā)展為DN的概率約為40%[2]。有研究[3]表明，我國(guó)DN的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已成為慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)的最主要病因?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)方面，DN的治療措施主要有控制血壓及血糖、調(diào)節(jié)血脂、減少尿蛋白等[4]，但臨床療效有限，且有一定的使用限制及不良反應(yīng)，而中醫(yī)藥在腎臟疾病的治療方面有更加廣泛的應(yīng)用范圍，極有可能成為更有效的治療手段，也是中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢(shì)。中草藥六月雪[Serissa serissoides (DC.) Druce，SSD]在臨床上可應(yīng)用于多種腎臟病，包括慢性腎功能衰竭、慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎病綜合征等。本研究以Sprague-Dawley(SD)大鼠建立DN模型，探討六月雪對(duì)糖尿病腎病的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠30只，SPF級(jí)，4～6周齡，購(gòu)自南通大學(xué)[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2019-0001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：中藥六月雪，購(gòu)自南京市中醫(yī)院中草藥房，制成0.27 g/ml的藥液后濃縮10倍。鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：鹽酸、過(guò)碘酸、二甲苯、醋酸鈉、無(wú)水乙醇、中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。蘇木素染液、0.5%伊紅液、Schiff氏液、哈瑞蘇木精(南京恩晶生物科技有限公司)。尿蛋白定量測(cè)試盒、肌酐(Scr)測(cè)試盒、尿素氮(BUN)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。HEA-230血糖儀、血糖試紙(日本OMRON公司)。5415R型離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)。日立 OLYMPUS生化分析儀(南京三和公司)。Multiskan Mk酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(Leica ASP6025，上海三威醫(yī)療設(shè)備有限公司)。病理取材臺(tái)(博科QCT-1500) 、烤片機(jī)(博科BH-1)(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司)。組織包埋機(jī)(LEICA Arcadia)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM22235)、多功能染色機(jī)(Autostainer XL Leica)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)。顯微鏡(ZEISS AX110，廣州市高明生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組與模型制備：將30只4～6周齡、雄性、健康SD大鼠隨機(jī)分成三組，分別為正常組、模型組和六月雪組，每組10只。按55 mg/kg的劑量在大鼠左側(cè)腹腔一次性注射1%STZ溶液，正常組大鼠則用等劑量的0.9%氯化鈉溶液以同種方法進(jìn)行腹腔注射。大鼠進(jìn)行STZ注射后，連續(xù)測(cè)3 d隨機(jī)血糖，血糖>16.7 mmol/L為 DM 模型制備成功。造模成功后的DM模型大鼠喂養(yǎng)1周，測(cè)隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，尿量為正常組的1.5倍及以上，24 h尿蛋白定量(24 h-UP)為正常組的1.5倍及以上，則為DN模型制備成功。

1.2.2 給藥方法：以灌胃的方式進(jìn)行給藥，給藥體積為0.1 ml/10 g，每天給藥1次，連續(xù)給藥6周。給藥期間，給予各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，定期更換墊料及消毒籠具。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)：藥物干預(yù)6周后，檢測(cè)各組大鼠的空腹血糖(FBG)，收集24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白(24 h-UP)含量。大鼠脫頸椎處死，腹主動(dòng)脈取血，離心后收集血清，使用生化分析儀測(cè)定血清中BUN及Scr的水平。

1.2.4 腎臟病理組織觀察：大鼠處死后，取兩側(cè)腎臟，去除被膜，0.9%氯化鈉溶液灌洗腎臟血管，清除殘留血液，濾紙干燥。取一半腎組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片等步驟制作組織切片，進(jìn)行HE染色和PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理，并進(jìn)行病理評(píng)分[5]，將分?jǐn)?shù)累加，計(jì)算每組每只動(dòng)物的均分。

1.2.5 大鼠腎臟組織TGF-β1、IL-6表達(dá)水平測(cè)定：取另一半腎組織，-20 ℃低溫保存，采用ELISA法檢測(cè)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)及炎性細(xì)胞因子白介素-6 (Interleukin-6，IL-6)的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的，采用方差分析，不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 六月雪對(duì)各組大鼠FBG及腎功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠FBG、Scr、BUN及24 h-UP升高 (P<0.01)；與模型組比較，六月雪組大鼠FBG、Scr、BUN及24 h-UP有所降低 (P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 六月雪對(duì)各組大鼠FBG、腎功能及尿蛋白的影響

2.2 六月雪對(duì)各組大鼠腎臟病理組織形態(tài)的影響

2.2.1 HE染色結(jié)果:①正常組：腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)無(wú)增多，毛細(xì)血管無(wú)淤血，系膜基質(zhì)無(wú)增生，球囊腔明顯可見(jiàn)，腎小管上皮細(xì)胞無(wú)明顯變性、壞死、管型，間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)結(jié)締組織增生。②模型組：腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，毛細(xì)血管擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增生，球囊腔擴(kuò)大，腎小管上皮細(xì)胞重度變性壞死，腔增大，腔內(nèi)見(jiàn)大量透明管型，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生。③六月雪組：腎臟組織形態(tài)學(xué)改變基本同模型組，間質(zhì)有少量單個(gè)核炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變程度輕于模型組。各組病理評(píng)分的比較：與正常組比較，模型組的病理評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，六月雪組的病理評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖1(表2)。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×400；PAS染色,×400)

表2 六月雪對(duì)各組大鼠腎臟組織病理評(píng)分的影響(分)

2.2.2 PAS染色結(jié)果:①正常組：腎小球毛細(xì)血管基底膜，系膜基質(zhì)和腎小管基底膜著玫瑰紅色，基底膜未見(jiàn)增厚，系膜基質(zhì)未見(jiàn)增多。②模型組：腎小球毛細(xì)血管基底膜，系膜基質(zhì)和腎小管基底膜著玫瑰紅色，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多。③六月雪組：腎小球毛細(xì)血管基底膜，系膜基質(zhì)和腎小管基底膜著玫瑰紅色，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多。見(jiàn)圖1。

綜上，結(jié)合各組病理組織形態(tài)的差異和病理評(píng)分的變化，認(rèn)為六月雪對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷具有一定保護(hù)和修復(fù)作用。

2.3 六月雪對(duì)糖尿病腎病大鼠TGF-β1及IL-6含量的影響 見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組TGF-β1及IL-6水平均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，六月雪組TGF-β1及IL-6水平均有所降低(P<0.05)。

表3 六月雪對(duì)糖尿病腎病大鼠TGF-β1及IL-6表達(dá)水平的影響

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，臨床上常見(jiàn)且發(fā)病率逐年增高，與糖尿病相關(guān)的腎小球損傷和蛋白尿?qū)е铝四I小管間質(zhì)病變，常見(jiàn)持續(xù)性蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能損害等癥狀，最終可發(fā)展為終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)[6]，預(yù)后較差。早期DN的主要病理表現(xiàn)是以腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚以及系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性積聚為特征，后期則表現(xiàn)為腎小球及腎小管間質(zhì)纖維化[7]。

DN的致病機(jī)制是復(fù)雜且多樣的，涉及多種途徑和介質(zhì)，氧化應(yīng)激是DN重要的發(fā)病機(jī)制之一。高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和氧化自由基的產(chǎn)生增加，而ROS 的增加又會(huì)引發(fā)炎癥、血管內(nèi)皮異常、TGF-β1表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生[8]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，參與了DN的發(fā)病與發(fā)展[9]。TGF-β的表達(dá)上調(diào)可能是發(fā)生腎小球硬化及腎纖維化的重要因素[10-11]，它主要是通過(guò)磷酸化和激活Smad2和Smad3，介導(dǎo)了腎小球和小管間質(zhì)纖維化[12]。另外，TGF-β促進(jìn)了腎細(xì)胞及成纖維細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分子的合成，細(xì)胞外基質(zhì)池不斷積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化[11]。江丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，減少TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)，可改善DM大鼠的早期腎臟病理改變，減輕腎臟損害，保護(hù)腎功能。段穎等[14]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出，腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的下調(diào)能夠改善db/db小鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化，從而達(dá)到保護(hù)腎臟的目的。

炎癥反應(yīng)在DN的疾病演變中起著至關(guān)重要的作用，炎癥可改變組織穩(wěn)態(tài)，刺激多種細(xì)胞炎癥因子的釋放，這些細(xì)胞因子更促進(jìn)了炎癥免疫反應(yīng)的進(jìn)展[15-16]。IL-6是機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，與腎臟損傷關(guān)系密切。相關(guān)研究[17]表明，腎小球基底膜增厚、腎小球系膜細(xì)胞增殖、腎小球上皮細(xì)胞通透性異常增高及間質(zhì)纖維化均與IL-6有關(guān)。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎組織中有IL-6相關(guān)mRNA的表達(dá)，在系膜增生區(qū)和腎小管萎縮區(qū)最為明顯，這證實(shí)了IL-6與DN的系膜增生和間質(zhì)損傷程度有關(guān)[18]。高大紅[19]對(duì)服用血府逐瘀膠囊的糖尿病腎病患者進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)治療組IL-6、TGF-β1等炎癥因子水平明顯降低，患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有改善，臨床癥狀也得到緩解。

根據(jù)DN的疾病特點(diǎn)，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)的 “腎消” “消渴腎病”“水腫”“癃閉”“關(guān)格”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DN由消渴病發(fā)展而來(lái)，病性為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，大多以消渴之陰虛燥熱為基礎(chǔ)，隨疾病進(jìn)展，累及到脾腎，致使脾失健運(yùn)，腎失氣化，氣血不足，濕濁內(nèi)生，進(jìn)而產(chǎn)生血瘀、濁毒、濕熱等病理產(chǎn)物，并使病情進(jìn)一步加重[20]。

六月雪是茜草科植物六月雪的干燥全草[21]，有白馬骨、滿天星等別稱，《本草拾遺》中記載：味苦、微甘，性涼，具有健脾除濕、清熱解毒、消腫止痛、涼血活血等功效[22]。針對(duì)DN的病因病機(jī)，六月雪既可活血通絡(luò)消癥，又可引導(dǎo)濕濁之邪從小便而解，清利濕熱、化濁解毒。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，六月雪有抗氧化、抗菌解熱、抗肝炎、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜等作用[23]。孫響波等[24]通過(guò)總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，六月雪有降低Scr、BUN、減少蛋白尿的作用。齊墩果酸是六月雪的有效成分，是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物。有研究表明齊墩果酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad途徑抑制了腎臟纖維化，達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。另一種有效成分熊果酸，也被證明有保護(hù)腎功能、降低尿蛋白、減輕腎損害等作用[26]。但是六月雪對(duì)DN的作用及可能機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本研究以STZ誘導(dǎo)DN大鼠模型的建立，觀察六月雪對(duì)DN大鼠的多項(xiàng)指標(biāo)及腎臟組織的影響。采用STZ腹腔注射SD大鼠后，大鼠出現(xiàn)血糖升高、蛋白尿及腎功能異常，這些表現(xiàn)是DN的典型臨床癥狀，光鏡下觀察腎臟病理切片示腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚等病理變化，依據(jù)Mogensen標(biāo)準(zhǔn)，該病理表現(xiàn)符合DN早期診斷，表明造模成功，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。藥物干預(yù)結(jié)束后，與模型組比較，六月雪組大鼠的FBG、Scr、BUN及24 h-UP均得到改善，腎組織病變程度也有所減輕，病理評(píng)分下降，腎臟組織中TGF-β1及IL-6的水平降低。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了六月雪對(duì)DN的腎臟損傷有保護(hù)作用，并推測(cè)，六月雪可能通過(guò)抑制TGF-β1及IL-6的表達(dá)，減輕腎臟炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，抑制腎臟的基底膜增厚、系膜增生及纖維化等病理改變，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用，改善腎功能，減少蛋白尿，并在一定程度上可修復(fù)腎組織，延緩DN的持續(xù)發(fā)展。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為六月雪應(yīng)用于腎臟病的臨床治療提供了一定依據(jù)，但也存在一些不足，一是在臨床使用上，六月雪常與多種藥物配伍成方，而本實(shí)驗(yàn)以六月雪單味藥進(jìn)行研究，較為局限。二是本次實(shí)驗(yàn)選用的指標(biāo)有限，未對(duì)六月雪藥理作用的信號(hào)通路進(jìn)行更深入的研究。這些不足需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以彌補(bǔ)。

綜上所述，六月雪對(duì)DN模型大鼠的腎臟有保護(hù)作用，能夠改善腎功能、減少蛋白尿，減輕腎臟的病理改變，其作用機(jī)制可能與腎組織中TGF-β1、IL-6表達(dá)的降低相關(guān)，從而抑制了腎臟炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，達(dá)到了保護(hù)腎臟的作用，延緩DN進(jìn)展至ESRD。