王樂惠， 張繼寧， 周化嵐， 張建國

上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093

米酒作為我國傳統(tǒng)飲品，廣受消費(fèi)者喜愛。米酒是以糯米、黑米、秈米等作為原料，通過浸泡、蒸煮、糖化、微生物發(fā)酵等多步驟工藝釀造制得(圖1)的傳統(tǒng)飲品。米酒的酒精含量也可高達(dá)20%v/v。米酒不僅酸甜可口，而且含有活性生物肽、氨基酸、有機(jī)酸、維生素、多酚類、酯類等多種有益健康的成分(表1)，具有增強(qiáng)食欲、免疫力、有效地改善消化腺分泌的功能[1]，以及降血壓及血脂[2]、舒緩疲勞、保護(hù)心臟的作用[3]。而且，王苗苗等還通過對羥自由基、氧自由基和DPPH自由基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)的抑制實驗報道了米酒的抗氧化性[4]。米酒釀造過程酵母菌對米酒品質(zhì)有重要影響。而且我國各地米酒的種類繁多，米酒中酵母菌種類各異。因此研究米酒中酵母菌的種類和作用效果對調(diào)控米酒工藝，提升米酒品質(zhì)具有重要意義。本文綜述了米酒中酵母菌，以及基于酵母菌的米酒品質(zhì)和風(fēng)味改善的應(yīng)用。

表1 米酒中功能成分

圖1 傳統(tǒng)的米酒制備工藝示意圖

2 米酒中酵母菌分析技術(shù)及主要菌株

酵母菌分離、形態(tài)學(xué)分析、生化測試和分子生物學(xué)鑒定是確定酵母菌菌株的主要步驟。從米酒發(fā)酵過程中分離酵母菌是開展研究的重要步驟。由于酵母可以在組成廣泛的培養(yǎng)基上進(jìn)行生長，因此從米酒發(fā)酵中分離酵母的培養(yǎng)基有麥芽提取物培養(yǎng)基、酵母培養(yǎng)基、葡萄糖-酵母提取物培養(yǎng)基等，并添加25 mg/L氯霉素[15]或土霉素(100 mg/L) 等抗生素篩選酵母菌。酵母菌通常在 pH 3.8～6.0 條件下生長，因此調(diào)整pH至更低值限制細(xì)菌生長[16]篩選酵母。添加聯(lián)苯(50 mg/L)、乙醇(12%)、亞硫酸鹽(0.015%) 選擇性有利于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生長[17]。

根據(jù)形態(tài)學(xué)描述、生理生化測試仍是目前常用的微生物鑒定技術(shù)[18]。酵母的主要特征為橢球狀或圓柱形細(xì)胞形狀，在極端環(huán)境下產(chǎn)生假菌絲和光滑細(xì)胞壁。例如酵母菌受到環(huán)境脅迫由球形轉(zhuǎn)變?yōu)槎虣E球狀子囊孢子。目前已有商業(yè)化的酵母鑒定試劑，如法國BioMérieux 公司的API 20C 和ID 32C試劑盒、美國Biolog Inc.公司的Biolog YT試劑盒等。近年來，隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析、脈沖場凝膠電泳技術(shù)(PFGE)、指紋圖譜等新技術(shù)已經(jīng)用于分析酵母菌。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA方法利用隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA片段，再進(jìn)行可視化分析。PFGE分析酵母菌株染色體組成，完成酵母菌種鑒定。指紋圖譜方法分析酵母基因組中隨機(jī)存在重復(fù)的微衛(wèi)星序列，鑒別酵母菌株。例如，酵母基因組的delta序列的數(shù)目和位置常用于區(qū)分酵母菌株[19]。與PFGE方法相比，delta序列指紋圖譜在菌株水平的擴(kuò)增模式具有偏好性。新型菌群分析技術(shù)，例如內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally Transcribed Spacer，ITS)測序，還有待于應(yīng)用于米酒釀造中酵母菌分析。ITS序列是位于真菌18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因之間，分別為ITS1和ITS2。由于ITS承受自然選擇壓力較小，表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。并且ITS序列片段較小(ITS1和ITS 2長度分別為350 bp和400 bp)，易于分析，目前已被廣泛用于真菌不同種屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。

表2總結(jié)了米酒中主要的酵母菌。雖然我國米酒產(chǎn)地的多樣性，酵母菌數(shù)有所不同，但是總體上主要為釀酒酵母菌。

表2 米酒中鑒定的酵母菌

3 酵母菌株改造技術(shù)

酵母菌株改造主要通過同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)兩種方式修復(fù)已斷裂酵母基因時插入，或者刪去一段基因來改變酵母基因組。圖2A為通過HR方式插入外源基因到酵母基因組的原理。外源基因通過兩端的同源臂與酵母基因組中相對應(yīng)的片段發(fā)生同源雙交換，以“復(fù)制-粘貼”的方式安全(Generally recognized as safe，GRAS)且精確地插入到酵母基因組中。CRISPR/Cas (有規(guī)律間隔的聚類短回文重復(fù)及相關(guān)蛋白) 系統(tǒng)是一種全新的基因編輯技術(shù)，在2013年首次應(yīng)用于釀酒酵母[31]。圖2B為CRISPR/Cas系統(tǒng)用于酵母基因改造的原理。內(nèi)切酶Cas被一小段RNA引導(dǎo)到匹配的基因序列后完成切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)[32-33]。酵母通過HR或NHEJ 途徑修復(fù)時完成基因片段的插入或敲除。NHEJ方式在沒有模板的情況下將雙鏈斷裂的酵母基因組連接起來，故NHEJ較易產(chǎn)生錯誤。HR和CRISPR在基因改造的精確性、無縫和無標(biāo)記特點(diǎn)方面具有相互補(bǔ)充的作用。

(A: 同源重組；B: CRISPR技術(shù))

雙鏈斷裂是酵母細(xì)胞交換基因所必需的步驟[34]。例如釀酒酵母的一種內(nèi)切酶(HO-內(nèi)切酶)能特異性切割基因組中交配型位點(diǎn)(Mating-type, MAT)，產(chǎn)生雙鏈斷裂[35]。缺失HO基因的酵母細(xì)胞的傳代穩(wěn)定，不易發(fā)生基因交換。這表明DNA雙鏈斷裂是配合型細(xì)胞的基因交換過程所必需的步驟。缺失HO基因的酵母突變體可作為穩(wěn)定的單倍體菌株被用于基因改造。而且，釀酒酵母進(jìn)行HR的同源臂可短至35 bp[36]。在釀酒酵母中重組表達(dá)HR的關(guān)鍵酶Rad51、Rad52顯著提高HR效率[37-38]。相比用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行克隆引入多余堿基的缺點(diǎn)，HR無需引入外來的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，實現(xiàn)無縫連接。HR可將25個長17 kb到26 kb的DNA片段在釀酒酵母中組裝成支原體基因組[39-40]。該技術(shù)還被用于組裝全合成的釀酒酵母基因組(酵母2.0)[41]。

為了避免在基因改造過程中使用抗性標(biāo)記基因，研究人員開發(fā)了以URA3基因為篩選標(biāo)記的重組酶誘導(dǎo)系統(tǒng)?；赨RA3編碼的蛋白質(zhì)具有抗5′-氟乳酸功能，重組酶誘導(dǎo)系統(tǒng)通過基因重組或丟失質(zhì)粒的方式，實現(xiàn)不采用抗性標(biāo)記基因的方式[42]篩選突變菌株[43]。另外一種方法為基于噬菌體p1特異性的Cre-loxP重組系統(tǒng)。LoxP是一段Cre重組酶識別的34 bp序列[44]。Cre-loxP重組系統(tǒng)中在標(biāo)記基因兩側(cè)分別整合loxP位點(diǎn)，完成重組后，Cre重組酶在酵母中表達(dá)并切割loxP位點(diǎn)，刪除標(biāo)記基因[45]。

4 基于酵母菌提升米酒釀造的進(jìn)展

酵母菌在米酒釀造過程中不僅有生產(chǎn)乙醇的作用，還與其它微生物共同作用，對改進(jìn)米酒釀造工藝、提高米酒品質(zhì)有重要作用。

4.1 改進(jìn)米酒釀造工藝

基于酵母菌株改進(jìn)米酒釀造工藝的研究主要為兩個方面。第一方面為采用外加酵母菌株改進(jìn)釀造工藝。例如，楊建忠等利用干酵母延長黑米酒生產(chǎn)期，提高了出酒率，降低了發(fā)酵酸度，增強(qiáng)發(fā)酵力，防止雜菌感染，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[46]。馬玉麟采用耐高溫活性干酵母改進(jìn)豉香型米酒釀造工藝，豉香型米酒獲得了國優(yōu)等多個獎項[47]。第二個方面為多種微生物復(fù)配，改進(jìn)米酒釀造工藝。顏兵優(yōu)化了釀酒酵母和異常漢遜酵母的復(fù)配比例為100∶1時，乙酸乙酯含量提高了6.1倍；進(jìn)一步優(yōu)化得到以上2種酵母的最優(yōu)釀造條件為31.2 ℃、發(fā)酵時間10.7 d、料液比80%(v/v)時，具有較高出酒率[48]。除酵母外，米酒中常見的微生物為霉菌，因此，目前與酵母復(fù)配的微生物主要為霉菌。例如，袁華偉等將釀酒酵母與米曲霉復(fù)配后，優(yōu)化了酵母接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間，結(jié)果表明酵母接種量1.0%(以原料大米計)、25 ℃的13 d兩步法發(fā)酵工藝顯著提升了米酒的產(chǎn)率和質(zhì)量[49]。盧福芝等將酵母菌與毛霉和酵母復(fù)配后發(fā)酵，得到最高乙醇產(chǎn)量為207 g/L，不僅釀造工藝更簡單，而且米酒成分更豐富地包括醇、醛、酸及酯[26]。

4.2 提高米酒風(fēng)味

酵母提高米酒風(fēng)味的研究主要集中在米酒風(fēng)味的判斷和香味成分的鑒定。例如，袁華偉等將釀酒酵母和米曲霉進(jìn)行復(fù)合后釀酒的米酒的乙醇含量為13.2%(v/v)。米酒呈現(xiàn)米黃色，具有水果香和花香，且感官評分為87.1分[49]。伍國明等利用酵母菌發(fā)酵郁南無核黃皮果和糯米，得到橙黃色、醇厚、甘甜爽口有獨(dú)特風(fēng)味的米酒[50]。王奇盛等優(yōu)化了異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycesfibuligera)和釀酒酵母三種酵母復(fù)配比例后，釀造米酒中高級醇含量下降了7.2%，米酒感官評分高達(dá)90.1分[51]。王奇盛等測定了上述三種酵母發(fā)酵米酒的風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明有機(jī)酸含量降低，酯類和醛類物質(zhì)增加，感官評定表明米酒的口感與香氣有著明顯的提升[52]。鄭瑞龍等篩選到1株具有優(yōu)良香氣特征的釀酒酵母NO.26。使用該菌株發(fā)酵米酒的香味物質(zhì)含有苯乙醇(玫瑰、花香)、芳樟醇(薰衣草、花香)、十六酸乙酯(果香、奶油香)等揮發(fā)性風(fēng)味化合物[53]。李澤洋等利用扣囊復(fù)膜酵母 11Z1發(fā)酵的米酒中包含醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種和其他類4種，共計21種風(fēng)味物質(zhì)。其中，乙酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯的量分別提高了1.6、2.2和1.4倍[24]。車逸心等復(fù)配紅曲菌和酵母后釀造的米酒中含有47種揮發(fā)性組分(6種醇類、14種酸類、12種酯類、8種醚類、4種醛酮類、2種醌類和1種酚類)[54]。由于用于米酒釀造的菌株、原料、工藝條件的不同，形成米酒風(fēng)味的物質(zhì)種類和含量都有顯著差異。

5 展望

多種米酒的酵母菌已經(jīng)被分離鑒定，而且也基于酵母改進(jìn)了米酒釀造工藝，提升了米酒風(fēng)味，說明酵母菌在米酒釀造的重要作用已經(jīng)體現(xiàn)。但是，對米酒中酵母菌的研究仍有較大空間，主要體現(xiàn)在2個方面。首先，ITS測序等新型菌群分析技術(shù)應(yīng)更廣泛用于米酒釀造中酵母菌的鑒定?；谠蝗拥腎TS測序避免了培養(yǎng)酵母過程中菌株種類的改變，有利于發(fā)現(xiàn)更多的酵母菌種。其次，加強(qiáng)合成生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用。目前酵母分子生物學(xué)技術(shù)不僅僅可以利用啟動子工程、拷貝數(shù)、輔因子調(diào)節(jié)蛋白的改造，還可以進(jìn)行組合途徑的優(yōu)化，代謝途徑動態(tài)調(diào)控、合成基因組等工作，提升米酒的釀造工藝和品質(zhì)。