王德宇，楊東亮，常 劉

(大連市第四人民醫(yī)院燒傷創(chuàng)面科，遼寧 大連 116000)

腸上皮由單層腸上皮細(xì)胞組成，可選擇性吸收水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是抵御毒素和腸外病原體的第一道屏障[1]。當(dāng)腸上皮細(xì)胞通透性增加時(shí)，腸腔中的抗原和內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道及全身性疾病的發(fā)生，如炎癥性腸病、膿毒癥[2-3]等。氧化應(yīng)激使體內(nèi)氧化-抗氧化失衡，產(chǎn)生過(guò)量活性氧(Reactive oxygen spiecies,ROS)，增加腸道通透性和腸道上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腸上皮屏障功能障礙。抑制氧化應(yīng)激有助于恢復(fù)腸上皮細(xì)胞功能，阻礙腸道相關(guān)疾病的發(fā)展[4]。

黃芪屬多年生草本植物，是常用中藥材之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗菌、抗氧化劑等藥理活性[5]。據(jù)研究報(bào)道，黃芪可改善糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷[6]，其對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征患者腸屏障功能具有保護(hù)作用[7]。異鼠李素(Isorhamnetin,ISO)屬黃酮類化合物，是黃芪的有效成分之一，可有效防治氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的進(jìn)展[8-9]。目前，ISO對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞的影響及分子機(jī)制尚不十分明確?；诖?，本研究旨在評(píng)價(jià)ISO對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6氧化損傷的影響，探討ISO保護(hù)腸上皮細(xì)胞的可能機(jī)制，以期為腸屏障功能障礙相關(guān)疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：大鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基(武漢賽維爾生物科技有限公司)；ISO(阿拉丁科技有限公司)；N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)(阿拉丁科技有限公司)；甲基噻唑藍(lán)(MTT)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、全蛋白提取試劑盒、核蛋白和漿蛋白提取試劑盒、兔抗大鼠Nrf2一抗(WL02135)(1∶500)、兔抗大鼠HO-1一抗(WL02400)(1∶500)、兔抗大鼠p-Akt一抗(WLP001a)(1∶500)、兔抗大鼠Akt一抗(WL0003b)(1∶500)、羊抗兔IgG-HRP二抗(WLA023)(1∶5000)(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組：IEC-6細(xì)胞接種至含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，用不同濃度ISO(0、10、20、40、80、100、200 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，篩選3個(gè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制或毒性的藥物濃度。隨后將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞42 h；H2O2組：正常培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，500 μmol/L H2O2處理細(xì)胞18 h；NAC組：10 μmol/L NAC預(yù)處理細(xì)胞1 h后，500 μmol/L H2O2處理細(xì)胞18 h；異鼠李素低劑量組：20 μmol/L異鼠李素預(yù)處理細(xì)胞24 h后，500 μmol/L H2O2處理細(xì)胞18 h；異鼠李素中劑量組：40 μmol/L異鼠李素預(yù)處理細(xì)胞24 h后，500 μmol/L H2O2處理細(xì)胞18 h；異鼠李素高劑量組：100 μmol/L異鼠李素預(yù)處理細(xì)胞24 h后，500 μmol/L H2O2處理細(xì)胞18 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：將細(xì)胞以4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥處理。藥物達(dá)到相應(yīng)處理時(shí)間后，棄去各組細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT染色液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后吸去上清，加入150 μl Formanzan溶解液。待Formanzan全部溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在570 nm處的OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平：將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同藥物處理細(xì)胞。細(xì)胞處理相應(yīng)時(shí)間后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。收集各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，150 g離心5 min后，用500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后依次加入5 μl AnnexinV-FITC及10 μl PropidiumIodide混勻。室溫避光孵育15 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平：將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，用藥物處理相應(yīng)時(shí)間后，更換為含DCFE-DA探針的培養(yǎng)基，37 ℃孵育20 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，150 g離心5 min后，用PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.5 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD水平：各組IEC-6細(xì)胞進(jìn)行藥物預(yù)處理并用H2O2造模后，消化并收集細(xì)胞，提取細(xì)胞中蛋白，按照MDA、SOD試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量及SOD活力。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、HO-1、p-Akt/Akt水平：細(xì)胞達(dá)到處理時(shí)間點(diǎn)后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞3次，加入適當(dāng)體積的蛋白裂解液或核蛋白和漿蛋白提取試劑盒中的抽提試劑提取總蛋白和核蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度并定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)、p-Akt(1∶500)、Akt(1∶500)一抗，4 ℃條件下孵育過(guò)夜。孵育一抗后的PVDF膜用TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min。用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5000)37 ℃孵育45 min后，TBST緩沖液洗膜6次，每次5 min。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer)軟件分析目的條帶的灰度值。以Histone H3作為核蛋白Nrf2內(nèi)參，β-actin作為HO-1、p-Akt、Akt蛋白內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活性的影響 異鼠李素對(duì)IEC-6細(xì)胞毒性作用如圖1A所示，0～100 μmol/L的異鼠李素對(duì)IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，各組吸光度與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。200 μmol/L異鼠李素顯著降低了IEC-6細(xì)胞的吸光度值，產(chǎn)生細(xì)胞毒性(P<0.05)。異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活性的影響如圖1B所示，20～100 μmol/L 異鼠李素對(duì)細(xì)胞活性的影響呈劑量依賴性，其中NAC及100 μmol/L 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其吸光度與H2O2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：異鼠李素對(duì)正常IEC-6細(xì)胞的毒性作用；B：不同濃度異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活性影響。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖1 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響

2.2 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞凋亡的影響 異鼠李素對(duì)各組細(xì)胞凋亡水平的影響如圖2所示。與空白組相比，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與H2O2組相比，NAC及異鼠李素中、高劑量組細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖2 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

2.3 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞ROS水平的影響 以DCFH-DA為熒光探針，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IEC-6細(xì)胞中ROS的平均熒光強(qiáng)度。如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，H2O2使IEC-6細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS(P<0.05)。NAC組及異鼠李素低、中、高劑量組IEC-6細(xì)胞中ROS的生成顯著降低(P<0.05)。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖3 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS水平的影響

2.4 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞MDA、SOD水平的影響 進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量及SOD活力以評(píng)價(jià)異鼠李素對(duì)IEC-6細(xì)胞抗氧化能力的影響。如圖4A所示，H2O2組細(xì)胞中MDA含量較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，NAC組及異鼠李素高劑量組細(xì)胞中MDA含量顯著降低(P<0.05)。圖4B顯示，與正常組相比，H2O2組細(xì)胞中SOD活力明顯下降(P<0.05)，NAC組及異鼠李素高劑量組細(xì)胞中SOD的活力較模型組顯著增加(P<0.05)。

A：異鼠李素對(duì)細(xì)胞中MDA含量的影響；B：異鼠李素對(duì)細(xì)胞中SOD活性的影響。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖4 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞MDA、SOD水平的影響

2.5 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞抗氧化信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)異鼠李素對(duì)IEC-6細(xì)胞中抗氧化信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)的影響。由圖5可知，異鼠李素低、中、高劑量組細(xì)胞核中Nrf2及細(xì)胞中HO-1的表達(dá)逐漸增加，說(shuō)明異鼠李素的抗氧化能力不斷增強(qiáng)。其中，與H2O2組相比，異鼠李素中、高劑量組細(xì)胞核中Nrf2及細(xì)胞中HO-1的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。此外，與H2O2組相比，NAC組及異鼠李素中、高劑量組細(xì)胞中p-Akt/Akt的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

A：正常對(duì)照組；B：H2O2組；C：NAC組；D：異鼠李素低劑量組；E：異鼠李素中劑量組；F：異鼠李素高劑量組。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05圖5 異鼠李素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞抗氧化信號(hào)通路的影響

3 討 論

腸道上皮功能障礙在腸道及全身性疾病的發(fā)病進(jìn)程中起重要作用。氧化應(yīng)激是引起腸上皮細(xì)胞損傷及功能障礙的關(guān)鍵機(jī)制。H2O2作為ROS的主要成分之一，廣泛用于建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型[10]。NAC可增強(qiáng)抗氧化防御體系，是常用的抗氧化劑。因此，本研究使用H2O2處理IEC-6細(xì)胞，模擬氧化應(yīng)激條件下的腸上皮細(xì)胞損傷，并以NAC為陽(yáng)性對(duì)照，系統(tǒng)評(píng)價(jià)異鼠李素的抗氧化功效及作用機(jī)制。

腸上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷是緩解腸上皮功能障礙的關(guān)鍵因素。異鼠李素在氧化應(yīng)激參與的心血管疾病[11]、糖尿病[9]及缺血再灌注腦損傷等多種疾病中表現(xiàn)出抗氧化活性，具有較高的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，異鼠李素預(yù)處理可顯著增強(qiáng)視網(wǎng)膜細(xì)胞活力并抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平[12]。此外，異鼠李素預(yù)處理可保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免受H2O2損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，H2O2處理導(dǎo)致IEC-6細(xì)胞活力顯著降低。異鼠李素可顯著提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下IEC-6細(xì)胞活性，且作用呈劑量依賴性。同時(shí)，異鼠李素能夠降低H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的凋亡水平。由此可知，異鼠李素對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的IEC-6細(xì)胞具有保護(hù)作用。

ROS過(guò)量產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激并導(dǎo)致腸上皮屏障功能障礙[14]。丙二醛(MDA)由多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生，是過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，用于測(cè)定生物體中的氧化應(yīng)激水平[15]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化物酶，通過(guò)清除超氧陰離子使細(xì)胞免受ROS損傷[16]。據(jù)報(bào)道，異鼠李素預(yù)處理顯著降低暴露于H2O2的H9C2細(xì)胞中ROS的生成及MDA含量，同時(shí)增加SOD活性[17]。另?yè)?jù)報(bào)道，異鼠李素可降低H2O2誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞中MDA的含量并提高SOD活性[18]。本研究結(jié)果顯示，異鼠李素預(yù)處理顯著降低了IEC-6細(xì)胞中ROS及MDA的水平，增加了細(xì)胞中SOD活性。以上結(jié)果提示，異鼠李素可增強(qiáng)IEC-6細(xì)胞的抗氧化能力，緩解H2O2引起的IEC-6細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2/ARE是機(jī)體抗氧化的重要信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)下游抗氧化酶如HO-1等的表達(dá)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞中氧化還原平衡[19]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合以無(wú)活性復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離并移位至細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合以激活抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄[20]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt是Nrf2的上游信號(hào)分子，在抵抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞防御系統(tǒng)中起主導(dǎo)作用[21]。PI3K/Akt通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，異鼠李素通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路使視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[11]。此外，在H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，異鼠李素預(yù)處理可激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。Western blot結(jié)果顯示，異鼠李素處理顯著提高了Akt蛋白的磷酸化水平，增加了細(xì)胞核中Nrf2水平及下游抗氧化物酶HO-1的表達(dá)，提示PI3K/Akt信號(hào)通路與異鼠李素誘導(dǎo)的Nrf2/HO-1的激活有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，異鼠李素可保護(hù)IEC-6細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。此外，異鼠李素可能通過(guò)激活PI3K/Akt介導(dǎo)的Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路緩解H2O2誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞功能障礙。