黃華，于廣磊，王力勇，高雁，張嵐，孫佰鳴，莊焱文，王鶴*

(1.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264006；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006)

大菱鲆Scophthalmusmaximus俗稱多寶魚，是中國北方地區(qū)鲆鰈類的主要養(yǎng)殖品種。近年來，隨著養(yǎng)殖集約化、規(guī)?；牟粩喟l(fā)展，以及種質(zhì)資源的退化，養(yǎng)殖大菱鲆病害頻發(fā)，限制了該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。細菌性疾病在大菱鲆養(yǎng)殖過程中發(fā)生的頻次最高，其中殺魚愛德華氏菌Edwardsiellapiscicida是大菱鲆養(yǎng)殖中的主要細菌病原之一[2]。

殺魚愛德華氏菌分布范圍廣，在世界許多國家和地區(qū)均有報道，該菌生存能力強，在溫度為10～45 ℃條件下都能生長，最適于溫度為28～37 ℃、pH中性的環(huán)境中生長[3]。殺魚愛德華氏菌可感染魚類的種類較多，能導(dǎo)致羅非魚Oreochomisniloticus、斑馬魚Daniorerio、大菱鲆、大嘴鱸魚Micropterussalmiodes、鰻鱺Anguillajaponica等多種魚類患腹水病、出血性敗血癥等[4]，而大菱鲆對該菌易感性較高且不分季節(jié)性，不同月齡個體均能被感染，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)殺魚愛德華氏菌攜帶與感染密切相關(guān)的多種毒力因子，如用于黏附在宿主細胞上的菌毛蛋白編碼基因(fimA和fliC)、效應(yīng)蛋白基因(eseJ)、過氧化氫酶基因(katB和katG)、超氧化物歧化酶基因(SodB和SodC)等[2-3]。關(guān)于殺魚愛德華氏菌耐藥菌株的研究，毛燦等[5]分析了花鱸源殺魚愛德華氏菌耐藥譜與毒力的相關(guān)性，但國內(nèi)尚未見關(guān)于殺魚愛德華氏菌耐藥菌株、耐藥基因的研究。殺魚愛德華氏菌是從遲緩愛德華氏菌中分出的致病性更強的菌株，與遲緩愛德華氏菌表型特征有很多相同之處，目前，仍有一些菌株被誤歸為遲緩愛德華氏菌[5]。對殺魚愛德華氏菌的鑒定，除用傳統(tǒng)的生理生化方法外，還有通過測定16S rRNA、gyrB基因全序列同源性比對[5]及合成該菌特異性引物EP進行PCR檢測[6]等方法的研究報道。

2019年，山東省煙臺市某海水養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖大菱鲆出現(xiàn)攝食能力減弱、行動遲緩的癥狀，發(fā)病魚體腹部膨大，吻部、鰭條及鰭基部充血發(fā)紅，眼睛紅腫突出，上頜紅腫。車間患該癥狀大菱鲆約占養(yǎng)殖總量的4%，10 d內(nèi)患病個體死亡率為70%。本研究中，對患病大菱鲆進行了細菌分離，從具有典型癥狀病魚的肝臟、脾臟、腎臟和心臟等組織中分離到1株致病力較強的菌株，對其進行了形態(tài)學(xué)觀察，生理生化性狀分析，16S rRNA、gyrB和rpoB基因序列比對，愛德華氏菌特異性引物擴增，以及毒力基因和耐藥性分析，以期為該病的致病機理研究及有效防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚：患病大菱鲆采自山東省煙臺市某海水養(yǎng)殖公司，體長為(27±2) cm，體質(zhì)量為(350±5) g；用于回感試驗的健康大菱鲆，體長為(28±1) cm，體質(zhì)量為(380±5) g，于曝氣人工海水中暫養(yǎng)7 d，每天虹吸換水30%，暫養(yǎng)期間水溫控制在(17±1) ℃。

主要試劑：腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHIA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、MH培養(yǎng)基(Muller Hinton)、沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基(SS)和革蘭氏染色試劑盒均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生理生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR擴增相關(guān)試劑均購自寶生物(大連)有限公司；試驗用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原篩查和細菌分離 選取患病大菱鲆，用體積分數(shù)為75%的乙醇棉球?qū)w表進行消毒，無菌條件下解剖，取其肝臟、腎臟、脾臟和心臟，用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后充分研磨，用無菌環(huán)蘸取研磨組織勻漿液于BHIA平板上劃線分離，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果。選取優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，將體積分數(shù)為20%的甘油-NB菌懸液于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腹腔注射人工感染 選取從腹水病癥典型的患病大菱鲆中分離的菌株H4-S18，接種于BHIA培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，采用pH 7.4 的滅菌PBS制成濃度為7.8×1010、7.8×109、7.8×108、7.8×107CFU/mL的菌懸液備用。選擇與患病大菱鲆個體質(zhì)量相近的健康個體50尾，在實驗室中暫養(yǎng)一周后，隨機分成5組，每組10尾，4個試驗組每尾腹腔注射0.1 mL的菌懸液，對照組每尾腹腔注射0.1 mL的滅菌PBS緩沖溶液。試驗養(yǎng)殖水箱保持充氣，溫度控制在(17±1) ℃，每天虹吸換水20%。感染期間不投喂，每天記錄魚的發(fā)病和死亡情況。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察 將菌株H4-S18分別接種于BHIA和SS培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 生理生化鑒定 選取純化后致病力較強的菌株H4-S18制成菌懸液，用革蘭氏染色法對菌株染色觀察，初步判斷細菌種類與形態(tài)特征；應(yīng)用生理生化鑒定試劑盒檢測菌株的生理生化特性，進一步判斷細菌種屬。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定 應(yīng)用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rRNA、gyrB和rpoB測序，引物序列見表1。將目標菌株的16S rRNA、gyrB和rpoB擴增序列通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST同源性分析，采用MEGA 6.0軟件進行序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence used in the experiment

1.2.6 菌株H4-S18的愛德華氏菌種特異性引物檢測 取純化后的優(yōu)勢菌落接種于新鮮的NB培養(yǎng)基中，32 ℃下以140 r/min振蕩培養(yǎng) 20 h。取1 mL菌液，按照細菌全基因組DNA抽提試劑盒操作說明書提取DNA，用于特異性引物檢測。參考文獻[10]中的方法，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成愛德華氏菌屬內(nèi)種特異性引物，用于對 H4-S18的種鑒別。各種特異性引物分別為遲緩愛德華氏菌E.tarda(ET)、殺魚愛德華氏菌(EP)、鮰愛德華氏菌E.ictaluri(ESC)和類殺魚愛德華氏菌E.piscicida-like(EPL)[10](表2)。PCR擴增條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性15 s，58 ℃下退火15 s，72 ℃下延伸15 s，共進行35個循環(huán)；72 ℃下終延伸5 min[10]。PCR擴增后用15 g/L瓊脂糖電泳檢測，并用紫外凝膠成像拍照。

1.2.7 菌株H4-S18的致病基因檢測 檢測菌株H4-S18侵襲相關(guān)的菌毛基因fimA、fimB、fimC、fimD和毒力相關(guān)基因esrB、mukF、katB、sodB、citC和gadB的攜帶情況，各致病基因引物見表3，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR擴增后用15 g/L瓊脂糖電泳檢測，并用紫外凝膠成像拍照。

表3 致病基因引物序列Tab.3 Primer sequence of virulence pathogenic genes

1.2.8 菌株H4-S18的耐藥性檢測 按照美國臨床檢驗標準委員會(CLSI)推薦的K-B藥敏紙片擴散法操作標準，檢測菌株H4-S18對23種抗菌藥物的敏感性，按照CLSI標準對結(jié)果進行判定。

檢測菌株H4-S18的β-內(nèi)酰胺類TEM基因、氨基糖苷類ant(3″)-Ⅰ基因、喹諾酮類oqxA基因、磺胺類Sul2與Sul3基因、四環(huán)素類tet(A)基因和多肽類mcr-1基因等7種耐藥基因攜帶情況，耐藥基因引物序列見表4，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR擴增后用15 g/L瓊脂糖電泳檢測，并用紫外凝膠成像拍照。

表4 耐藥基因引物序列Tab.4 Primer sequence of drug resistance gene

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖觀察

選取腹部膨大，肛門紅腫突出，吻部、鰭條及鰭基部充血發(fā)紅，眼睛紅腫突出，上頜紅腫等典型癥狀的患病魚進行解剖。剖檢可見腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，腸腫大、腸壁薄，內(nèi)有淡黃色液體或黃便，肝充血發(fā)紅，脾腫大等癥狀(圖1)。

2.2 人工感染試驗

將病原菌分離純化，獲得1株優(yōu)勢菌，命名為H4-S18，用該菌株腹腔注射健康大菱鲆，注射后隨感染時間延長，試驗魚伏于池底、反應(yīng)遲緩，受強烈刺激后反應(yīng)劇烈，出現(xiàn)無方向性竄游甚至撞壁現(xiàn)象。最高濃度組(7.8×1010CFU/mL)第8天時開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病大菱鲆腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，腸內(nèi)有白便，腸壁充血；感染第9天時，死亡大菱鲆出現(xiàn)腹部膨脹、肛門紅腫、鰭條基部充血發(fā)紅等典型癥狀，解剖可見腸壁膨大充血發(fā)紅且內(nèi)有透明液體；感染第11天時，大菱鲆眼睛紅腫突出，鰭條充血發(fā)紅，注射點紅腫呈肉芽狀糜爛，肝充血發(fā)紅(圖2)。從人工感染發(fā)病死亡魚體分離的菌株，菌體形態(tài)、生理生化鑒定和菌毛基因均與菌株H4-S18相同，這表明，菌株H4-S18可引起健康大菱鲆發(fā)病并出現(xiàn)自然發(fā)病癥狀。采用改良寇氏法計算菌株H4-S18對大菱鲆的半致死濃度LD50為1.2×108CFU/mL。

A—鰭條充血發(fā)紅；B—腹脹；C—肝臟出血；D—脾臟腫大。A—red and congested fins; B—abdominal distension; C—liver hemorrhage; D—spleen enlargement.圖1 自然發(fā)病大菱鲆主要癥狀Fig.1 Main symptoms of naturally diseased turbot

A—鰭條充血發(fā)紅；B—上頜紅腫充血、眼球突出；C—腸道膨大；D—肝臟出血；E—脾臟腫大。A—red and congested fins; B—maxillary swelling and ulceration and exophthalmos; C—intestinal expansion; D—liver hemorrhage; E—spleen enlargement.圖2 人工感染發(fā)病大菱鲆主要癥狀Fig.2 Main symptoms of artificially infected turbot

最高濃度組(7.8×1010CFU/mL)注射后第8天時開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰期在第11～14天，第14天時全部死亡；次高濃度組(7.8×109CFU/mL)第11天時開始出現(xiàn)死亡，第14天時累計死亡率為60%，之后無死亡；對照組整個試驗過程中無死亡(圖3)。

圖3 回歸感染累計死亡曲線Fig.3 Accumulative death number of turbot experimentally infected with Edwardsiella piscicida

2.3 菌株H4-S18的鑒定

2.3.1 菌落和菌體形態(tài) 菌株H4-S18在BHIA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h(32 ℃)，形成圓形、光滑、溫潤、微隆起、邊緣整齊透明、中間乳白色及直徑為0.2～0.5 mm的小菌落(圖4A)；在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色小菌落(圖4B)；菌體呈短桿狀，無夾饃，不形成芽孢，革蘭氏染色呈紅色，屬革蘭氏陰性菌(圖4C)。

A—BHIA培養(yǎng)基菌落形態(tài)；B—SS瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)；C—革蘭氏染色顯微觀察；a—圖A箭頭處放大；b—圖B箭頭處放大；c—圖C箭頭處放大。A—isolation and culture with BHIA; B—culture with SS agar medium; C—observation with microscope; a—magnification of partial A; b—magnification of partial B; c—magnification of partial C.圖4 菌株H4-S18的菌落形態(tài)及革蘭氏染色形態(tài)Fig.4 Colony morphology and micro-morphology of strain H4-S18 stained by Gram

2.3.2 生理生化鑒定 生理生化反應(yīng)顯示：賴氨酸、鳥氨酸、葡萄糖產(chǎn)酸、甲基紅和SS瓊脂等呈陽性；枸櫞酸、精氨酸、苯丙氨酸、蔗糖、蜜二糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、苦杏仁苷、半乳糖苷、尿素、硝酸鹽還原和氧化酶等呈陰性(表5)。

2.3.3 菌株H4-S18的系統(tǒng)進化分析 提取分離菌株的DNA后，用不同引物進行PCR擴增和測序，分別得到了1 500 bp(16S rRNA)、950 bp(rpoB)和1 200 bp(gyrB)的基因片段(圖5)，純化回收PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程(上海)有限公司測序。將菌株H4-S18的16S rRNA序列進行BLAST比對，一致性為99%的有殺魚愛德華氏菌、遲緩愛德華氏菌。

表5 菌株H4-S18的生化特性Tab.5 Biochemical identification of strain H4-S18

為進一步確定其分類地位，采用16S rRNA基因測序與gyrB、rpoB管家基因序列分析相結(jié)合的方法進行致病菌H4-S18的系統(tǒng)進化分析(圖6～圖8)，將測序結(jié)果與GenBank中已知核苷酸序列進行BLAST比對，結(jié)果顯示，菌株H4-S18的16S rRNA基因序列與殺魚愛德華氏菌ET883(NR_125649.1)、SNU1(MN_203719)和SS 01(KC_309472)的一致性分別為99.90%、99.65%和99.65%；菌株H4-S18的gyrB基因序列與殺魚愛德華氏菌WFE(MG_225486.1)的一致性達99.83%；菌株H4-S18的rpoB基因序列與殺魚愛德華氏菌ETW41(CP_019440.1)的一致性達99.58%。在16S rRNA、gyrB和rpoB3個基因系統(tǒng)進化樹中，菌株H4-S18均與E.piscicida首先聚在一起，表明其親緣關(guān)系最近。

1—rpoB 基因；2—gyrB基因；M—DNA分子標準質(zhì)量。1—rpoB gene；2—gyrB gene；M—DNA marker.圖5 菌株H4-S18管家基因PCR檢測結(jié)果Fig.5 PCR products of the housekeeping genes from the isolated strain H4-S18

圖6 菌株H4-S18的16S rRNA基因序列與近源菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain H4-S18 based on 16S rRNA gene sequence and its relatives

圖7 菌株H4-S18的gyrB基因系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain H4-S18 based on gyrB gene sequences

圖8 菌株H4-S18的rpoB基因系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain H4-S18 based on rpoB gene sequences

2.3.4 菌株H4-S18經(jīng)愛德華氏菌種特異性引物的PCR檢測 選用遲緩愛德華氏菌、殺魚愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌和類殺魚愛德華氏菌種特異性引物，對菌株H4-S18進行特異性PCR鑒定，結(jié)果顯示，用殺魚愛德華氏菌EP特異性引物擴增出大小為130 bp的特異性條帶，而其他3種引物均未擴增出特異性條帶(圖9)。結(jié)果證實本次分離的菌株H4-S18為殺魚愛德華氏菌。

M—DNA分子標準質(zhì)量; 1—遲緩愛德華氏菌引物；2—殺魚愛德華氏菌引物；3—鮰愛德華氏菌引物；4—類殺魚愛德華氏菌引物。M—DNA marker; 1—primer of E.tarada; 2—primer of E.piscicida; 3—primer of E.ictaluri; 4—primer of E.piscicida-like.圖9 種特異性引物對菌株H4-S18的鑒別Fig.9 Identification of strain H4-S18 by species-specific primers

2.4 菌株H4-S18的致病基因檢測

對分離菌株H4-S18的致病基因進行了檢測，結(jié)果顯示，H4-S18的菌毛基因fimA、fimB、fimC和fimD，以及毒力基因esrB、mukF、katB、sodB、citC和gadB均為陽性(圖10)。

2.5 菌株H4-S18的耐藥性檢測

菌株H4-S18對10類23種測試抗生素的敏感性存在差異，對磺胺類2種、多肽類2種和利福霉素類1種在內(nèi)的5種抗生素類藥物耐藥；對β-內(nèi)酰胺類5種、氨基糖苷類3種、喹諾酮類5種、四環(huán)素類2種、大環(huán)內(nèi)酯類1種、氯霉素類1種、呋喃類1種在內(nèi)的18種抗生素敏感(表6)。

1—fimA基因；2—fimC基因；3—esrB基因；4—mukF基因；5—katB基因；6—fimD基因；7—sodB基因；8—citC基因；9—gadB基因；10—fimB基因；M—DNA分子質(zhì)量標準。1— fimA gene; 2—fimC gene; 3—esrB gene;4—mukF gene;5—katB gene; 6—fimD gene; 7—sodB gene; 8—citC gene; 9—gadB gene; 10—fimB gene; M—DNA marker.圖10 菌株H4-S18毒力基因PCR檢測結(jié)果Fig.10 PCR products of the virulence-related genes from the isolated strain H4-S18

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，檢測到菌株H4-S18攜帶β-內(nèi)酰胺類TEM、氨基糖苷類ant(3″)-Ⅰ、磺胺類tet(A)、四環(huán)素類mcr-1和喹諾酮類Sul2等5種耐藥基因(圖11)。

3 討論

3.1 殺魚愛德華氏菌的鑒定

愛德華氏菌是一種危害嚴重的人魚共患傳染病病原，傳統(tǒng)上分為遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌和?？茞鄣氯A氏菌3個種[19]，其中，遲緩愛德華氏菌的感染宿主和分布范圍最廣，能引發(fā)人類嚴重的腦膜炎、敗血癥、腸胃炎和傷口感染等[20]，并可導(dǎo)致水產(chǎn)動物全身細菌性敗血癥[21]。2012年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌有兩個不同毒力的基因型EdwGⅠ型和EdwGⅡ型[22]；2013年，Abayneh等[23]根據(jù)表型和遺傳表征不同進行重新分類，將致病性更強的EdwGⅠ型劃為新種，命名為殺魚愛德華氏菌，與遲緩愛德華氏菌同屬于愛德華氏菌屬；2016年，Ucko等[24]根據(jù)序列差異又將殺魚愛德華氏菌分為殺魚愛德華氏菌和類殺魚愛德華氏菌兩個種。

表6 菌株H4-S18對10類23種抗生素的敏感性(n=4)Tab.6 Sensitivity of strain H4-S18 to 23 kinds of antimicrobial drugs(n=4)

本研究中，患病大菱鲆出現(xiàn)了全身出血等敗血癥現(xiàn)象，通過傳統(tǒng)的生理生化鑒定，結(jié)果與愛德華氏菌屬相似，其中，枸櫞酸反應(yīng)為陰性。前期研究發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌和殺魚愛德華氏菌的枸櫞酸反應(yīng)多為陰性，而類殺魚愛德華氏菌的枸櫞酸反應(yīng)多為陽性。初步判定分離菌株H4-S18不是類殺魚愛德華氏菌。為更準確地鑒定H4-S18的種類，本研究中運用Weisburg等[7]設(shè)計的16S rRNA序列分析比對，發(fā)現(xiàn)該菌與殺魚愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌、類殺魚愛德華及遲緩愛德華氏菌等的一致性均在99%以上，無法準確鑒定到種，研究結(jié)果與前人一致[1]，愛德華氏菌屬內(nèi)的遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌、殺魚愛德華氏菌和類殺魚愛德華氏菌的16S～23S rRNA區(qū)間基因序列有99%的相似率，僅通過16S rRNA基因序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，僅能鑒定到愛德華氏菌屬，并不能鑒定到種[1]。

M—DNA分子質(zhì)量標準；1—TEM基因；2—tet(A)基因；3—mcr-1基因；4—ant(3″)-Ⅰ基因；5—Sul3基因；6—oqxA基因；7—Sul2基因。M—DNA marker, 1—TEM gene; 2—tet(A) gene; 3—mcr-1 gene;4—ant(3″)-Ⅰgene;5—Sul3 gene; 6—oqxA gene; 7—Sul2 gene.圖11 菌株H4-S18耐藥力基因PCR檢測結(jié)果Fig.11 PCR products of the drug resistance genes from the isolated strain H4-S18

Soler[25]研究發(fā)現(xiàn), 管家gyrB基因表達水平高于16S rRNA基因，不易在水平間轉(zhuǎn)移，而毛燦等[5]用gyrB基因進行了殺魚愛德華氏菌鑒定。本研究中，根據(jù)Pridgeon等[8]、Yamamoto等[9]的方法，PCR擴增得到950 bp(rpoB)和1 200 bp(gyrB)的基因片段，序列比對發(fā)現(xiàn)，菌株H4-S18的gyrB基因序列與殺魚愛德華氏菌WFE(MG_225486.1)的一致性為99.83%,菌株H4-S18的rpoB基因序列與殺魚愛德華氏菌CK41(CP_047671.1) 的一致性為99.58%。為更準確地確定菌株H4-S18的分類地位，本研究中同時參考Griffin等[10]合成愛德華菌屬種特異性引物，擴增出殺魚愛德華氏菌(EP)特異性引物條帶。

綜合生理生化鑒定、序列比對分析及特異性引物擴增三方面結(jié)果，確定本研究中的分離株H4-S18為殺魚愛德華氏菌。結(jié)合本研究及相關(guān)報道[26]，在殺魚愛德華氏菌鑒定時，不能僅通過生理生化或16S rRNA序列直接鑒定到種，應(yīng)結(jié)合生理生化鑒定、特異性引物擴增及多個管家基因系統(tǒng)進化關(guān)系等結(jié)果綜合判定，以降低誤判，提高鑒定準確率。

3.2 殺魚愛德華氏菌的致病因子

殺魚愛德華氏菌能夠?qū)е卖~類患皮膚潰爛暴露、骨頭壞死、器官肉芽腫病變和敗血癥等疾病[27-28]。Esteve等[29]從患敗血癥的野生歐洲鰻中分離出殺魚愛德華氏菌，本研究中從患出血癥大菱鲆中同樣分離出該菌。為深入探討分離株的致病能力，找到更加安全有效的防治方法，本研究中還開展了致病因子的研究。

目前，研究人員已經(jīng)鑒定出多種與殺魚愛德華氏菌致病過程有關(guān)的毒力因子，包括皮膚毒素、細胞侵襲因子、溶血素、軟骨素酶、三型分泌系統(tǒng)(T3SS)和六型分泌系統(tǒng)(T6SS)等[30-32]。esrB是T3SS分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)基因，可分泌至胞外形成針筒狀結(jié)構(gòu)外鞘，用來刺破宿主細胞膜[33-34]。查閱殺魚愛德華氏菌、愛德華氏菌屬及腸桿菌科相關(guān)毒力因子研究發(fā)現(xiàn)，mukF基因編碼殺傷蛋白可直接殺傷細胞[35]；katB基因編碼過氧化氫酶，抵抗H2O2對細胞膜、DNA和酶等細胞組成的損傷[36]；sodB基因作為氧應(yīng)激相關(guān)蛋白基因，在抗氧化防御中具有重要作用[15]；citC基因可幫助細胞分解檸檬酸[37]；gadB基因參與抵抗酸性條件，能夠減弱胃腸道的酸性物質(zhì)和吞噬細胞的殺傷作用[37]；菌毛基因與愛德華氏菌的致病性強弱有關(guān)，fimA毒力基因能夠編碼鞭毛蛋白，幫助病原黏附到宿主細胞表面[38]?；诖耍狙芯恐羞x擇了毒力啟動基因(esrB)、殺傷因子基因(mukF)、過氧化氫酶基因(katB)、抵抗因子基因(sodB)、檸檬酸裂解酶基因(citC)、谷氨酸脫羧酶同工酶基因(gadB)等6種毒力基因和4種菌毛基因(fimA、fimB、fimC和fimD)進行了檢測，結(jié)果表明，10種毒力基因均被檢出，且與上述相關(guān)研究中關(guān)于毒力基因的研究結(jié)果基本一致，但目前這種毒力組合尚未見報道。

毒力基因研究不僅可用于該菌致病機理的研究和毒力判斷，還為疫苗的研究提供了重要依據(jù)。esrB等T3SS元件與誘導(dǎo)大菱鲆產(chǎn)生免疫應(yīng)答有密切關(guān)系，T3SS不僅是殺魚愛德華氏菌的重要毒力因子，還是重要的減毒疫苗開發(fā)靶點[39]。本研究中，在殺魚愛德華氏菌分離株H4-S18中檢測到了esrB毒力基因，為后續(xù)減毒疫苗的研發(fā)提供了有益參考。

3.3 殺魚愛德華氏菌的藥物敏感性與耐藥基因

抗菌藥物在治療由愛德華氏菌引起的疾病中起到了非常重要的作用，但長期不科學(xué)的濫用抗生素，致使許多致病菌產(chǎn)生了耐藥性，抗菌藥物的防治效果越來越差，因此，科學(xué)研究致病菌的藥物敏感性，對健康養(yǎng)殖和科學(xué)用藥具有重要的指導(dǎo)意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，菌株H4-S18對10類23種測試抗生素的敏感性存在差異，對磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明2種磺胺類，多黏菌素、萬古霉素2種多肽類，利福平1種利福霉素類在內(nèi)的5種抗生素類藥物耐藥；對5種β-內(nèi)酰胺類、3種氨基糖苷類、5種喹諾酮類、1種大環(huán)內(nèi)酯類、1種氯霉素類、2種四環(huán)素類和1種呋喃類在內(nèi)的18種抗生素敏感。尚琨等[40]對大菱鲆源殺魚愛德華氏菌分離株研究發(fā)現(xiàn)，其對桿菌肽、慶大霉素、萘啶酸、磺胺異惡唑、苯唑西林、復(fù)方新諾明和頭孢呋辛等7種抗菌藥物耐藥。毛燦等[5]研究發(fā)現(xiàn)，花鱸源殺魚愛德華氏菌87株分離株共有32種耐藥譜型，且均為多重耐藥菌株，對麥迪霉素、紅霉素和利福平的耐藥率超過了90%，對青霉素、磺胺異惡唑耐藥率為50%～80%。Ma等[41]研究發(fā)現(xiàn)，利福平耐藥情況普遍存在于環(huán)境中。本研究中，菌株H4-S18對利福平耐藥，與水體中的抗生素檢測結(jié)果相同。菌株H4-S18對5種抗生素耐藥，與前人研究結(jié)果基本相符，同樣為多重耐藥菌株，且經(jīng)檢測攜帶了5種耐藥基因。菌株H4-S18對頭孢曲松、頭孢拉啶、頭孢哌酮、諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星和紅霉素等類型藥物均敏感，近年來，相關(guān)部門提倡科學(xué)用藥，已明令禁止該類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。根據(jù)H4-S18對恩諾沙星敏感的研究結(jié)果，推薦在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用恩諾沙星粉防治大菱鲆殺魚愛德華氏菌病，該藥還可用于防治大菱鲆副乳房鏈球菌病[42]。

目前，關(guān)于病原菌耐藥基因的檢測研究較多，但未見殺魚愛德華氏菌耐藥基因的檢測報道。本研究中，參考其他耐藥菌的相關(guān)研究，篩選了部分耐藥基因進行檢測，結(jié)果顯示，菌株H4-S18攜帶β-內(nèi)酰胺類TEM、氨基糖苷類ant(3″)-Ⅰ、磺胺類tet(A)、四環(huán)素類mcr-1和喹諾酮類Sul2等5種耐藥基因，未檢測到攜帶磺胺類Sul3基因及喹諾酮類oqxA基因。研究表明，細菌對抗生素的耐藥性與頻繁過度使用藥物、抗生素的選擇性壓力等有關(guān)[43]，而中國海域檢出率較高的抗生素有四環(huán)素類和喹諾酮類[44-45]。本試驗中，殺魚愛德華氏菌菌株H4-S18同樣測出了四環(huán)素類mcr-1和喹諾酮類Sul2耐藥基因，與前人環(huán)境監(jiān)測研究結(jié)果相符，這說明煙臺地區(qū)海域曾頻繁或過度使用四環(huán)素類、喹諾酮類藥物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株H4-S18雖攜帶了β-內(nèi)酰胺類TEM、氨基糖苷類ant(3″)-Ⅰ、喹諾酮類Sul2等耐藥基因，但未表現(xiàn)出相關(guān)的耐藥性，與葛慕湘等[17]的研究結(jié)果一致，證實了耐藥基因與耐藥表型并不一一對應(yīng)。本研究中耐藥基因及藥物敏感性的研究結(jié)果，為殺魚愛德華氏菌耐藥菌株的進一步研究及病害防治提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

1)從山東省煙臺市某養(yǎng)殖場患病大菱鲆中分離到一株優(yōu)勢菌株H4-S18，經(jīng)生理生化，16S rRNA、gyrB基因、rpoB基因序列比對，以及愛德華氏菌特異性引物擴增等，判定該菌株為殺魚愛德華氏菌。

2)殺魚愛德華氏菌H4-S18對大菱鲆的半致死濃度LD50為1.2×108CFU/mL，說明其具有較強致病性。

3)H4-S18具有fimA、fimB、fimC、fimD等4種菌毛基因和esrB、mukF、katB、sodB、citC、gadB等6種毒力基因，說明其屬于強毒株型。

4)H4-S18攜帶TEM、ant(3″)-Ⅰ、tet(A)、mcr-1、Sul2等5種耐藥基因，對2種磺胺類、2種多肽類、1種利福霉素類在內(nèi)的5種抗生素類藥物耐藥，說明其屬于耐藥型菌株。

5)對殺魚愛德華氏菌耐藥型菌株引起的腹水、出血癥病防治中，推薦使用恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)，并嚴格執(zhí)行500度日的休藥期。