王夢娟，王靈昭*，顧涵，陳康瑞，程遠霞，邱春江，盤賽昆，顏冬梅

(1.江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；3.連云港百鮮屋食品有限公司，江蘇 連云港 222199)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)因其巨大的生物量和潛在的漁業(yè)資源而日益受到人們的關(guān)注[1]，其總生物量和每年后期幼體總產(chǎn)量分別是1.17～3.79億噸和3.42～5.36億噸[2]，年可捕量在0.6～1億噸[3]。南極磷蝦的一個顯著特征是體內(nèi)含有功能強大且能夠降解各種蛋白質(zhì)的酶系統(tǒng)[4]。南極磷蝦死后，由于體內(nèi)酶抑制系統(tǒng)活性降低而極易自溶[5]。

利用南極磷蝦自溶物制備調(diào)味品基料，可以減少外源酶的使用，節(jié)省成本，且反應(yīng)易被熱處理終止[6]。

鮮味在東方國家深受喜愛，已被廣泛接受為區(qū)別于酸、甜、苦、咸4種基本滋味的第5種基本滋味[7]。近年來，營養(yǎng)型鮮味調(diào)味料備受青睞，增速迅猛，該類調(diào)味料內(nèi)含動植物蛋白水解產(chǎn)物，可增強食物風味，同時補充人體的必需氨基酸、小分子肽等營養(yǎng)成分[8]。

在南極磷蝦自溶處理后，再加入外源蛋白酶進一步使南極磷蝦深度酶解，一方面可以提高原料蛋白質(zhì)利用率，另一方面可以獲得更多氨基酸或小分子肽。因此，本文以產(chǎn)物的鮮味品質(zhì)為導向，研究南極磷蝦自溶后產(chǎn)物的深度酶解工藝以及產(chǎn)物品質(zhì)，旨在為高效利用南極磷蝦生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)型鮮味調(diào)味料提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮南極磷蝦蝦磚：購于上海億鑫水產(chǎn)品有限公司，置于-50 ℃條件下備用；檸檬酸、三聚磷酸鈉(食品級)：購于上海聯(lián)合食品添加劑有限公司；堿性蛋白酶(2×104U/g)、中性蛋白酶(2×104U/g)、胰蛋白酶(3×104U/g)、木瓜蛋白酶(3×104U/g)：購于伊勢久生物科技有限責任公司；其他生化試劑(均為分析純)：購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TL-5.0臺式離心機 上海市離心機械研究所有限公司；767多功能養(yǎng)生破壁機 中山市貝殼電器有限公司；GL-3250B磁力攪拌器 其林貝爾儀器制造有限公司；S20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9240A鼓風干燥箱、真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日本株式會社日立高新技術(shù)科學那柯事業(yè)所。

1.3 實驗方法

1.3.1 南極磷蝦自溶物深度酶解流程

將冰鮮南極磷蝦蝦磚粉碎、自溶，然后添加外源蛋白酶酶解，滅酶、離心，取液相進行感官評價。

參考Wang等的方法自溶，并作如下修改：向粉碎后的磷蝦中加水(蝦∶水為2∶7，質(zhì)量比)勻漿，調(diào)節(jié)pH至7.5，在43.2 ℃下攪拌自溶5 h。酶解時，加入不同的外源蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶)，用1%的檸檬酸或三聚磷酸鈉調(diào)節(jié)pH，控制酶解溫度和時間進行酶解，然后滅酶(100 ℃，10 min)、離心(6 000 r/min，10 min)，得到液相樣品。

1.3.2 酶的種類對酶解液鮮味強度的影響

任務(wù)與其所屬區(qū)域中心點的距離Ri:完成與未完成的平均灰色關(guān)聯(lián)度為0.90385，是四大影響因素中相對較低的，但是也不可忽視。四大影響因子的平均關(guān)聯(lián)度都在0.9以上，影響因素定義正確且不可忽視。

在自溶物中加入3 000 U/g不同的蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶)，并調(diào)節(jié)至不同的pH(中性蛋白酶pH 6.0，木瓜蛋白酶pH 7.0，堿性蛋白酶pH 10.0，胰蛋白酶pH 8.0)，在43.2 ℃下酶解4 h，然后滅酶、離心，得到液相樣品，對樣品進行鮮味強度的感官評價，并計算酶解液得率。酶解液得率定義為樣品體積占自溶時加水體積的百分比。

1.3.3 酶添加量對酶解液鮮味強度的影響

在自溶物中按不同的量(2 500，3 000，3 500，4 000，4 500 U/g)加入最佳的蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在43.2 ℃下酶解4 h，然后滅酶、離心，得到液相樣品，對樣品進行鮮味強度的感官評價。

1.3.4 酶解時間對酶解液鮮味強度的影響

在自溶物中按最佳的量加入最佳的蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在43.2 ℃下酶解不同時間(3，3.5，4，4.5，5 h)，然后滅酶、離心，得到液相樣品，對樣品進行鮮味強度的感官評價。

1.3.5 酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響

在自溶物中按最佳的量加入最佳的蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在不同溫度下(50，55，60，65，70 ℃)酶解最佳時間，然后滅酶、離心，得到液相樣品，對樣品進行鮮味強度的感官評價。

1.3.6 酶解工藝優(yōu)化

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.7 感官評價

以0.35%的味精溶液為標準品，用評分法對樣品進行感官評價[9]。

感官評價室溫度控制在(25±2) ℃, 評價小組由10名成員組成。樣品評分從0分到10分，0分表示被檢測的樣品沒有鮮味，而10分則表示樣品具有最強的鮮味。0.35%的味精標準品溶液的鮮味強度為5分，將樣品與標準品進行比較，然后予以打分評價[10]。

1.3.8 樣品的理化分析

對最優(yōu)工藝下的樣品進行化學分析。水分含量分析采用GB 5009.3-2016第一法；蛋白質(zhì)含量分析采用GB 5009.5-2016 第一法。

氨基酸含量分析參考GB 5009.124-2016中的方法：酸水解時，稱取0.050 g干燥后的樣品，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，充氮封管，在110 ℃下水解22～24 h，取出冷卻，過濾至50 mL，吸取1 mL于離心管中，在65 ℃下真空干燥，干燥后加入1 mL 0.02 mol/L的HCl溶液，過0.22 μm針筒濾膜后測定。堿水解參考周虹等[11]的方法：稱取0.100 g樣品，加入1.5 mL 4 mol/L的NaOH溶液，充氮封管，110 ℃水解22～24 h，冷卻后加入1 mL 6 mol/L的HCl溶液，過濾后用0.02 mol/L鹽酸定容至50 mL，搖勻，取1 mL過0.22 μm針筒濾膜后測定。

1.3.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，用方差分析(ANOVA)比較數(shù)據(jù)差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類對酶解液鮮味強度的影響

酶的種類對酶解液鮮味強度的影響見圖1。

圖1 酶的種類對酶解液鮮味強度的影響Fig.1 Effect of types of enzymes on umami intensity of enzymatic hydrolysates注：相同指標下，不同字母表示結(jié)果具有顯著差異(P<0.05)，下圖同。

由圖1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解液的鮮味強度無顯著性差異(P>0.05)，而堿性蛋白酶酶解液的鮮味強度顯著高于其他3種蛋白酶酶解液的鮮味強度(P<0.05)。此外，堿性蛋白酶的酶解液得率為108.7%，與其他蛋白酶的酶解液得率無顯著性差異(P>0.05)。因此，最佳的蛋白酶為堿性蛋白酶，后續(xù)采用堿性蛋白酶進行酶添加量、酶解時間、酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響研究。劉璐等[12]對南極磷蝦酶解工藝的研究表明，堿性蛋白酶是酶解反應(yīng)的最佳蛋白酶，與本研究結(jié)果相似。

2.2 酶添加量對酶解液鮮味強度的影響

酶添加量對酶解液鮮味強度的影響見圖2。

圖2 酶添加量對酶解液鮮味強度的影響Fig.2 Effect of enzyme addition amount on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由圖2可知，堿性蛋白酶添加量為3 000 U/g時，酶解液的鮮味強度顯著高于其他添加量下酶解液的鮮味強度(P<0.05)。這可能是因為堿性蛋白酶添加量的不同使得酶解液中鮮味氨基酸或鮮味肽的生成情況不同，產(chǎn)物成分的不同導致酶解液的鮮味強度不同。此外，堿性蛋白酶添加量為3 000 U/g時，酶解液得率為115.0%，與其他添加量下的酶解液得率無顯著性差異(P>0.05)。因此，最佳的酶添加量為3 000 U/g，后續(xù)采用此添加量進行酶解時間、酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響研究。

2.3 酶解時間對酶解液鮮味強度的影響

酶解時間對酶解液鮮味強度的影響見圖3。

圖3 酶解時間對酶解液鮮味強度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由圖3可知，酶解時間為4 h時，酶解液的鮮味強度顯著高于其他酶解時間下酶解液的鮮味強度(P<0.05)，酶解時間少于或多于4 h均導致酶解液的鮮味強度顯著下降(P<0.05)。這可能是因為隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物中氨基酸和肽的組成發(fā)生變化，鮮味氨基酸或鮮味肽的相對含量下降，而一些苦味或其他不良風味的成分增加。此外，酶解時間為4 h時，酶解液得率為106.3%，與其他酶解時間下的酶解液得率無顯著性差異(P>0.05)。因此，最佳的酶解時間為4 h，后續(xù)采用此酶解時間進行酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響研究。

2.4 酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響

酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對酶解液鮮味強度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on umami intensity of enzymatic hydrolysates

由圖4可知，酶解溫度為60 ℃時，酶解液的鮮味強度顯著高于其他酶解溫度下酶解液的鮮味強度(P<0.05)，酶解溫度低于或高于60 ℃均導致酶解液的鮮味強度顯著下降(P<0.05)。這可能是因為隨著溫度的上升，蛋白酶高溫變性導致酶活力降低[13]，產(chǎn)物中的鮮味成分在高溫的作用下生成量減少。此外，不同酶解溫度下酶解液得率沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，最佳酶解溫度為60 ℃。滿洋等[14]研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦副產(chǎn)物酶解蛋白胨工藝的適宜溫度為60 ℃，與本研究結(jié)果相似。

2.5 酶解工藝優(yōu)化

酶解工藝優(yōu)化的實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗設(shè)計及酶解產(chǎn)物的鮮味強度Table 2 Orthogonal experimental design and umami intensity of enzymatic hydrolysates

由表2可知，4個因素對鮮味強度影響程度的主次順序為酶添加量>酶的種類>酶解溫度>酶解時間；酶解工藝的最佳條件為A3B2C2D3，即在堿性蛋白酶添加量2 800 U/g、酶解溫度60 ℃、酶解時間4 h的條件下，酶解產(chǎn)物鮮味強度最大。對該條件進行驗證實驗，結(jié)果表明，酶解液的鮮味強度為8.4，酶解液得率為116.2%。進一步分析此條件下的酶解液水分含量和蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明，水分含量為96.4 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為2.95 g/100 g。

2.6 最優(yōu)酶解工藝下產(chǎn)物的氨基酸分析

表3 南極磷蝦深度酶解產(chǎn)物的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of deep enzymatic hydrolysates from Antarctic krill

續(xù) 表

由表3可知，依據(jù)FAO/WHO對成人/嬰幼兒的氨基酸模式要求，酶解液中含有9種人體必需氨基酸?？偘被岷繛?.03 g/100 g，必需氨基酸占比為53.79%，非必需氨基酸占比為49.17%。酶解液中的組氨酸不能滿足FAO/WHO對成人/嬰幼兒的要求，因而為限制性氨基酸。根據(jù)氨基酸滋味不同，可以將其分為甜味氨基酸、苦味氨基酸、鮮味氨基酸和無味氨基酸，鮮味氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，甜味氨基酸包括蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸，苦味氨基酸包括組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其余氨基酸為無味氨基酸[16-18]。因此，酶解液含有鮮味氨基酸0.82 g/100 g，占比為27.06%；含有甜味氨基酸0.58 g/100 g，占比為19.15%。酶解液的鮮味氨基酸含量較高，甜味氨基酸主要為丙氨酸。丙氨酸除了可以提供甜味外，還可以與鮮味氨基酸起到協(xié)同提鮮的作用[19]。

3 結(jié)論

以利用南極磷蝦制備鮮味調(diào)味料為目標，研究了南極磷蝦自溶物深度酶解工藝及產(chǎn)物品質(zhì)。結(jié)果表明，以產(chǎn)物的鮮味強度為指標，深度酶解的最佳條件為選用堿性蛋白酶，酶添加量2 800 U/g，酶解溫度60 ℃，酶解時間4 h。此條件下，酶解產(chǎn)物得率為116.2%，酶解液含有蛋白質(zhì)2.95 g/100 g、水分96.4 g/100 g。酶解液的氨基酸組成分析表明，總氨基酸含量為3.03 g/100 g，鮮味氨基酸占比27.06%，甜味氨基酸占比19.15%。研究結(jié)果為以南極磷蝦為原料，利用“自溶復合深度酶解”技術(shù)制備優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)型鮮味調(diào)味料提供了理論和技術(shù)支持。