尹詩欣，李志嶼，楊晶淼，廖永山，楊創(chuàng)業(yè),3，鄧岳文,3，王慶恒,3

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué) 珍珠研究所，廣東 湛江 524088；3.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088)

微管蛋白酪氨酸連接酶樣(tubulin tyrosine ligase-like，TTLL)是一類參與α-、β-微管蛋白翻譯后修飾的酶，廣泛分布于神經(jīng)組織、胞質(zhì)、紡錘體、中心粒、鞭毛和纖毛軸絲的微管內(nèi)，特異性催化氨基酸與微管蛋白或其他底物的連接，該過程對于維持細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期、有絲分裂及細(xì)胞運(yùn)動具有重要作用[1-4]。目前，在哺乳動物中已經(jīng)有13種TTLL被報(bào)道[5]。Erck等[6]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Musmusculus神經(jīng)元中TTL，會嚴(yán)重阻礙其生長發(fā)育，甚至造成其死亡；而離體培養(yǎng)的神經(jīng)元卻表現(xiàn)出生長的異常加快和軸突的過早建立，說明其在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Pathak等[7]對斑馬魚DaniorerioTTLL基因研究發(fā)現(xiàn)，TTLL1在大腦神經(jīng)元、TTLL4在肌肉及TTLL7在耳板中均有組織特異性表達(dá)；聯(lián)合敲除TTLL3和TTLL6，會導(dǎo)致纖毛運(yùn)動能力幾乎完全喪失，并誘導(dǎo)多種軸突超微結(jié)構(gòu)缺陷，說明該基因可能在纖毛運(yùn)動及生長發(fā)育方面發(fā)揮作用。隨著高通量測序技術(shù)在軟體動物研究中的廣泛應(yīng)用，已發(fā)現(xiàn)在馬氏珠母貝Pinctadafucatamartensii、長牡蠣Crassostreagigas、美洲牡蠣Crassostreavirginica和蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis等基因組序列中均注釋到了TTLL基因，但對其具體功能及序列信息的研究尚未見報(bào)道。本課題組前期通過馬氏珠母貝QTLs與2個近交家系(A：F1♀×F1♂，D：F2♀×F2♂)和2個雜交家系(B：F1♀×F2♂，C：F2♀×F1♂)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)TTLL基因在雜交家系中表達(dá)量相對較高[8]，暗示其可能參與馬氏珠母貝生長發(fā)育過程。

馬氏珠母貝是中國培育海水珍珠的主要貝類，廣泛分布于中國南方沿海地區(qū)。近年來，由于海區(qū)環(huán)境的惡化及養(yǎng)殖群體性狀的退化，嚴(yán)重影響了馬氏珠母貝的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化發(fā)展[9-10]。針對馬氏珠母貝的產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，相關(guān)部門在擴(kuò)大群體數(shù)量、保護(hù)優(yōu)良遺傳基因的同時(shí)，選育具有優(yōu)良性狀且適應(yīng)海區(qū)養(yǎng)殖的新品種，是解決當(dāng)前產(chǎn)業(yè)困境的有效方法之一。因此，深入研究影響馬氏珠母貝經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)基因，對其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。本研究中，通過克隆并分析馬氏珠母貝TTLL基因序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在不同組織、不同規(guī)格個體、不同家系個體及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，對該基因的外顯子SNPs進(jìn)行篩選，并分析其與生長性狀間的關(guān)聯(lián)性，以期為應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇改良馬氏珠母貝生長等重要經(jīng)濟(jì)性狀提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取廣東省徐聞縣大井村海區(qū)規(guī)格一致、生長旺盛和無病害的2齡馬氏珠母貝10只，剪取閉殼肌、外套膜、性腺、足、鰓和肝胰腺，經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱中，用于分析TTLL基因在不同組織中的表達(dá)。同批培育的馬氏珠母貝分為大規(guī)格和小規(guī)格個體2組，分別挑取20只，大規(guī)格貝殼長為(60.45±3.18)mm，小規(guī)格貝殼長為(48.38±3.68)mm，然后取其閉殼肌經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱中，用于分析TTLL基因在不同規(guī)格個體中的表達(dá)。選取近交家系和雜交家系的2齡馬氏珠母貝各20只，取其閉殼肌，經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱中，用于分析TTLL基因在不同家系個體中的表達(dá)[8]。取馬氏珠母貝的卵、受精卵、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、早期殼頂幼蟲和眼點(diǎn)幼蟲，經(jīng)液氮速凍后保存于超低溫冰箱中，用于分析TTLL基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1TTLL基因全長的克隆 基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[11]，篩選注釋為TTLL基因的基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)全長克隆引物及熒光定量引物(表1)。按照Trizol法說明書提取馬氏珠母貝不同組織的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳及Nano Drop ND1000 紫外分光光度計(jì)分析RNA的純度及濃度。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit說明書制備5′RACE和3′RACE模板。利用RACE-PCR技術(shù)對5′端和3′端進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照楊晶淼[8]的研究方法，獲得PCR產(chǎn)物后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用微量核酸分析儀檢測其濃度，將目的片段經(jīng)切膠回收純化后，連接至pMD19-T載體上，再轉(zhuǎn)化至E.coli-DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證呈陽性的克隆送至生工生物工程股份有限公司(廣州分部)測序。

表1 TTLL基因克隆及熒光定量所用引物序列Tab.1 Primer sequence used in the cloning and Real-time PCR of TTLL gene

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接及氨基酸序列推導(dǎo)；利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Finder軟件預(yù)測開放閱讀框ORF；采用PSITE V1軟件分析氨基酸序列活性功能位點(diǎn)；采用SMART 軟件預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；采用ExPASy軟件預(yù)測蛋白等電點(diǎn)、分子量和親疏水性；采用TMHMM 2.0軟件預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；采用SignalP 5.1軟件預(yù)測是否具有信號肽；采用SOPMA軟件分析蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)； 采用Phyre軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；采用Blastx軟件在線同源性搜索比對，查找多個物種的TTLL氨基酸序列；采用ClustalW軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對；采用MEGA 7.0軟件，基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析網(wǎng)站參照房曉宸等[12]和陳琨等[13]的方法。

1.2.3TTLL基因表達(dá)分析 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TTLL基因在馬氏珠母貝不同組織、不同規(guī)格、不同家系及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。qRT-PCR反應(yīng)程序參照焦鈺等[14]的方法。以β-actin作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT法計(jì)算TTLL基因的相對表達(dá)量。

1.2.4TTLL基因SNP位點(diǎn)的篩選及分析 根據(jù)本課題組前期獲得的馬氏珠母貝“海選 1 號”(655個個體)和金黃殼色選育群體(193個個體)的全基因組重測序數(shù)據(jù)[15]，篩選馬氏珠母貝TTLL基因外顯子區(qū)的SNP位點(diǎn)；采用PopGen32軟件統(tǒng)計(jì)分析SNP位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和哈迪-溫伯格平衡(HWE)等遺傳參數(shù)；采用PIC軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量；采用Haploview 4.2軟件計(jì)算D′值和R2值，以及進(jìn)行連鎖不平衡分析；采用SPSS 24.0軟件對不同單倍型的生長性狀和突變位點(diǎn)與生長指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0 軟件分別對各組織、各發(fā)育時(shí)期及各家系中的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，對大、小規(guī)格的表達(dá)量進(jìn)行T檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTLL基因的序列和結(jié)構(gòu)

利用DNAMAN軟件將測序獲得的結(jié)果與基因組Unigene序列進(jìn)行比對，拼接獲得馬氏珠母貝TTLL基因cDNA全長為1 962 bp，其中，5′UTR長度為134 bp，3′UTR長度為191 bp，開放閱讀框(ORF)為1 611 bp，編碼536個氨基酸，polyA為26 bp(圖1)。

5′UTR和3′UTR用小寫字母表示；ORF用大寫字母表示；帶框核苷酸分別對應(yīng)起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；黃色背景代表TTL結(jié)構(gòu)域。5′UTR and 3′UTR are showed by letters; ORF are showed by capital letters; The boxed nucleotides correspond to the initiation codon (ATG) and stop codon (TAG); Yellow background represents the TTL domain.圖1 馬氏珠母貝TTLL的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Full length cDNA and the deduced amino acid sequence of TTLL gene in pearl oyster Pinctada fucata martensii

PSITE V1軟件預(yù)測顯示，馬氏珠母貝TTLL蛋白含有2個N-糖基化位點(diǎn)、2個cAMP與cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、13個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、2個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、5個N-豆蔻酰化位點(diǎn)、2個異戊二烯基結(jié)合位點(diǎn)和5個微體C端信號序列。SMART分析顯示，TTLL氨基酸序列靠近N端含有一個TTL結(jié)構(gòu)域，位于第1位～第207位氨基酸上。經(jīng)Blastx比對發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝、美洲牡蠣、長牡蠣、蝦夷扇貝、紫貽貝Mytilusgalloprovincialis、歐洲扇貝Pectenmaximus、小家鼠和人Homosapiens等物種的TTLL氨基酸序列中均含有TTL結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 不同物種TTL結(jié)構(gòu)域比較Fig.2 Comparison of TTL structure domain in different species

2.2 TTLL蛋白的理化性質(zhì)

采用ExPASy軟件對馬氏珠母貝TTLL蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白原子總量為8 824，分子結(jié)構(gòu)式為C2 758H4 408N802O827S29，預(yù)測該蛋白理論等電點(diǎn)(pI)為7.91，相對分子質(zhì)量為62 960。TTLL蛋白由20種氨基酸組成，其中，N端氨基酸殘基為蛋氨酸(Met)，亮氨酸(Leu)含量最高(10.4%)，色氨酸(Trp)含量最低(0.4%)；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為83個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為85個；不穩(wěn)定系數(shù)為67.51，被劃分為不穩(wěn)定蛋白；脂溶性指數(shù)與親水性平均系數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)分別為80.21和-0.683。采用Signal P 4.1和TMHMM 2.0軟件在線預(yù)測該蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，均未發(fā)現(xiàn)。TTLL蛋白二級結(jié)構(gòu)顯示，α-螺旋占46.64%,無規(guī)則卷曲占32.84%,延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占14.55%和5.97%。

2.3 TTLL氨基酸多序列比對

經(jīng)Blastx比對發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝與長牡蠣、美洲牡蠣、紫貽貝、歐洲扇貝和蝦夷扇貝等的TTLL氨基酸序列具有較高的同源性，其中，馬氏珠母貝與長牡蠣的TTLL氨基酸序列一致性最高，達(dá)72.59%。采用ClustalW軟件對TTLL氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果顯示，TTL結(jié)構(gòu)域序列高度保守(圖3)。

2.4 TTLL系統(tǒng)進(jìn)化樹

在NCBI上查找多個其他物種的TTLL氨基酸序列信息(表2)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示，馬氏珠母貝TTLL與長牡蠣等無脊椎動物的TTLL 聚為一大支, 脊椎動物的 TTLL聚為另外一大支, 這與傳統(tǒng)的分類基本一致。這表明，與馬氏珠母貝TTLL親緣關(guān)系最近的是長牡蠣和美洲牡蠣，其次為紫貽貝、蝦夷扇貝和歐洲扇貝。

表2 馬氏珠母貝與其他物種TTLL氨基酸序列的同源性對比Tab.2 Homology alignment of TTLL amino acid sequence in pearl oyster Pinctada fucata martensii and other species

2.5 TTLL蛋白的高級結(jié)構(gòu)

對馬氏珠母貝和長牡蠣的TTLL蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖5)，結(jié)果顯示，兩者的結(jié)構(gòu)主要是以無規(guī)則卷曲為主，其次是α-螺旋，且在結(jié)構(gòu)上相似度較高，表明馬氏珠母貝TTLL的高級結(jié)構(gòu)保守。

2.6 TTLL基因的表達(dá)模式

qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn):TTLL基因在馬氏珠母貝閉殼肌、足、外套膜、鰓、肝胰腺和性腺中均有表達(dá)(圖6(a))，性腺中的相對表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是鰓；TTLL基因在大規(guī)格貝中的表達(dá)量顯著高于小規(guī)格(P<0.05，圖6(b))；TTLL基因在馬氏珠母貝發(fā)育早期表達(dá)差異較為顯著(P<0.05)，在卵和受精卵中的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育時(shí)期(P<0.05)，伴隨著發(fā)育的進(jìn)行，從原腸胚期到眼點(diǎn)幼蟲期表達(dá)量比較平穩(wěn)(圖6(c))；TTLL基因在雜交家系的表達(dá)量顯著高于近交家系(P<0.05，圖6(d))。

2.7 TTLL基因SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析

在馬氏珠母貝TTLL基因中共發(fā)現(xiàn)277個SNP位點(diǎn)，其中，109個SNP位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。對這些SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳信息分析，結(jié)果表明:Ne為1.001 2～1.986 5，平均值為1.141 9；Ho為0.001 2～0.514 2，平均值為0.108 1；He為0.001 2～0.496 9，平均值為0.104 9；PIC為0.001 2～0.373 3，平均值為0.092 5。PIC是衡量基因變異程度的指標(biāo)，本研究中發(fā)現(xiàn)，6個位點(diǎn)為中度變異多態(tài)(0.25≤PIC≤0.5)，103個位點(diǎn)為低度變異多態(tài)(PIC<0.25)(附表1)。通過Haploview 4.2軟件對TTLL基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7對屬于完全連鎖不平衡(D′=1,R2=1)，655對屬于強(qiáng)連鎖不平衡(0.8≤D′≤1，0.33≤R2≤1)，3 675對屬于弱連鎖不平衡(D′<0.8，R2<0.33)，34對屬于連鎖平衡(D′=0，R2=0)(圖7)。

*表示保守的氨基酸; :表示強(qiáng)相似的氨基酸; .表示弱相似的氨基酸; 紅色方框?yàn)門TL結(jié)構(gòu)域。* indicates the conserved amino acid; : indicates strong similar amino acid; . indicates weak similar amino acid; red box represents the TTL domains.圖3 馬氏珠母貝與其他物種TTLL氨基酸序列的多重序列比對Fig.3 Multiple alignment of TTLL amino acid sequences between the pearl oyster Pinctada fucata martensii and other species

圖4 基于鄰接法構(gòu)建的馬氏珠母貝TTLL系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TTLL amino acid sequences in pearl oyster Pinctada fucata martensii based on Neighbor-Joining

(a) A—閉殼肌，F(xiàn)—足，M—外套膜，Gi—鰓，Go—性腺，He—肝胰臟; (c) E—卵，F(xiàn)e—受精卵，B—囊胚，G—原腸胚，T—擔(dān)輪幼蟲，D—D型幼蟲，EU—早期殼頂幼蟲，EL—眼點(diǎn)幼蟲；(d)A—近交家系(F1♀×F1♂)，B—雜交家系(F1♀×F2♂)，C—雜交家系(F2♀×F1♂)，D—近交家系(F2♀×F2♂)。標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。(a) A—adductor muscle，F(xiàn)—foot，M—mantle，Gi—gill，Go—gonad，He—hepatopancreas; (c) E—egg，F(xiàn)e—fertilized egg，B—blastula，G—gastrula，T—trochophore stage，D—D-shaped larvae，EU—early umbo larvae，EL—eye-spotted larvae；(d)A—inbred family(F1♀×F1♂)，B—hybrid family(F1♀×F2♂)，C—hybrid family(F2♀×F1♂)，D—inbred family(F2♀×F2♂). The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖6 馬氏珠母貝TTLL基因相對表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of relative expression level of TTLL gene in pearl oyster Pinctada fucata martensii

2.8 TTLL基因SNP位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

在馬氏珠母貝TTLL基因外顯子區(qū)域共獲得37個SNP位點(diǎn)，其中，23個SNP位點(diǎn)與生長性狀的相關(guān)性顯著(P<0.05)。對外顯子SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍塊分析，發(fā)現(xiàn) 4個 SNP 位點(diǎn)形成了2個單倍塊(圖8)、5種單倍型(表3)。結(jié)合生長性狀分析發(fā)現(xiàn):Block1中單倍型 TG的殼長、殼高均顯著高于單倍型CA(P<0.05)，與單倍型TA無顯著性差異(P>0.05)；Block2中單倍型GG為優(yōu)異單倍型，其殼長、殼寬、殼高、殼質(zhì)量和總質(zhì)量均顯著高于單倍型AA(P<0.05)(表3)。再對TTLL基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個位點(diǎn)(g.7572350 T>G、g.7572368 A>G、g.7572401 T>C、g.7572402 A>G)發(fā)生了錯義突變，3個位點(diǎn)(g.7572405 C>T、g.7572414 T>C、g.7572438 A>T)發(fā)生了同義突變(表4)。結(jié)合表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，3個突變位點(diǎn)與生長性狀顯著相關(guān)(P<0.05)。位點(diǎn)g.7572350 T>G中，基因型GG的殼寬顯著高于基因型GT和TT(P<0.05)，其殼長和殼質(zhì)量也顯著高于基因型TT(P<0.05)；位點(diǎn)g.7572368 A>G中，基因型GG的殼寬顯著高于基因型AA和AG(P<0.05),其殼質(zhì)量和總質(zhì)量也顯著高于基因型AA(P<0.05)；位點(diǎn)g.7572405 C>T中，基因型CT的殼長和殼高顯著高于基因型CC(P<0.05)；而突變位點(diǎn)g.7572401 T>C、g.7572402 A>G、g.7572414 T>C和g.7572438 A>T與生長性狀均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

方框中顏色從白色到紅色，代表連鎖程度從低到高。The colors ranging from white to red represent the degree of linkage from low to high.圖7 馬氏珠母貝TTLL基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析Fig.7 Linkage disequilibrium analysis for the SNPs of TTLL gene in pearl oyster Pinctada fucata martensii

圖8 馬氏珠母貝TTLL基因外顯子區(qū)域SNPs單倍塊分析Fig.8 Haploblock analysis for the SNPs in the exon region of TTLL gene in pearl oyster Pinctada fucata martensii

3 討論

3.1 馬氏珠母貝TTLL基因的序列特征

本試驗(yàn)中，利用RACE技術(shù)成功獲取馬氏珠母貝TTLL基因全長，同時(shí)獲得具有TTLL基因編碼的氨基酸序列的特征基序，這些基序?qū)?yīng)于具有ATP依賴性羧酸胺/硫醇連接酶活性的典型ATP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，說明TTLL可能在軟體動物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[16]。其次，馬氏珠母貝TTLL氨基酸序列無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，無分泌或跨膜蛋白的重要特征；但其氨基酸序列含有2個cAMP與cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、13個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和2個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)等多個磷酸化位點(diǎn)。有研究表明，TTLL蛋白家族可通過磷酸化在多個位點(diǎn)進(jìn)行翻譯后修飾參與調(diào)控細(xì)胞周期，推測馬氏珠母貝TTLL蛋白可能與哺乳動物TTLL蛋白一樣，參與調(diào)控馬氏珠母貝的細(xì)胞周期進(jìn)程[17-19]。本研究表明，馬氏珠母貝與長牡蠣TTLL氨基酸序列的一致性最高, 為 72.59%；進(jìn)化樹分析顯示，馬氏珠母貝與長牡蠣、美洲牡蠣、紫貽貝、歐洲扇貝和蝦夷扇貝的TTLL氨基酸序列聚為一支，說明TTLL在雙殼類動物進(jìn)化過程中相對保守，且其TTL結(jié)構(gòu)域在高級結(jié)構(gòu)上高度保守，這與長牡蠣TTL結(jié)構(gòu)高度相似，進(jìn)一步說明該基因?yàn)門TLL基因。

表3 馬氏珠母貝TTLL基因單倍型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析Tab.3 Correlation analysis of TTLL gene haplotype with growth traits in pearl oyster Pinctada fucata martensii

表4 馬氏珠母貝TTLL基因突變位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析 Tab.4 Correlation analysis of TTLL gene mutation position with growth traits in pearl oyster Pinctada fucata martensii

3.2 TTLL基因的表達(dá)模式

有研究表明，TTLL蛋白參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞分化和有絲分裂等生理過程[5, 7]。本研究中，對TTLL基因的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在馬氏珠母貝外套膜、閉殼肌、性腺、肝胰腺、鰓和足中均有表達(dá)，在性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織，性腺作為軟體動物的生殖器官，推測其可能在馬氏珠母貝生長發(fā)育中擔(dān)任著重要角色。有研究表明，馬氏珠母貝生長性狀候選基因EGFR(Epidermal growth factor receptor)在大規(guī)格個體組中的表達(dá)量顯著高于小規(guī)格個體組[20]，這與本研究中TTLL基因在大規(guī)格馬氏珠母貝中的顯著高表達(dá)一致，說明其對馬氏珠母貝的生長過程具有重要作用。此外，本研究中檢測了不同發(fā)育時(shí)期TTLL基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，TTLL基因在馬氏珠母貝卵細(xì)胞和受精卵中的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育時(shí)期。有研究表明，TTL結(jié)構(gòu)域通過對α-微管蛋白酪氨酸化影響細(xì)胞有絲分裂過程中的微管功能[21-22]，由此推測，TTLL基因可能通過調(diào)控細(xì)胞繁殖或分化過程在馬氏珠母貝生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。本研究中，利用近交和雜交家系材料分析發(fā)現(xiàn)，TTLL基因在馬氏珠母貝雜交家系中顯著高表達(dá)，這與本課題組前期研究馬氏珠母貝生長相關(guān)基因(OSR1、NR5A2、TubB-4B和GPCR-84)在雜交家系中高表達(dá)的結(jié)果一致[8]，進(jìn)一步說明了TTLL在馬氏珠母貝生長方面發(fā)揮重要作用。

3.3 TTLL基因SNP位點(diǎn)分析

SNP為第三代遺傳分子標(biāo)記技術(shù)，由于其具有遺傳穩(wěn)定性好、雙等位基因分型和自動化分型等特性，因此，常用于遺傳育種和圖譜構(gòu)建及性狀關(guān)聯(lián)分析[23-24]。一項(xiàng)基于GWAS的研究發(fā)現(xiàn)，多個與兩種疾病均有顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，尤其是以位于16號染色體的3型β-微管蛋白基因(Tubulin beta 3 class Ⅲ,TUBB3)上的rs4785741位點(diǎn)為主，該基因與神經(jīng)元遷移相關(guān)，是神經(jīng)發(fā)育過程中的重要影響因子[25]。單倍型是若干個決定同一性狀的基因組成的基因型[26]，而單倍型分析在尋找和定位動植物重要性狀方面具有重要作用，目前，大多通過數(shù)學(xué)建模的方式獲得[27]。本研究中，利用 Haploview 4.2 軟件對馬氏珠母貝TTLL基因外顯子區(qū)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示，4個 SNP 位點(diǎn)形成了2個單倍塊、5種單倍型。其中，單倍型GG為優(yōu)異單倍型，其殼長、殼寬、殼高、殼質(zhì)量和總質(zhì)量均顯著高于單倍型AA，說明該單倍型具有作為以各生長性狀為目標(biāo)的遺傳育種標(biāo)記的潛力，這為進(jìn)一步培育馬氏珠母貝的優(yōu)良品種提供了基礎(chǔ)資料。另外，基因外顯子SNPs的突變可能會導(dǎo)致基因編碼的蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)功能的變化及調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響其表型性狀[28-29]。于德財(cái)[30]在研究噪聲敏感人群的全外顯子區(qū)域時(shí)發(fā)現(xiàn)了6個突變位點(diǎn)，其中包括TTLL4 rs3731877，該突變在細(xì)胞的生長、繁殖和分化過程中具有重要作用。本研究中共發(fā)現(xiàn)了4個錯義突變位點(diǎn)和3個同義突變位點(diǎn)，其中，3個突變位點(diǎn)與生長性狀顯著關(guān)聯(lián)。位點(diǎn)g.7572350 T>G和g.7572368 A>G為錯義突變，編碼的氨基酸分別由色氨酸和蛋氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼岷土涟彼?，其基因型GG的殼寬均顯著大于其他兩種基因型。該結(jié)果表明，這兩個位點(diǎn)可能與馬氏珠母貝的生長性狀具有一定聯(lián)系，且等位基因型G可能利于馬氏珠母貝的生長。而位點(diǎn)g.7572405 C>T為同義突變，基因型CT的殼長和殼高均顯著大于基因型CC。雖然同義突變不引起編碼蛋白結(jié)構(gòu)及活性等變化，但可能會影響基因轉(zhuǎn)錄從而影響蛋白功能，如mRNA編碼序列的長度、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，以及tRNA翻譯效率等[31]，由此推測，g.7572405 C>T同義突變可能影響了馬氏珠母貝TTLL基因的表達(dá)效率和翻譯偏好性，進(jìn)而影響蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾，形成不同生物活性的成熟TTLL蛋白，并造成了個體生長性狀上的差異。這些位點(diǎn)基因型的突變對生物體的影響較大，因此，從中篩選出與生長性狀(殼長、殼寬、殼高、殼質(zhì)量或總質(zhì)量)顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，可為馬氏珠母貝選育優(yōu)良新品種提供分子工具和科學(xué)參考。

4 結(jié)論

1)采用RACE技術(shù)，首次從馬氏珠母貝中克隆獲得了TTLL基因cDNA全長序列為1 962 bp。

2)TTLL基因在馬氏珠母貝性腺組織、大規(guī)格群體、卵細(xì)胞、受精卵及雜交家系中顯著高表達(dá)，說明其在馬氏珠母貝生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

3)TTLL基因的優(yōu)異單倍型GG，以及突變位點(diǎn)g.7572350 T>G、g.7572368 A>G和g.7572405 C>T均有利于馬氏珠母貝的生長，該結(jié)果對于選育具優(yōu)良性狀的馬氏珠母貝具有重要實(shí)踐意義。