劉宣宏，周玲潔，蔡春爾,2* ，洪彥杰，邵慧婷，何培民,2

(1.上海海洋大學 海洋生態(tài)與環(huán)境學院，上海 201306； 2.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

自2007年起,中國黃海海域滸苔綠潮連年大量暴發(fā)，江蘇省如東海區(qū)鑒定出附著和漂浮的滸苔屬優(yōu)勢種為滸苔Ulvaprolifera、扁滸苔Ulvacompressa、緣管滸苔Ulvalinza和曲滸苔Ulvaflexuosa[1-2]。其中，緣管滸苔作為綠潮暴發(fā)早期的重要物種，廣泛分布于中國渤海、黃海和東海海域[3]。光合作用對藻類的生長和繁殖至關重要，其反應過程復雜[4]，與溫度、pH及營養(yǎng)鹽等環(huán)境因素密切相關[5-6]，其中，溫度和光照是最主要的制約因素[7]。由于每種綠潮藻的最適溫度和光照不同[8]，黃海漂浮綠潮藻會隨季節(jié)出現(xiàn)演替現(xiàn)象，優(yōu)勢種由扁滸苔、緣管滸苔和曲滸苔逐漸演變?yōu)闈G苔[1-2]。

在不同溫度下，藻類通過調整色素含量和光合色素/光保護色素的比例[9]等一系列機制來調整光合作用。湯文仲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，緣管滸苔光合作用和生長的適宜溫度為 15～25 ℃，當溫度達到5、35 ℃時，緣管滸苔的光化學效率(Fv/Fm)最小。藻體對光照變化也有不同的響應，低光照下藻體光合作用變弱，凈光合效率降低[11]，而高光照時容易造成藻體光抑制[12]，且隨高光照處理時間延長，緣管滸苔的Fv/Fm值逐漸降低[13]。當緣管滸苔短期處于低光照下，其葉綠素含量顯著高于高、中光照下的含量，但凈光合作用速率在低光照下顯著降低[14]。6、7月黃海地區(qū)雨天光照低于30 μmol/(m2·s)，晴天時高于300 μmol/(m2·s)，當光照度為18 μmol/(m2·s)時緣管滸苔的Fv/Fm值更小[10]。

應用組學技術研究藻體，可以了解滸苔屬對環(huán)境的響應。Liu等[15]證明了滸苔的碳固定途徑，除了典型的C3循環(huán)外，還涉及C4循環(huán)及CO2濃縮機制。許建方等[16]研究發(fā)現(xiàn), 丙酮酸磷酸雙激酶活性的升高會使C4代謝途徑功能加強，提升了緣管滸苔耐受高鹽度、低鹽度脅迫的能力。Fan等[17]通過分析養(yǎng)分轉運蛋白在不同溫度和營養(yǎng)物濃度下的基因表達情況，對緣管滸苔的環(huán)境廣適應性進行了解釋。利用轉錄組學研究基因表達量隨環(huán)境條件的改變，短期效應更明顯。Guan等[18]通過強光和干旱的急性脅迫研究發(fā)現(xiàn)，緣管滸苔的光捕獲復合體蛋白基因ElipL1、ElipL2、Cbrx和OHP具有一定的光保護作用，LHCSR、Elip-like1和Elip-like2等蛋白基因也參與緣管滸苔的光保護機制[19-20]。因此，研究緣管滸苔不同光照和溫度作用下光合作用的基因表達情況，對于進一步了解光合作用機制具有重要意義。本研究中，利用轉錄組學測序技術，從光合作用的角度分析了緣管滸苔對環(huán)境光照和溫度變化的短期響應，以期為分析綠潮藻演替機制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用緣管滸苔于2008 年7月采自山東青島膠州灣海區(qū)。鑒種后, 在實驗室內20 ℃、100 μmol/(m2·s)最適條件[1]下進行純種傳代培養(yǎng), 光照周期(D∶L)為 12∶12，采用VSE培養(yǎng)液，每隔7 d更換一次培養(yǎng)液。在該條件下長期培養(yǎng)理論上不會對藻體的生理響應產(chǎn)生馴化。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗設置30 ℃(高溫)、20 ℃(最適溫度，對照)和4 ℃(低溫)3個溫度組，在每個溫度下設置400 μmol/(m2·s)(高光照)、100 μmol/(m2·s)(最適光照，對照)和20 μmol/(m2·s)(低光照)3個光照度(表1)。將藻體分為9組，每組設置3個生物學重復，每個重復組取10根同一批放散后生長的緣管滸苔藻體(長度為5 cm，鮮質量為0.02 g)，光照周期不變，同時處理24 h。

表1 緣管滸苔溫度、光照試驗設計Tab.1 Experimental design of effects of temperature and light intensity on green alga Ulva linza

1.2.2 光合作用參數(shù)測定 采用PHYTO-PAM熒光分析儀(Walz，德國)測定葉綠素熒光參數(shù)。以最適溫度和最適光照為對照組，每組設置3個平行試驗，處理24 h后取樣，暗適應20 min后測定光合誘導曲線，并記錄最大光化學效率等參數(shù)。

1.2.3 總RNA提取及轉錄組測序 取不同光照和溫度處理24 h后的藻體,經(jīng)液氮處理后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎蒙ど锕こ?上海)股份有限公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。采用紫外分光光度法檢測其濃度和含量，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性。檢測合格的藻體總RNA送至華大基因公司進行文庫構建和測序。采用磁珠法富集樣品mRNA，經(jīng)反轉錄后合成雙鏈cDNA，純化后進行末端修復、接頭連接，經(jīng)過產(chǎn)物純化和片段大小分選，最終PCR擴增獲得文庫，并在Illumina HiSeqTM2000平臺上完成RNA-Seq測序分析。

1.2.4 組裝及功能注釋 通過Trinity軟件對篩選后的clean reads進行組裝得到Unigene序列。隨后將Unigene序列與外源蛋白數(shù)據(jù)庫NR、GO、SwissProt、KEGG和InterPro進行Blastx比對(E-value<0.000 01)，根據(jù)比對結果獲得Unigene的蛋白功能注釋信息。

1.2.5 生物信息學分析 采用FPKM法計算Unigene表達量。根據(jù)P<0.05且|log2(FoldChange)| ≥1篩選得到顯著表達的Unigene。通過基因注釋進一步篩選得到光合作用不同階段起重要作用的Unigene基因，使用NCBI Blast+(http://bioinformatics. psb.ugent.be/blast/moderated/?project=orcae_Ulvmu)將每條基因與易變石莼Ulvamutabilis基因組進行比對[21]，總體認為比對率為70%以上的基因與滸苔具有同源性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比較，使用GraphPad Prism等軟件繪制圖表。顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 藻體的光合特征

從圖1可見：在不同光照下，緣管滸苔受低溫(4 ℃)影響時，F(xiàn)v/Fm值均顯著降低(P<0.05)；在最適溫度(20 ℃)下，光照對藻體Fv/Fm的影響不顯著(P>0.05)，僅高光照下略有影響；在高溫/低溫與光照的協(xié)同作用下，高光照下藻體Fv/Fm值均顯著低于低光照(P<0.05)，且低溫低光照下藻體Fv/Fm值顯著高于單一低溫。由此推測，溫度和光照對緣管滸苔的交互作用影響大于單一因素，低光照緩解了低溫對藻體的脅迫。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖1 不同處理下緣管滸苔的光化學效率Fig.1 Photochemical efficiency of green alga Ulva linza under different treatments

2.2 差異表達基因分析

通過Illumina HiSeqTM2000平臺測序，總計產(chǎn)出42 984 321 300 nt數(shù)據(jù)。組裝的總Unigene有101 056個，總長209 052 506 nt，平均長度2 069 nt，N50達到3 489 nt。Unigene功能注釋得到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO庫的Unigene數(shù)量分別為60 840、11 036、42 042、45 915、 9 915 和26 451，去除重復后總計為61 580個。根據(jù)差異表達分析，不同處理下差異表達的基因數(shù)量如表2所示，緣管滸苔在單一的溫度處理(Y2、Y8)后產(chǎn)生的差異表達基因數(shù)量大于單一光照(Y4、Y6)處理后。在溫度和光照的交互影響下，高溫高光照(Y1)和低溫低光照(Y9)處理組顯著差異表達的基因數(shù)量較多。

表2 所有基因表達差異比較結果Tab.2 Comparison of all differentially expressed genes

2.3 低溫低光照(Y9)處理下特異表達的基因

相比其他處理條件，緣管滸苔在響應低溫與低光照的短期作用時有104個Unigene特異高表達(其他情況下這些Unigene的FPKM幾乎為0)，其中，有36個Unigene特異基因可以注釋到KEGG圖上(表3)，這些基因在應對溫度或光照的單一脅迫時其表達量無顯著性變化，且涉及翻譯過程的核糖體、RNA轉運、氨基酸代謝、運輸過程的吞噬體及有防御功能的細胞壁蛋白。通過Uniport對這36個特異表達基因進行定位查詢，發(fā)現(xiàn)40S核糖體蛋白S24-1、S8-1及60S核糖體蛋白L12-1這3個基因位于葉綠體中。

2.4 捕光色素蛋白基因

光合作用初期，天線色素分子吸收和傳遞光能。本研究中，捕光色素蛋白復合物基因表達量在不同溫度和光照條件下表現(xiàn)出較大差異，結果如表4所示。與光系統(tǒng) Ⅰ(SPⅠ)相比，光系統(tǒng) Ⅱ(SPⅡ)的捕光色素蛋白受外界影響較小，捕光色素蛋白基因Lhcb6和Lhcb7在各處理條件下均未發(fā)生顯著變化。捕光色素蛋白對單一溫度處理(Y2/Y8)的響應大于單一光照處理(Y4/Y6)的響應；在低溫條件下(Y7/Y8/Y9)，捕光色素蛋白受低光照影響，低光照(Y9)處理組差異基因除Lhca1和Lhca2外，其他基因的變化趨勢與低光照(Y7)和中光照(Y8)處理組相反，藻體受低溫和低光照協(xié)同作用時，上調捕光色素蛋白可能用來抵御脅迫。

2.5 電子傳遞鏈相關基因

電子傳遞鏈是光合作用形成同化力的核心環(huán)節(jié)。本研究中，緣管滸苔的電子傳遞鏈相關基因響應較小，結果如表5所示。低溫中光照(Y8)和低溫低光照(Y9)處理組部分基因呈現(xiàn)上調趨勢，其中，低溫低光照(Y9)處理組差異表達基因的表達趨勢與捕光色素一致，捕獲的光能需要更多的載體進行傳遞。除此之外，還發(fā)現(xiàn)D1蛋白基因的表達量在高溫高光照(Y1)、低溫中光照(Y8)和低溫低光照(Y9)處理組發(fā)生顯著上調(P<0.05)。由此推測,在高溫高光照條件下，緣管滸苔啟動了SPⅡ中D1蛋白的可逆失活來耗散多余的能量，而在低溫中光照和低溫低光照條件下D1蛋白上調，可能是由于較低溫度下酶活性不高，藻體通過提高表達量來應對低溫環(huán)境。

表3 低溫低光照處理下特異表達的UnigenesTab.3 Unigenes specifically expressed under low temperature and low light interactions

2.6 光合碳同化相關酶基因

光合固碳C3和C4途徑的相關基因檢測結果如表6所示。不同處理條件下藻體的碳同化能力受到不同程度的影響，適溫(Y4/Y6)條件下，碳同化相關酶基因表達情況受光照影響較小，緣管滸苔固碳反應受溫度的影響大于光照；高溫高光照(Y1)處理下，C3和C4途徑差異表達基因均顯著下調(P<0.05)；低溫(Y7/Y8/Y9)條件下,藻體C3和C4途徑的CO2受體再生階段酶的基因均顯著下調(P<0.05)。

表4 不同溫度和光照條件下捕光色素蛋白基因相對表達量的變化Tab.4 Relative expression level of genes related to light harvesting pigment protein under different temperature and light intensities

表5 不同溫度和光照條件下電子傳遞鏈相關基因相對表達量的變化Tab.5 Relative expression level of genes related to electron transport chain under different temperature and light intensities

表6 不同溫度和光照條件下光合碳同化相關酶基因相對表達量的變化Tab.6 Relative expression level of genes related to photosynthetic carbon assimilation under different temperature and light intensities

3 討論

3.1 緣管滸苔的演替

大量微觀繁殖體在春末海區(qū)溫度回升時迅速萌發(fā)，在漂移過程中，隨著溫度和光照升高緣管滸苔逐漸消失[22]。王藝等[22]通過對綠潮發(fā)生過程進行全程監(jiān)視，于2015年3—6月在江蘇如東海區(qū)發(fā)現(xiàn)了緣管滸苔繁殖體。宋偉[23]通過對蘇北淺灘紫菜養(yǎng)殖筏架上的定生綠藻進行連續(xù)跟蹤，于2012年7月在青島海域漂浮藻中發(fā)現(xiàn)緣管滸苔，而華梁等[24]于2012和2013年的8月在江蘇紫菜筏架區(qū)綠潮藻中并未鑒定到緣管滸苔，這表明隨著海水溫度升高和綠潮藻群逐漸向北漂移，緣管滸苔逐漸消失，優(yōu)勢種逐漸由扁滸苔、緣管滸苔和滸苔演替成主要由滸苔構成的漂浮綠潮藻種群[25]。本研究中，通過24 h短期溫度與光照處理，分析了緣管滸苔在適應環(huán)境變化時對光合作用的響應，根據(jù)結果推測，冬季溫度較低時，藻體上調部分捕光色素蛋白基因和電子傳遞鏈基因的表達，但光合固碳反應的CO2受體再生階段受到抑制，生長緩慢；夏季隨著溫度升高，藻體下調C3和C4途徑的基因表達，抑制光合固碳反應來適應白天高光照環(huán)境。

3.2 藻體光合特性

光化學效率是研究環(huán)境對藻體光合作用效應的重要指標，常被用來表征植物被脅迫下的光系統(tǒng)變化。短期的高光照條件會引起滸苔光合能力下降。付倩倩等[14]在短期高光照(400 μmol/(m2·s))處理緣管滸苔后，其Fv/Fm值低于中光照(200 μmol/(m2·s))、低光照(90 μmol/(m2·s))處理。張珺等[26]用高光照(400 μmol/(m2·s))處理滸苔第3天后，其Fv/Fm值和實際光化學量子效率顯著低于其他光照(40～160 μmol/(m2·s))處理。本研究中發(fā)現(xiàn)，緣管滸苔在單一高光照 (400 μmol/(m2·s))短期(24 h)處理后，其Fv/Fm值略有下降，但在高溫(30 ℃)或低溫(4 ℃)的協(xié)同作用下，F(xiàn)v/Fm值顯著下降，且藻體的差異表達基因數(shù)量也增多；在高溫與高光照協(xié)同作用下，藻體光合固碳、電子傳遞和補光色素蛋白相關基因大量差異表達，其中光合固碳基因的表達均顯著下調，這表明，緣管滸苔對溫度和光照的協(xié)同作用響應更大。Jiang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高光照 (400 μmol/(m2·s))處理5 d，可以緩解高溫(30 ℃)對滸苔生理參數(shù)的抑制作用，但本研究結果與之相反，這可能是本研究中緣管滸苔高光照下未能在短期內緩解受到的高溫脅迫，而在較高光照下長期培養(yǎng)后，對溫度的耐受性會增加，表現(xiàn)出一定的適應性。

3.3 低溫低光照下緣管滸苔的響應分析

低溫低光照條件是藻類越冬及復蘇經(jīng)歷的極端環(huán)境條件。劉峰[28]研究發(fā)現(xiàn)，綠潮藻顯微繁殖體在低溫環(huán)境中可以存活3～4個月；同時Schories[29]研究認為，越冬孢子是綠潮藻顯微繁殖體的重要來源，其能在黑暗條件下存活至少10個月。在大型海藻的液體保存法中，低溫低光照也是一種實用的種質保存方法[30]。本研究中發(fā)現(xiàn)，緣管滸苔在短期(24 h)的低溫低光照處理下已經(jīng)產(chǎn)生了較強的適應性。相較于單一低溫條件，低溫低光照處理下的藻體Fv/Fm值反而顯著增加(圖1)，低光照提高了緣管滸苔對低溫的耐受性。此外，差異表達的捕光色素蛋白和電子傳遞鏈相關基因在低溫低光照下表達量均顯著上調，這可能是由于低光照誘導植物產(chǎn)生了更多的光合色素[11,31]，捕獲更多的光能，低溫和低光照協(xié)同作用時藻體通過儲藏更多的能量抵御脅迫。值得注意的是，藻體在低溫低光照下特異高表達大量基因(表3)，其中，S24-1、S8-1和L12-1 3種位于葉綠體上的核糖體蛋白基因表達極顯著上調(P<0.01且|log2(FoldChange)|>2)，推測這些蛋白可能參與修飾光合作用中大量上調的基因，從而使低溫低光照條件下的光合作用參數(shù)Fv/Fm值高于低溫高光照和低溫中光照處理。由此可見，低溫和低光照協(xié)同作用下，緣管滸苔存在特殊的適應機制。

4 結論

1)低溫低光照下，緣管滸苔上調捕光色素蛋白和電子傳遞鏈相關基因，并特異表達部分葉綠體基因，說明藻體在冬季極端環(huán)境下具有特殊適應機制。

2)高溫高光照下，藻體光合固碳作用被全面抑制，推測緣管滸苔不適應夏季極端環(huán)境。

3)溫度和光照的交互影響下，藻體的光合作用參數(shù)和基因表達情況均異于單一條件下，說明溫度和光照對藻體具有協(xié)同作用。