嚴(yán) 鑫， 艾連中， 夏永軍， 宋 馨， 張 輝， 倪 斌， 楊昳津*

1. 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院， 上海 200093；2. 上海金楓酒業(yè)股份有限公司， 上海 201501

融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa,W.confusa)，為非孢子形成，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性球菌，因其在微觀和宏觀形態(tài)方面與乳酸菌的其它代表菌種相似，經(jīng)常被傳統(tǒng)和商業(yè)表型鑒定方法誤鑒定為乳酸菌和明串珠菌屬(Leuconostoc)[1-2]。1993年，魏斯氏菌屬(Weissella)由COLLINS等人根據(jù)16S rRNA序列分類命名[3]，目前已鑒定出的魏斯氏菌達(dá)22種[4]。融合魏斯氏菌是一種廣泛存在于發(fā)酵食品、肉類、牛奶、蔬菜和土壤的微生物[5]，因能增加對(duì)腸黏膜的粘附、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效[6]，被認(rèn)為是潛在的益生菌。此外，融合魏斯氏菌能正常存在于人類胃腸道(Gastrointestinal tract, GIT)中，并已有研究人員將其從健康人體的糞便中分離出來[7]，這也是其被認(rèn)為是潛在的益生菌的重要原因之一。

融合魏斯氏菌能專性異型發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生乳酸的兩種旋光異構(gòu)體。除乳酸外，融合魏斯氏菌發(fā)酵葡萄糖還產(chǎn)生二氧化碳、乙醇和乙酸[8]。融合魏斯氏菌高產(chǎn)胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)，其具有顯著的生物活性和理化特性[9]，可以提高食品的安全性，改善食品的感官特性，對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)有重要的影響，在食品工業(yè)中起著重要的作用。在酸奶、奶酪等乳制甜點(diǎn)中，可用于解決酸奶和奶酪的脫水的問題[10]。在發(fā)酵烘焙產(chǎn)品中，融合魏斯氏菌的胞外多糖可以改善發(fā)酵乳制品和谷物產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特性，以減少或替代某些添加成分，如牛奶蛋白、淀粉、果膠和其他親水膠體等[11]。在發(fā)酵食品中，融合魏斯氏菌還可以作為附屬發(fā)酵劑以提升發(fā)酵產(chǎn)品最終的感官品質(zhì)。在面團(tuán)發(fā)酵階段加入融合魏斯氏菌可顯著提高產(chǎn)品的質(zhì)量[12]，如提高產(chǎn)品黏度[13]、抗老化性能[14]，降低產(chǎn)品硬度[15]等，也能在發(fā)酵食品中產(chǎn)生更多的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)，如提高游離氨基酸的含量[16]，使酯類含量也更加豐富等[17]。

也有一些報(bào)道表明融合魏斯氏菌的存在會(huì)對(duì)相關(guān)食品產(chǎn)生一些負(fù)面效應(yīng)，如融合魏斯氏菌產(chǎn)生的葡聚糖可能導(dǎo)致全粒餅干厚度的增加[18]，醬油中氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)的生成與融合魏斯氏菌密切相關(guān)[19]。此外，融合魏斯氏菌的安全性也存在一定的爭(zhēng)議，有研究報(bào)道了在人類的臨床病例樣本中罕見的分離出了融合魏斯氏菌。這些都直接限制了融合魏斯氏菌在食品領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，未來對(duì)于融合魏斯氏菌的食品安全性方面還需要更加深入的研究。

近年來，由于融合魏斯氏菌良好的益生潛力與在發(fā)酵食品中獨(dú)特的功能特性，其在微生物學(xué)、發(fā)酵食品工業(yè)、食品加工等方面都表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力，也受到越來越多研究者的關(guān)注。基于此，本文將對(duì)融合魏斯氏菌的安全性、益生潛力、胞外多糖，及其在發(fā)酵食品中的功能特性、在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為融合魏斯氏菌在食品行業(yè)進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1 融合魏斯氏菌的安全性

盡管一些文獻(xiàn)報(bào)道了融合魏斯氏菌表現(xiàn)出了良好的益生潛力[20-21]，但美國(guó)食品藥品管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)和歐洲食品安全管理局(European Food Safety Authority, EFSA)暫未將其納入安全資格認(rèn)定(Qualified Presumption Of Safety, QPS)的列表中[22]。有研究認(rèn)為，在22種已知的魏斯氏菌中，融合魏斯氏菌是與人類感染有關(guān)的菌種，HURT W等人則認(rèn)為它是導(dǎo)致人類疾病的罕見病因[23]，表現(xiàn)出對(duì)萬古霉素天然的耐藥性，最低抑菌濃度高達(dá)256 μg/mL。與融合魏斯氏菌相關(guān)的病例主要包括：菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、假體關(guān)節(jié)感染等。融合魏斯氏菌廣泛存在環(huán)境中，并且可定殖在人類腸道中，有研究人員認(rèn)為手術(shù)或化療引起的腸道菌群改變，以及黏膜屏障的破壞可能導(dǎo)致融合魏斯氏菌的移位，使宿主容易感染這種微生物[2]。總的來說，融合魏斯氏菌致病機(jī)理目前還不清楚，未來還需要更加深入的探討與研究。

1.1 融合魏斯氏菌感染病例

目前有19篇文獻(xiàn)報(bào)告了共50例由融合魏斯氏菌感染引起的病例，其中免疫缺陷有24例(50%)，萬古霉素作為主要的治療抗生素也有27例(54%)[24]。菌血癥是融合魏斯氏菌感染的典型臨床表現(xiàn)。1997年至2007年，臺(tái)灣報(bào)告了10 例由融合魏斯氏菌感染引起的菌血癥病例，這些病例有免疫抑制、多微生物感染和中心導(dǎo)管放置等共同特征[25,26]。2017年，ABERKANE等人報(bào)道的融合魏斯氏菌與陰溝腸桿菌聯(lián)合感染引起的菌血癥，也具有上述特征[25]。該患者有髓母細(xì)胞瘤病史。之后患骨肉瘤，在化療過程中出現(xiàn)發(fā)熱，最開始使用哌拉西林、他唑巴坦、萬古霉素聯(lián)合治療，效果不佳。最終在四次血培養(yǎng)中(三次在植入式腔室中，一次在導(dǎo)管清洗)檢測(cè)出融合魏斯氏菌與陰溝腸桿菌。耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌表達(dá)低水平的天然頭孢菌酶，無相關(guān)耐藥性，而融合魏斯氏菌對(duì)萬古霉素、替可普蘭、頭孢他啶、頭孢噻肟、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶有耐藥性。

2020年，CHEAITO等人報(bào)道了第一例由融合魏斯氏菌感染引起的腦膜炎病例[5]。該患者78歲，因中風(fēng)長(zhǎng)期臥床，患有阿爾茨海默癥、2型糖尿病、冠狀動(dòng)脈疾病，有肺炎鏈球菌腦膜炎病史、膽管炎病史?；颊咦畛醯呐R床表現(xiàn)加上實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)了細(xì)菌性腦膜炎的診斷，萬古霉素和頭孢菌素被經(jīng)驗(yàn)性的用于細(xì)菌性腦膜炎治療，而融合魏斯氏菌對(duì)這兩種抗生素都有耐藥性。確診為融合魏斯氏菌腦膜炎感染后，停用萬古霉素并給予美羅培南、氨芐西林持續(xù)8 d，患者恢復(fù)到正常健康狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在該年齡段和特征相似的病例中分離出融合魏斯氏菌并不是細(xì)菌性腦膜炎的典型病因。患者的高齡、糖尿病狀態(tài)和其他合并癥狀可能造成免疫損害狀態(tài)。推測(cè)患者膽管炎病史以及對(duì)膽道的手術(shù)操作可能導(dǎo)致黏膜損傷造成微穿孔，從而導(dǎo)致繼發(fā)性腦膜炎。

目前一共報(bào)道過3例由融合魏斯氏菌感染引起的心內(nèi)膜炎病例。第一例是一名營(yíng)養(yǎng)不良的酒精性肝硬化患者，第二例是伴有主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全的免疫活性宿主，最近一例發(fā)生在2021年[23]，該患者46歲，有2型糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓和先天性二尖瓣主動(dòng)脈瓣病史。與上面的第二例患者有許多相似之處，該患者無癥狀，無發(fā)熱報(bào)告，在常規(guī)超聲心電圖監(jiān)測(cè)中偶然發(fā)現(xiàn)融合魏斯氏菌感染?？股匾志鷮?shí)驗(yàn)確定最低抑制濃度(mg/L)∶萬古霉素>256、替考拉寧≥256、青霉素= 0.38、慶大霉素= 0.75、利奈唑胺= 2、頭孢曲松= 3、頭孢噻肟= 0.5、阿莫西林= 0.125、紅霉素= 0.5、米諾環(huán)素= 1。最后使用阿莫西林與慶大霉素治愈。

目前報(bào)道的融合魏斯氏菌感染引起的病例，患者大都有嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病，加之免疫缺陷、器官移植、侵入性手術(shù)、聯(lián)合感染等因素[24]造成自身免疫力下降，以及萬古霉素等(產(chǎn)生天然耐藥性)的使用才是在人類臨床病例樣本中罕見分離出融合魏斯氏菌最可能的原因，融合魏斯氏菌并非是導(dǎo)致疾病直接發(fā)生的因素。在臨床病例中，融合魏斯氏菌很難用傳統(tǒng)的表型方法鑒別，患病初期易被診斷為一般的細(xì)菌性感染，導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)性的使用萬古霉素等抗生素進(jìn)行治療。根據(jù)臨床病例治愈經(jīng)驗(yàn)，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)，結(jié)合16S rRNA,可快速、準(zhǔn)確鑒定出融合魏斯氏菌。之后進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，確定抗生素最低抑菌濃度，最后使用抗生素進(jìn)行針對(duì)性治療[5,23,25]。

1.2 毒理實(shí)驗(yàn)及耐藥性

鯨魏斯氏菌(Weissellaceti)已被證明是引起魚類疾病的病原體，體內(nèi)編碼幾個(gè)與毒力有關(guān)的基因，但這些基因在融合魏斯氏菌中缺失，表明鯨魏斯氏菌和融合魏斯氏菌之間存在遠(yuǎn)距離進(jìn)化關(guān)系[27]。CUPI等人對(duì)Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行口服融合魏斯氏菌(灌胃)實(shí)驗(yàn)，90 d后大鼠體內(nèi)融合魏斯氏菌的劑量水平高達(dá)9.2×108CFU/kg bw/day，劑量體積為5 mL/kg，結(jié)果顯示大鼠耐受性良好，沒有引起任何需要治療的相關(guān)效應(yīng)。此外，融合魏斯氏菌在反向突變研究中未顯示任何誘變活性，在活體紅細(xì)胞微核研究中也未顯示任何遺傳毒性，未發(fā)現(xiàn)皮膚刺激，僅在實(shí)驗(yàn)中觀察到輕微的眼睛刺激[28]，結(jié)果表明融合魏斯氏菌是無毒、安全的物種。

除了對(duì)萬古霉素等少數(shù)抗生素具有天然的耐藥性，融合魏斯氏菌對(duì)用于人類和動(dòng)物傳染病的常用抗生素都很敏感。目前還沒有建立魏氏菌屬抗生素敏感性的標(biāo)準(zhǔn)方法和解釋標(biāo)準(zhǔn)，臨床上常使用肉湯稀釋法、瓊脂法以及電子檢測(cè)等方法來測(cè)定融合魏斯氏菌對(duì)抗生素的敏感性。迄今已發(fā)現(xiàn)的融合魏斯氏菌抗生素最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)與 EFSA 規(guī)定的明串珠菌種的 MIC 抗生素特異性斷點(diǎn)大致相似[27]。BOURDICHON在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，除卡那霉素和氯霉素外，所有實(shí)驗(yàn)菌株的MIC值均等于或低于專性乳酸桿菌異型乳酸發(fā)酵菌種的EFSA臨界值[24]。

1.3 臨床分離現(xiàn)狀

研究顯示，沒有具體特征能夠區(qū)分食物和臨床來源的融合魏斯氏菌之間的差異性，加之其能夠正常存在于健康人體的腸道中，表明融合魏斯氏菌是可作為潛在的益生菌的安全物種。BOURDICHON等人分離得到了 17株臨床和26株食物來源的融合魏斯氏菌，兩個(gè)來源的融合魏斯氏菌表現(xiàn)出非常高的泛基因組和較小的核心基因組，表明在不同菌株之間存在著遺傳多樣性。對(duì)其全基因組和3個(gè)額外的可用序列比較時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)任何聚類，也未發(fā)現(xiàn)按G +C比例插入的序列[24]。

2020年，有研究人員采用培養(yǎng)組學(xué)的方法從人糞便中分離純化得到31株乳酸菌株，先通過MALDI-TOF質(zhì)譜和16S rRNA基因測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定，并對(duì)獲得的菌株進(jìn)行溶血活性、抗生素敏感性、耐酸性和耐膽鹽性、抗菌活性、形態(tài)和生理特性測(cè)試。最終選擇了三株融合魏斯氏菌：YM5Y、YM5S1和YM5S2作為潛在的益生菌候選菌株。這三株融合魏斯氏菌均沒有溶血活性，不會(huì)引起綿羊血液中紅細(xì)胞的溶解，并且對(duì)所測(cè)試的大多數(shù)抗生素都很敏感[7]。

1.4 安全應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，許多文獻(xiàn)都認(rèn)為融合魏斯氏菌可安全的用于家禽、魚類等動(dòng)物的飼喂，并且有潛力成為魚類養(yǎng)殖的一種新型益生菌。2018年，STURINO基于相關(guān)文獻(xiàn)研究，表明融合魏斯氏菌是動(dòng)物正常胃腸道微生物群的成員，也能作為食物和飼料存在于飼養(yǎng)動(dòng)物的胃腸道[27]。在CUPI的灌胃實(shí)驗(yàn)的測(cè)試條件下，融合魏斯氏菌并未顯示出任何毒性作用[28]，也表明其是可以作為飼喂微生物的安全產(chǎn)品。2020年，KAHYANI等人為探究融合魏斯氏菌對(duì)虹鱒魚的益生作用，用不同濃度的融合魏斯氏菌(1.5 × 107CFU/g、3 × 107CFU/g和4.5 × 107CFU/g) 飼喂虹鱒魚。2個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)虹鱒魚體內(nèi)溶菌酶活性顯著增加、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素8(IL-8)顯著上升，同時(shí)體內(nèi)乳酸菌水平顯著增加，表明融合魏斯氏菌具有改善虹鱒魚的生長(zhǎng)性能、血清免疫參數(shù)、免疫相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)節(jié)腸道菌群的益生作用[29]。

融合魏斯氏菌已被列入2011年國(guó)際乳品業(yè)聯(lián)合會(huì)(International Dairy Federation, IDF)的清單中，德國(guó)生物制劑委員會(huì)也已確定融合魏斯氏菌屬于風(fēng)險(xiǎn)組1(Risk Group 1, RG1)微生物，這意味著它們不太可能引起人類疾病。美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(The American Type Culture Collection, ATCC)建議將融合魏斯氏菌ATCC 10881TM作為生物安全一級(jí)(Biosafety level-1, BSL-1)微生物移交使用，根據(jù)美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)指南，BSL1是“基本保護(hù)水平”，適用于已知不會(huì)導(dǎo)致正常健康人疾病的微生物[27]?？紤]到融合魏斯氏菌在各種食品基質(zhì)中的分離和安全使用已有較長(zhǎng)時(shí)間，并且已經(jīng)成功從健康人體中分離出來，目前也沒有任何有害相關(guān)代謝活性基因和毒力基因證據(jù)證明融合魏斯氏菌的有害性[24]。因此，融合魏斯氏菌應(yīng)當(dāng)被視為在食品鏈、發(fā)酵過程中的食品培養(yǎng)物和益生菌候選菌株中的安全物種。

2 融合魏斯氏菌的益生潛力

發(fā)酵食品是益生菌的豐富來源，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌很多具有益生特性。具備益生特性的乳酸菌一般需要符合以下條件：首先需要耐胃酸、耐膽鹽，能通過人體消化道環(huán)境存活；其次具有腸道粘膜上皮細(xì)胞的黏附能力，能夠進(jìn)入腸道后定植并生長(zhǎng)繁殖；再次必須通過對(duì)動(dòng)物進(jìn)行急性、亞急性毒性等試驗(yàn)，證明無致病性、不產(chǎn)生生物胺等有害物質(zhì)，對(duì)多數(shù)抗生素敏感，無溶血活性等[30]。近些年來，研究人員從發(fā)酵食品中分離出的融合魏斯氏菌都有較好的胃酸和膽汁耐受性，并對(duì)單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有較好的抗菌活性，表現(xiàn)出良好的益生潛力。

2.1 腸道生存能力

良好的腸道生存能力是益生菌能成功作用于人體的首要條件。人體在禁食期間胃部pH可低至1.5，餐后pH可升至3甚至更高[31]。人體膽汁的相關(guān)生理濃度在0.3% ～ 0.5%之間，膽鹽有洗滌活性，能溶解細(xì)胞表面蛋白，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞是有害的[32]。益生菌通常是口服的，必須具有通過胃和腸的能力，所以需要益生菌能夠在高酸性條件下存活，并通過保持足夠的數(shù)量對(duì)膽鹽表現(xiàn)出可接受的耐受性。在低的pH 下，乳酸菌能夠?qū)⑷樗岷唾|(zhì)子釋放出細(xì)胞以保護(hù)細(xì)胞膜[20,33]。乳酸菌分泌的膽鹽水解酶是一種重要的益生菌標(biāo)記物，它有助于微生物抵抗胃腸道中毒性的膽汁環(huán)境，也增加了乳酸菌菌株的腸道存活率。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的具有益生潛力的融合魏斯氏菌大都能夠在pH為2～3以及含有0.3%膽鹽的環(huán)境下正常存活[20-21,34-36](見表1)。LAKRA等人從印度傳統(tǒng)發(fā)酵食物中分離出的融合魏斯氏菌MD1，在 pH為2的條件下，培養(yǎng)3 h和24 h后存活率分別為6.81 log10CFU/mL和5.47 log10CFU/mL，同時(shí)能耐受0.3%的膽鹽混合物3 h，具有較好胃腸道耐受性[20]。NATH等人從印度酸大米中分離出的融合魏斯氏菌strain GCC_19R1，在pH為3時(shí)表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)，無顯著的活力損失，同時(shí)可抵抗1%的牛膽汁鹽3 h，顯示出對(duì)膽汁鹽的強(qiáng)耐受性[21]，具有作為潛在益生菌的應(yīng)用價(jià)值。

表1 具有良好腸道生存能力的融合魏斯氏菌

2.2 抗菌活性

目前文獻(xiàn)報(bào)道的具有益生潛力的融合魏斯氏菌大都具有良好的抗菌活性(見表2)，可用于食源性疾病的防治并改善腸道微生物環(huán)境。微生物的抑菌活性最主要的來源是抗菌化合物，如有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素或其他抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)[21]。此外，還可通過影響病原菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)，或酶與抗菌肽段殘基通過鹽橋、氫鍵和金屬相互作用而達(dá)到抑菌的效果[31]。融合魏斯氏菌具有的良好抗菌活性，主要是其產(chǎn)生抗菌化合物，如乳酸、抗菌物質(zhì)、細(xì)菌素等。

表2 具有良好抗菌能力的融合魏斯氏菌

2.2.1產(chǎn)乳酸抗菌

目前文獻(xiàn)報(bào)道融合魏斯氏菌具有的抗菌活性，大多是產(chǎn)生乳酸而具有抗菌活性。乳酸具有廣譜的抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有抑制作用[37-38]，乳酸能夠通過增加細(xì)菌外膜通透性、改變細(xì)菌胞內(nèi)滲透壓以及抑制胞內(nèi)大分子合成等方式來抑制有害微生物的生長(zhǎng)。研究中報(bào)道的融合魏斯氏菌 MD1[20]、融合魏斯氏菌OF126、融合魏斯氏菌WS90[34]、融合魏斯氏菌PL-6[35]都是因產(chǎn)生乳酸而抑制病原微生物的活性。

2.2.2產(chǎn)抗菌物質(zhì)抗菌

一些融合魏斯氏菌能夠產(chǎn)生某些抗菌化合物，如融合魏斯氏菌strain GCC_19R1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，對(duì)蠟樣芽孢桿菌SN_SA與銅綠假單胞菌GCC_19W1有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)一些革蘭氏陰性菌也有抑制作用[21]。杜宏等人從東北傳統(tǒng)酸菜中獲得的融合魏斯氏菌 Z01，在光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)其粗提物對(duì)單增李斯特菌生物膜形成的數(shù)量及生物膜形態(tài)也具有顯著的影響。當(dāng)粗提取物的抑菌濃度分別為8 mg/mL和16 mg/mL時(shí)，對(duì)單增李斯特菌生物膜的形成抑制率以及對(duì)生物膜黏附細(xì)菌的抑制率分別達(dá)到了59.33%、77.77%和14.49%、26.44%[38]。

2.2.3產(chǎn)細(xì)菌素抗菌

融合魏斯氏菌還可通過合成細(xì)菌素而具有抑菌活性。細(xì)菌素通過削弱目標(biāo)細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，達(dá)到殺菌效果。細(xì)菌素是乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生具有抗菌活性的低分子量多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)，在人體內(nèi)可被蛋白酶降解，對(duì)腸道微生物群也不會(huì)產(chǎn)生大的影響，也可被用作防腐劑添加到食品中[39]。TENEA GN 等證明了融合魏斯氏菌 Cys2‐2產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠抑制大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的活性[40]。目前有關(guān)融合魏斯氏菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究報(bào)道還非常少，相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制還不清楚，未來還需要更加深入的研究。

2.3 抗氧化活性

活性氧(過氧化氫、次氯酸等)和自由基(羥基自由基、超氧化物陰離子等)與人類疾病有著直接或間接的關(guān)聯(lián)，人體中過量的自由基會(huì)破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸等大分子[30]。氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，自由基在生物系統(tǒng)中具有破壞作用，它能與活細(xì)胞中的所有生物大分子發(fā)生反應(yīng)。因此，抗氧化活性測(cè)試化合物抑制自由基清除活性的能力是非常重要的。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，常被用于評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基的活性(融合魏斯氏菌清除DPPH自由基能力見表3)。LAKRA等人發(fā)現(xiàn)融合魏斯氏菌 MD1表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化活性，具有強(qiáng)烈的DPPH清除活性和抑制脂質(zhì)過氧化作用。MD1對(duì)完整細(xì)胞的DPPH清除活性和脂質(zhì)過氧化的抑制分別為69.15%和64.14%，而之前文獻(xiàn)中報(bào)道的融合魏斯氏菌KR780676和其它的幾種融合魏斯氏菌對(duì)DPPH的清除活性均小于40%。另外，融合魏斯氏菌 MD1的完整細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制為64.14%，高于融合魏斯氏菌 KR780676 和食竇魏斯氏菌 JW15[20]。

表3 具有良好抗氧化能力的融合魏斯氏菌

融合魏斯氏菌所表現(xiàn)出的抗氧化性，也可能來源于其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如葡聚糖。研究人員在尼日利亞發(fā)酵谷物中發(fā)現(xiàn)的融合魏斯氏菌 OF126，能產(chǎn)生以α-(1→6)和α-(1→3)連接，平均分子量為1.1 × 106Da的葡聚糖，該葡聚糖在4 mg/mL的劑量下，對(duì)羥自由基的清除活性可達(dá)86.5 %，甚至優(yōu)于抗壞血酸(83.1%)；對(duì)DPPH自由基清除活性雖弱于抗壞血酸，然而其清除率仍可達(dá)67.4%[42]。

2.4 疏水性與自聚性

益生菌與腸黏膜的粘附增加了其在腸道內(nèi)的持久性，從而為益生菌發(fā)揮作用提供了充足的時(shí)間。益生菌粘附在腸上皮細(xì)胞上不僅能有助于減少病原菌的定植，還能誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)[41]。細(xì)胞表面疏水性被認(rèn)為是腸上皮細(xì)胞和黏膜表面粘附的參數(shù)之一。分析細(xì)胞表面疏水性是微生物在宿主細(xì)胞上定植所需的重要理化變量。自聚性與疏水性有類似的作用，有助于益生菌在腸內(nèi)的定植，并與腸上皮細(xì)胞顯著粘附，從而防止病原菌粘附。乳酸菌的疏水性百分比常用正十六烷和二甲苯測(cè)定，疏水指數(shù)大于70%的被歸類為疏水，目前文獻(xiàn)所報(bào)道具有益生潛力的融合魏斯氏菌對(duì)正十六烷的疏水性大都在35%左右，對(duì)二甲苯的疏水性在30%左右(見表4)[20-21,34]。有人認(rèn)為目前報(bào)道的融合魏斯氏菌因疏水性不足，難以驗(yàn)證這些菌株的潛在益生菌用途。而DEBASISH等人從泡菜中分離出的融合魏斯氏菌 DD_A7對(duì)二甲苯的疏水性達(dá)到了82.11 %，具有非常強(qiáng)的供電子特性，有更大的疏水表面，表明其更容易定植在腸道[36]。

表4 具有良好疏水性的融合魏斯氏菌

除了疏水性與自聚性，有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在腸道的粘附能力也與細(xì)胞表面生物膜的特性密切相關(guān)。生物膜形成的初步階段是由于細(xì)胞表面存在疏水電位，因此推測(cè)生物膜的存在與腸道粘附能力有關(guān)，例如在融合魏斯氏菌 DD_A7細(xì)胞表面觀察到生物膜的形成，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)表面生物膜的形成使其在HCT-116細(xì)胞表面具有潛在的粘附特性[36]。由于胞外多糖等物質(zhì)的釋放，在融合魏斯氏菌 MD1 觀察到粗糙的表面和厚的生物膜的形成，這種特性具有降低某些致病菌生長(zhǎng)的特性[20]。目前，對(duì)于融合魏斯氏菌細(xì)胞表面性質(zhì)的研究較少，未來還需要有更多深入的研究以證明它在腸道環(huán)境中的粘附與定殖特性。

3 融合魏斯氏菌胞外多糖

胞外多糖是廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物和其他生物體中的細(xì)胞外聚合物，乳酸菌分泌的胞外多糖通常被認(rèn)為是安全的(Generally recognized as safe, GRAS)[42]，可以作為天然食品的成分或添加劑，也可用于營(yíng)養(yǎng)藥品和功能性食品的加工[43]。魏斯氏菌胞外多糖的平均產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他實(shí)驗(yàn)室物種，融合魏斯氏菌和食竇魏斯氏菌在魏斯氏菌中的胞外多糖產(chǎn)量最高(具體見表5)。融合魏斯氏菌高產(chǎn)葡聚糖(Dextran)，這可能與其體內(nèi)的蔗糖酶基因表達(dá)有關(guān)，這種酶作用于糖苷鍵將蔗糖水解為葡萄糖，并用于多糖和果糖的生物合成，然后將其釋放到細(xì)胞外環(huán)境[44-45]。SHUKLA等人從融合魏斯氏菌中合成了葡聚糖蔗糖酶WcCab3 DSR，并成功的將其用于葡聚糖和低聚葡萄糖的體外合成[46]。

表5 發(fā)酵食品中的融合魏斯氏菌產(chǎn)多糖概況

產(chǎn)右旋糖酐(一種葡聚糖)是魏斯氏菌的一個(gè)典型表型特征，高分子量右旋糖酐可改善發(fā)酵產(chǎn)物的流變性，具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒活性，是具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的生物制劑 ，相對(duì)較低分子量的右旋糖酐在制藥工業(yè)中被用作血漿替代品[47]。目前有關(guān)融合魏斯氏菌胞外多糖功能特性的研究大多集中在發(fā)酵食品中，在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究應(yīng)用還較少，未來還需進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

3.1 益生特性與免疫調(diào)節(jié)

融合魏斯氏菌產(chǎn)生的葡聚糖大多數(shù)都是線性的，由連續(xù)α-(1→6)連接的D-葡聚糖基單元組成，幾乎沒有α-(1→3)連接的分支[58]。ZHAO等人研究發(fā)現(xiàn)，融合魏斯氏菌胞外多糖能夠刺激益生菌的生長(zhǎng)，如乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)。融合魏斯氏菌XG-3產(chǎn)生的XG-3葡聚糖具有高益生元活性，可刺激益生菌的生長(zhǎng)，這意味著XG-3葡聚糖可能是一種潛在的益生元[42]。

與葡萄糖和果糖單位相比，含有半乳糖單位的線性鏈的益生元更容易發(fā)生腸道微生物發(fā)酵。此外，腸道菌群通過發(fā)酵半乳糖產(chǎn)生大量的SCFAs，可提供多種健康益處，如抗糖尿病、抗肥胖作用，以及通過腸-肝代謝組學(xué)途徑控制血膽固醇水平。DEVI等人從發(fā)酵食品中分離的融合魏斯氏菌KR780676，能夠產(chǎn)半乳聚糖，其含有α-(1→6)連接單位，具有100%線性，對(duì)人類消化液性具有較高的抗性，可抵抗人類消化酶的水解，并能到達(dá)腸道進(jìn)行結(jié)腸發(fā)酵。該聚半乳糖能促進(jìn)植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)，分別達(dá)到8.01 log10CFU/mL和7.65 log10CFU/mL，并對(duì)上述兩種益生菌的促進(jìn)作用表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)[50, 58]。

KAVITAKE 等人的綜述中報(bào)道了在小鼠模型中評(píng)估融合魏斯氏菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)潛力。胞外多糖處理組小鼠的IgA和IgG水平高于對(duì)照組。與來自突變體的胞外多糖相比，來自野生型融合魏斯氏菌的胞外多糖顯示出最高的免疫球蛋白產(chǎn)量[4]。

3.2 抗菌活性

目前有關(guān)乳酸菌胞外多糖具有抗菌活性的報(bào)道還較少，在魏斯氏菌中僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了胞外多糖的抗菌活性。LAKRA等人發(fā)現(xiàn)融合魏斯氏菌所產(chǎn)的甘露聚糖在不同濃度(0.25 mg/mL ～ 1.25 mg/mL)下均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，在濃度為1.25 mg/mL時(shí)抗菌活性最高。該甘露聚糖可通過影響細(xì)胞表面修飾降低細(xì)胞與細(xì)胞表面的相互作用來抑制病原菌的早期粘附和自聚。對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性最高(74.62±2.31)%，其次是單核增生李斯特菌(65.73±3.20)%、腸道沙門氏菌(57.67±2.70) %和對(duì)傷寒沙門氏菌(56.81±2.37) %[52]。

3.3 對(duì)發(fā)酵食品質(zhì)構(gòu)的影響

融合魏斯氏菌對(duì)食品質(zhì)構(gòu)的影響大多源于融合魏斯氏菌胞外多糖，一般被用作天然的添加成分，常被用來改善發(fā)酵乳制品和谷物產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特性。

3.3.1對(duì)水分遷移的影響

脫水收縮是酸奶制作過程中最常見的問題，處理不好會(huì)導(dǎo)致凝膠收緊后乳清從蛋白質(zhì)基質(zhì)中排出，乳清上升到凝膠表面。工業(yè)上一般使用不同類型的增稠劑和穩(wěn)定劑，如明膠、海藻酸鹽、淀粉或果膠[59]來規(guī)避這個(gè)問題。然而，這些添加劑不全是GRAS，也不能滿足消費(fèi)者需要較少人工添加劑產(chǎn)品的要求[60]，融合魏斯氏菌胞外多糖的加入可以替代這些人工添加劑。

融合魏斯氏菌 QS813生產(chǎn)的高分子量線性葡聚糖被證明是小麥面筋凍融循環(huán)(Freeze-thaw cycles, FTC)期間改善面筋的有效冷凍保護(hù)劑[55]。FTC會(huì)導(dǎo)致水分損失增加，使面筋的粘彈性降低，并改變水分的流動(dòng)性和分布。融合魏斯氏菌 QS813產(chǎn)生的高分子量線性葡聚糖，能增加鮮面筋的含水量，降低水分的流動(dòng)性和彈性參數(shù)，有效地延緩面筋的脫水，延緩FTC引起的水分再分配。FTC過程冰再結(jié)晶也會(huì)引起的機(jī)械損傷破壞連續(xù)面筋結(jié)構(gòu)，而融合魏斯氏菌 QS813葡聚糖在FTC過程中保持了面筋的結(jié)構(gòu)完整性，表明其對(duì)冰晶重結(jié)晶有抑制作用。

3.3.2對(duì)黏度與流變性的影響

乳酸菌胞外多糖被認(rèn)為是面包質(zhì)地改良劑，融合魏斯氏菌胞外多糖對(duì)發(fā)酵面團(tuán)的黏度和流變學(xué)有著顯著改善。20 ℃時(shí)，融合魏斯氏菌QS813在中式饅頭(Chinese steamed bread, CSB)發(fā)酵面團(tuán)中產(chǎn)生高含量的胞外多糖，并降低面團(tuán)pH。高含量的胞外多糖和適宜酸度能改善酸面團(tuán)CSB面團(tuán)的抗老化性能，并誘導(dǎo)谷蛋白大分子聚合物(Glutenin macropolymer, GMP)顆粒團(tuán)聚，從而進(jìn)一步增加了CSB的比體積，降低面包瓤的硬度[14]。在發(fā)芽小扁豆酸面團(tuán)發(fā)酵階段加入融合魏斯氏菌SLA4可增加面團(tuán)中葡聚糖含量，添加葡聚糖的小麥面包比體積增加，面包屑硬度和老化率也有一定程度的降低[13]。

融合魏斯氏菌 (W4)產(chǎn)生的W4胞外多糖能提高葡萄糖內(nèi)酯(Gluconsactone, GDL)酸牛奶表觀黏度，并對(duì)乳清保留率有顯著的正向影響，凝膠強(qiáng)度與對(duì)照酸奶相比顯著增強(qiáng)，并表現(xiàn)出與工業(yè)葡聚糖相同的性能[53]。

3.4 負(fù)面影響

但并不是所有的胞外多糖在發(fā)酵食品中都會(huì)產(chǎn)生積極影響，如在餅干制作過程中，非融合魏斯氏菌葡聚糖能提高最終的黏度與返黏度，而融合魏斯氏菌產(chǎn)生的葡聚糖EPS因酸化誘導(dǎo)可能會(huì)增加全粒餅干的厚度[18]。

4 融合魏斯氏菌在發(fā)酵食品中的功能特性

融合魏斯氏菌對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)具有舉足輕重的作用，在醬油和泡菜的釀造過程中融合魏斯氏菌是重要的發(fā)酵菌種，在混合發(fā)酵體系中能通過與其它微生物的相互協(xié)同作用，改善產(chǎn)品的最終品質(zhì)。目前報(bào)道的許多融合魏斯氏菌都是從混合發(fā)酵體系中獲得，表明其在混合發(fā)酵體系中作為共發(fā)酵劑與其它環(huán)境微生物存在著不同程度的相互作用，進(jìn)而對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)產(chǎn)生影響。此外，融合魏斯氏菌在發(fā)酵食品中還能夠提高某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，產(chǎn)生一些功能性物質(zhì)，減少食品添加劑的使用等。

4.1 對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)影響

在蕎麥發(fā)酵面團(tuán)發(fā)酵過程中，異常威克漢姆酵母菌的存在能促進(jìn)融合魏斯氏菌的生長(zhǎng)，融合魏斯氏菌也能夠延緩酵母菌的衰亡，二者在蕎麥面團(tuán)體系中具有共生作用。在蕎麥饅頭中，兩者共同發(fā)酵體系中的酯類物質(zhì)相對(duì)含量明顯高于單一菌株發(fā)酵組，呈現(xiàn)更濃郁的果香和酒香。并且蕎麥饅頭的風(fēng)味強(qiáng)度明顯高于單一乳酸發(fā)酵和單一酵母發(fā)酵，在感官評(píng)定中取得最高的整體接受度[17]。

4.2 提高發(fā)酵食品中纖維與氨基酸含量

融合魏斯氏菌可作為發(fā)酵食品的共發(fā)酵功能菌株顯著改善食品的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在面團(tuán)發(fā)酵階段加入融合魏斯氏菌SLA4，在增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)方面顯示出潛在的進(jìn)步(高纖維含量)和最終產(chǎn)品的感官(合成面包關(guān)鍵香氣化合物)質(zhì)量的提升[13]。在餅干制作過程中，融合魏斯氏菌與其它乳酸菌相比，使游離氨基酸含量增加最多，達(dá)到了0.46 g/100 g～0.48g/100 g[16]。

4.3 產(chǎn)葉酸

葉酸(vitamin B9)是涉及單碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)代謝酶的重要輔助因子，這些代謝酶參與DNA復(fù)制、修復(fù)和甲基化，以及核酸、某些氨基酸、泛酸鹽和其他維生素的合成，葉酸還可作為抗氧化劑，抑制自由基對(duì)動(dòng)物基因組的攻擊[61]。葉酸水平不足會(huì)導(dǎo)致一些健康問題，如神經(jīng)管缺、或心血管和結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加。研究人員從泰國(guó)發(fā)酵魚中分離出了52株乳酸菌，其中包括6株融合魏斯氏菌。這些融合魏斯氏菌具有良好的抗氧化活性，在無葉酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，具有產(chǎn)生葉酸的能力，葉酸含量為1.05 μg/mL～ 2.86 μg/mL[62]。盡管產(chǎn)葉酸的水平較低，但這是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌有生產(chǎn)葉酸的能力的研究。利用該原理可用于增加發(fā)酵食品中的天然葉酸含量，改善發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)，并且有潛力開發(fā)出一款新型功能性食品。

4.4 替代亞硝酸鈉

亞硝酸鹽能抑制病原微生物的生長(zhǎng)和食物的腐敗，保護(hù)肉制品的顏色，在食品工業(yè)中被廣泛用作食品防腐劑和腌肉制品的保色劑。亞硝酸鹽會(huì)與仲胺或叔胺相互作用形成亞硝胺，具有致癌性、致突變性和致畸性[63]。因此，改善肉制品的色澤與降低肉制品中的亞硝酸鹽含量在食品加工中起著重要的作用。在香腸發(fā)酵過程中，添加8 log10CFU/g的融合魏斯氏菌 L2，能增加香腸的紅色度、硬度、黏附性和咀嚼性，并降低加工過程中的pH、水分活度和亞硝酸鹽含量。融合魏斯氏菌L2也能抑制腸沙門氏菌的生長(zhǎng)，并水解香腸中的肌原纖維蛋白。與對(duì)照組相比(亞硝酸鈉0.05 g)，加入融合魏斯氏菌 L2之后，酯含量更豐富，具有更理想的特性[64]。此研究填補(bǔ)了低亞硝酸鹽香腸應(yīng)用方面的研究空白，利用該原理可以改善干發(fā)酵香腸的紅色度，并能有效地部分替代干發(fā)酵香腸中的亞硝酸鹽。

4.5 降低農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥能夠在人體組織或食物中積累，使用乳酸菌對(duì)這些化合物進(jìn)行解毒和去污是一種可行的、安全的和低成本的方法。融合魏斯氏菌Lb.Con能夠耐受不同濃度的毒死蜱，并能在添加了該農(nóng)藥的無糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。該菌株能夠利用毒死蜱作為碳源，對(duì)毒死蜱的去除能力約為25%。此外，該菌株具有耐受胃腸道條件的能力，這使它適合用于降解積累在有機(jī)體和發(fā)酵食品的毒死蜱[65]。利用該原理可進(jìn)一步研究該菌株在食品凈化中的應(yīng)用，在體內(nèi)降低農(nóng)藥毒性的可能性，以及在生物降解過程中的機(jī)理。

4.6 產(chǎn)氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是廣泛存在于發(fā)酵食品中的2A級(jí)致癌物，能夠直接導(dǎo)致人類產(chǎn)生肝癌，在酒類和發(fā)酵豆制品中經(jīng)常被檢出。瓜氨酸是高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中EC產(chǎn)生的最主要前體物質(zhì)，鹽脅迫是使體系中的融合魏斯氏菌積累瓜氨酸的主要原因。在9% NaCl條件下，融合魏斯氏菌能使瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高、積累最多[19]。因此，消除融合魏斯氏菌在鹽脅迫下積累瓜氨酸的能力將有助于高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中EC含量的控制。

5 總結(jié)與展望

目前沒有發(fā)現(xiàn)有害的相關(guān)代謝活性基因和毒力基因證據(jù)來證明融合魏斯氏菌的有害性，國(guó)內(nèi)外從臨床病例中發(fā)現(xiàn)融合魏斯氏極為罕見，且患者大多患有嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病。宿主的潛在因素和萬古霉素的使用才是在人類臨床病例中罕見分離出融合魏斯氏菌最可能的解釋。

融合魏斯氏菌胞外多糖因多樣性和高產(chǎn)量而被大量報(bào)道，各種胞外多糖具有不同的結(jié)構(gòu)特性和生物學(xué)活性，在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域有極大的開發(fā)應(yīng)用潛力。深入研究融合魏斯氏菌胞外多糖的相關(guān)功能基因、對(duì)功能基因過表達(dá)、培育優(yōu)良的工程菌株對(duì)未來工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)胞外多糖有重要的意義。在一些發(fā)酵食品中，融合魏斯氏菌的存在能產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)成分，但有關(guān)代謝調(diào)控機(jī)制還不清楚，可能導(dǎo)致融合魏斯氏菌對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)產(chǎn)生不確定性，未來還需要更加深入的解析其調(diào)控代謝機(jī)制，以保證產(chǎn)品的最終品質(zhì)。

融合魏斯氏菌具有優(yōu)秀的胃腸道生存能力與腸道定殖特性、對(duì)許多病原微生物也有抑制作用、有的還具良好的抗氧化活性，加之已從健康人體的糞便中分離出來，被廣泛的認(rèn)為具有成為益生菌的良好潛力。有關(guān)益生菌的研究已成為當(dāng)下的熱點(diǎn)話題，目前已知的益生菌大部分為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，對(duì)其的研究已有確定的方向和成熟的體系，眾多的益生菌產(chǎn)品也已經(jīng)生產(chǎn)商用。但有關(guān)融合魏斯氏菌的研究尚在起步階段，未來還需要利用更多的體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)來驗(yàn)證與益生特性相關(guān)的健康功效。此外，還應(yīng)結(jié)合人體臨床實(shí)驗(yàn)以保證體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的可靠性，同時(shí)也能驗(yàn)證其在人體的安全性。未來隨著相關(guān)研究的不斷深入，融合魏斯氏菌必將在食品工業(yè)領(lǐng)域有越來越多的應(yīng)用。