艾克熱木江·阿爾肯， 日夏提·帕爾哈提， 張 崢, 翟 生

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院骨科中心， 新疆 烏魯木齊 830011)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是臨床常見的股骨頭血液循環(huán)障礙性疾病，以缺血性壞死為主，具有進行性、多發(fā)性和致殘性等特點[1]。ONFH通常發(fā)生在20～50歲之間的個體中，患者在早期階段無明顯癥狀，隨著病程的進展在5年內(nèi)將發(fā)生股骨頭塌陷，大約65%的ONFH患者最終需要全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，這給患者和社會帶來巨大的經(jīng)濟和醫(yī)療負擔[2]。ONFH發(fā)病原因復雜，糖皮質(zhì)激素是一類臨床常用的抗炎藥物和免疫抑制劑，而過量使用糖皮質(zhì)激素是引發(fā)ONFH的重要危險因素。人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細胞(bone microvascular endothelial cells，BMECs)是構(gòu)成附著在骨小梁上的單層結(jié)構(gòu)，能夠與血液中的成分直接接觸，除了為骨組織和骨細胞提供氧氣和營養(yǎng)外，還具有內(nèi)分泌功能，對于維持股骨頭內(nèi)正常微環(huán)境具有重要意義。以往研究表明，ONFH部位存在著不同程度的BMECs損傷或功能障礙異常，導致股骨頭骨質(zhì)血運異常[3,4]，這與ONFH的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。環(huán)狀RNA(CircRNA)是一種共價鍵合的非編碼RNA，來自前體mRNA的線性RNA的反向剪接，在人類疾病中發(fā)揮各種調(diào)節(jié)作用。小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as)由X染色體上的DNA反義鏈轉(zhuǎn)錄后剪切不同外顯子的 3' 端供體和 5'端受體，以3'-5'磷酯共價鍵結(jié)合環(huán)化，再剪切內(nèi)含子后形成的 circRNA，參與癌癥、骨病和代謝性疾病的病理進程[5]。本實驗將shCDR1as轉(zhuǎn)染至人BMECs中敲低CircCDR1as表達，再經(jīng)過糖皮質(zhì)激素誘導后觀察BMECs生長及血管形成的變化情況，以探究CircCDR1as在ONFH中對BMECs生理功能的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集2020年10月至2021年12月在我院進行治療的患有糖皮質(zhì)激素誘導的7例ONFH患者的股骨頭組織，作為ONFH組，其中男性5例，女性2例，年齡41～68歲，平均年齡(46.55±4.27)歲，另收集同期7例因股骨頸骨折行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的無病變正常股骨頭組織，作為對照組，其中男性6例，女性1例，年齡40～69歲，平均年齡(44.85±4.23)歲。排除因酒精、創(chuàng)傷或缺血誘發(fā)的ONFH以及HIV、乙型或丙型肝炎感染的患者。每位患者對實驗知情同意且簽署知情同意書，并在我院倫理委員會指導下進行研究。

1.2主要材料與試劑:氫化可的松(美國輝瑞公司)，HE染色液(北京雷根生物公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和MTT細胞增殖檢測試劑盒(北京索萊寶生物公司)，Trizol試劑盒和實時熒光定量PCR擴增試劑盒(日本Takara公司)，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)，Triton X-100染液(上海翌圣生物公司)，Lipofectamine RNAiMAX(美國Invitrogen公司)，EdU染料(北京凱詩源生物公司)，Matrigel(美國Corning公司)，PVDF膜(瑞氏Roche公司)，RIPA緩沖液、Bradford蛋白檢測試劑盒、ECL顯色液及DAPI染料(上海碧云天生物研究所)，F(xiàn)ITC標記的CD31抗體、CD54抗體、CD144抗體、CD34抗體、CD45抗體、CD117抗體(英國Abcam公司)，vWF、VEGF、VEGFR-2、GAPDH抗體及Alexa Fluor 488標記的熒光抗體(北京博奧森生物公司)。shNC和shCDR1as由廣州銳博生物公司合成，基因引物序列交由上海生工生物工程公司合成。

1.3方 法

1.3.1HE染色:將兩組患者股骨頭組織用10%福爾馬林固定，置于10%EDTA溶液脫鈣6周。梯度酒精脫水，包埋在石蠟中，切成厚度為5μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，加入蘇木精染色5min，伊紅染色2min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察股骨頭內(nèi)骨髓組織壞死程度，并攝取圖片。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應:Trizol法提取組織或細胞總RNA，微量核酸測定儀檢測總RNA的純度、濃度。按照M-MLV試劑盒說明書操作將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR實驗進行擴增反應，具體參照實時熒光定量PCR擴增試劑盒說明配制反應體系，通過Applied Biosystems 7500 PCR儀器定量檢測，反應程序設(shè)為兩步快速循環(huán)法，設(shè)置為：95 ℃ 10 min，1次循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，40次循環(huán)，擴增結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。基因引物序列如下：CircCDR1as，上游引物5'-CGTCTTCCAGCATCTCTGTGT-3'，下游引物5'-GCCATCGGAAACCCTGGATA-3'；GAPDH(內(nèi)參基因)，上游引物5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下游引物5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'。

1.3.3股骨頭BMECs分離培養(yǎng)與鑒定:在無菌條件下將收集的股骨頸骨折行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭組織剝開，去掉筋膜及其它雜質(zhì)，切成細小骨粒，將其放入肝素化的培養(yǎng)管中，用預熱的HBSS液反復沖洗，去除油脂及細碎骨質(zhì)，具體參照文獻方法分離培養(yǎng)人BMECs。將細胞重懸于完全性內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2環(huán)境條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)14d后，通過倒置顯微鏡觀察細胞生長情況與形態(tài)特征。為了評估細胞表面標志物，用0.25%胰蛋白酶處理BMECs，PBS洗滌，F(xiàn)ACS 緩沖液重懸細胞，并與FITC標記的抗CD31抗體、抗CD54抗體、抗CD144抗體、抗CD34抗體、抗CD45抗體及抗CD117抗體在4℃環(huán)境下避光孵育30min，PBS洗滌，通過流式細胞儀分析細胞表面標記蛋白表達。

1.3.4細胞免疫熒光染色:將分離培養(yǎng)的生長良好的BMECs接種至防脫片載玻片上，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2環(huán)境條件下培養(yǎng)12h。PBS洗滌后，以4%多聚甲醛固定，使用0.1%Triton X-100孵育穿透10min，10%山羊血清室溫封閉2h，滴加特異性一抗CD31(1∶200)和vWF(1∶200)，置于4℃下共孵育過夜。次日，PBS洗滌，將其與Alexa Fluor 488標記的二抗在室溫下共孵育1h，PBS清洗后，DAPI避光孵育30min，結(jié)束后封片，自然晾干，通過激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況，并攝取圖片。

1.3.5細胞轉(zhuǎn)染與分組處理:實驗分為四組，具體分組與處理如下：①對照組，BMECs正常培養(yǎng)；②GC組，采用0.1mg/mL糖皮質(zhì)激素氫化可的松培養(yǎng)BMECs 24h；③shNC+GC組，將shNC轉(zhuǎn)染至BMECs后，再用0.1mg/mL氫化可的松培養(yǎng)24h；④shCDR1as+GC組，將shCDR1as轉(zhuǎn)染至BMECs后，再用0.1mg/mL氫化可的松培養(yǎng)24h。細胞轉(zhuǎn)染中，利用Lipofectamine RNAiMAX分別將shNC和shCDR1as序列轉(zhuǎn)染至對應的shNC+GC組與shCDR1as+GC組BMECs，實驗步驟嚴格參照試劑盒說明書操作。

1.3.6MTT法:收集各處理組BMECs，調(diào)整密度按1×105個/孔植入96孔板內(nèi)，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2環(huán)境條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至24h、48h、72h，加入50μL MTT試劑液至待測細胞孔，輕輕混勻，繼續(xù)孵育4h，洗掉上清，再加入150μL DMSO至待測細胞孔，在搖床上振蕩10min，待結(jié)晶物完全溶解，在酶標儀上檢測490nm處各孔的吸光度(OD)值。

1.3.7EdU染色:收集各處理組BMECs，調(diào)整密度以1×105個/孔植入24孔板內(nèi)，加入10μmoL/L EdU染色，PBS清洗，再以Apollo567避光染色30min，DAPI避光孵育30min，進行染核，洗滌后封片，自然晾干，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況并攝取圖片，紅色熒光為EdU陽性細胞，隨機選擇5個視野，計數(shù)該視野下EdU陽性細胞數(shù)目與總細胞數(shù)目，以兩者比值作為EdU陽性細胞率。

1.3.8體外成管實驗:將稀釋的Matrigel添加于24孔板內(nèi)，每孔鋪膠150μL，均勻平鋪后置于室溫下，待其凝固成膠，備用。將各處理組BMECs按5×104個/孔植入鋪有Matrigel的24孔板內(nèi)，并放入37℃、體積分數(shù)5%CO2環(huán)境條件下培養(yǎng)，24h后，通過光學顯微鏡觀察成管情況，隨機選擇5個視野，計數(shù)該視野下成管數(shù)目。

1.3.9Western blot:在各處理組BMECs中加入預冷RIPA緩沖液，置于冰上裂解后提取總蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10min使其變性，制備10% SDS-PAGE凝膠，將處理后蛋白加至加樣孔內(nèi)，恒壓電泳分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，再將膜浸入5%脫脂奶粉，室溫封閉2h，TBST洗膜，滴加一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜，滴加對應二抗，室溫放置1h，TBST再次洗膜，ECL顯色，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)掃膜后拍攝圖片，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH的灰度值之比統(tǒng)計各目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1ONFH患者與股骨頸骨折患者的股骨頭組織病理學特征比較:HE染色結(jié)果顯示，對照組股骨頸骨折患者的骨小梁較粗，骨細胞結(jié)構(gòu)完整，而ONFH組可見骨髓結(jié)構(gòu)紊亂，骨髓壞死，有空骨腔出現(xiàn)，成典型的ONFH病理形態(tài)，見圖1。

圖1 ONFH患者與股骨頸骨折患者的股骨頭組織病理學觀察(HE染色，×100)

2.2CircCDR1as在ONFH組織中的表達檢測結(jié)果:qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，ONFH組織中CircCDR1as相對表達量顯著高于對照組組織中CircCDR1as相對表達量(P<0.05)，見圖2。

圖2 qRT-PCR測定ONFH組織與股骨頸骨折組織內(nèi)CircCDR1as表達水平注：與對照組比較，*P<0.05

2.3BMECs的鑒定結(jié)果:分離的細胞在原代培養(yǎng)14d后，使用倒置顯微鏡觀察到細胞呈現(xiàn)梭形，匯合形成單層，基本覆蓋培養(yǎng)皿底部，見圖3A。用流式細胞術(shù)檢測該細胞是否存在特征性造血和內(nèi)皮標志物，發(fā)現(xiàn)CD31、CD54和CD144均呈陽性表達，而CD34、CD45和CD117均呈陰性表達，見圖3B。通過細胞免疫熒光染色檢測到，細胞內(nèi)CD31與vWF均明顯表達，見圖3C，由此說明成功分離到BMECs。

圖3 BMECs的鑒定注：A：倒置顯微鏡觀察細胞生長與形態(tài)(×100)；B：流式細胞術(shù)檢測細胞表面標記物表達；C：細胞免疫熒光染色觀察CD31與vWF表達(×100)。

2.4各組BMECs中CircCDR1as表達水平比較:BMECs進行轉(zhuǎn)染處理后，qRT-PCR檢測各組細胞內(nèi)CircCDR1as表達水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shCDR1as的細胞內(nèi)CircCDR1as相對表達量顯著低于對照組和shNC組(P<0.05)，見圖4A，表明轉(zhuǎn)染成功。此外，與對照組比較，GC組CircCDR1as相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05)；與shNC+GC組比較，shCDR1as+GC組CircCDR1as相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4B。

圖4 各組BMECs中CircCDR1as表達水平比較注：A：qRT-PCR檢測BMECs轉(zhuǎn)染效果，與對照組比較，*P<0.05；B：qRT-PCR檢測不同處理組BMECs內(nèi)CircCDR1as表達水平，與對照組比較，*P<0.05；與shNC+GC組比較，#P<0.05。

2.5敲低CircCDR1as對GC誘導的BMECs活性的影響:MTT法測定各組BMECs增殖活性，檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24、48、72h后，與對照組比較，GC組細胞增殖活性顯著下降(P<0.05)，而shCDR1as+GC組細胞增殖活性顯著高于shNC+GC組(P<0.05)，見圖5A。EdU染色后觀察到，各組BMECs內(nèi)呈現(xiàn)不同程度紅色熒光染色，與對照組比較，GC組紅色染色細胞數(shù)目減少，EdU陽性細胞率顯著降低(P<0.05)；與shNC+GC組比較，shCDR1as+GC組紅色染色細胞數(shù)目明顯增多，EdU陽性細胞率顯著升高(P<0.05)，見圖5B。

圖5 各組BMECs增殖能力比較注：A：MTT法檢測各組BMECs增殖活性；B：EdU染色檢測各組BMECs增殖水平，與對照組比較，*P<0.05；與shNC+GC組比較，#P<0.05。

2.6敲低CircCDR1as對GC誘導的BMECs血管生成的影響:經(jīng)體外成管實驗檢測發(fā)現(xiàn)，GC組細胞形成的管腔數(shù)目顯著少于對照組細胞形成的管腔數(shù)目(P<0.05)；另外，shCDR1as+GC組細胞形成的管腔數(shù)目又顯著多于shNC+GC組細胞形成的管腔數(shù)目(P<0.05)，見圖6。

圖6 體外成管實驗檢測各組BMECs血管形成情況注：與對照組比較，*P<0.05；與shNC+GC組比較，#P<0.05。

2.7Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，GC組細胞內(nèi)VEGF與VEGFR-2的蛋白相對表達量顯著下調(diào)(P<0.05)；與shNC+GC組比較，shCDR1as+GC組細胞內(nèi)VEGF與VEGFR-2的蛋白相對表達量則顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western blot檢測各組BMECs內(nèi)VEGF與VEGFR-2蛋白表達水平注：1：對照組；2：GC組；3：shNC+GC組；4：shCDR1as+GC組。與對照組比較，*P<0.05；與shNC+GC組比較，#P<0.05。

3 討 論

目前，糖皮質(zhì)激素常用于治療嚴重急性呼吸綜合征、急性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[6,7]。其中5%～40%的患者在使用大劑量糖皮質(zhì)激素后出現(xiàn)ONFH，而由糖皮質(zhì)激素誘發(fā)ONFH的發(fā)生率在非創(chuàng)傷性O(shè)NFH中居首位。糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的ONFH是多種內(nèi)外因素引發(fā)股骨頭髓內(nèi)微血管病變，血栓形成致使股骨頭供血供氧不足，引起骨細胞死亡，最終導致股骨頭結(jié)構(gòu)改變甚至完全塌陷，此外，過量使用糖皮質(zhì)激素可導致脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮損傷、髓質(zhì)脂肪堆積及成骨細胞無序分化，阻礙骨修復和骨重建[8]。然而，導致糖皮質(zhì)激素誘發(fā)ONFH的確切發(fā)病機制和分子機制仍不清楚。由于進行活檢以診斷糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH在臨床上是不可行的，因此迫切需要用于早期診斷的生物標志物，這對于ONFH的早期診斷和治療十分關(guān)鍵。

BMECs受損或功能障礙會導致股骨頭微循環(huán)障礙，這是糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH發(fā)展的關(guān)鍵。據(jù)報道指出糖皮質(zhì)激素刺激對BMECs轉(zhuǎn)錄組影響顯著，能夠誘導特異性基因表達，調(diào)控BMECs生理活動進而影響ONFH的早期階段[9]；研究表明糖皮質(zhì)激素可以誘導BMECs中miRNA的差異表達，這有助于糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH的進一步發(fā)展[10]。此外，研究指出從糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH患者股骨頭組織分離的BMECs，其活性、血管形成及遷移能力均降低，但細胞凋亡水平明顯增加[11]。在本研究中，從股骨頸骨折行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭組織中分離出BMECs，觀察到其呈典型的內(nèi)皮細胞形態(tài)，細胞表面標記物CD31、CD54和CD144均呈陽性表達，而CD34、CD45和CD117均呈陰性表達，并表現(xiàn)出CD31和vWF高表達，這些結(jié)果均表明成功分離到BMECs。而在使用糖皮質(zhì)激素誘導后，BMECs增殖活性和EdU陽性細胞率均下降，該結(jié)果進一步說明了糖皮質(zhì)激素誘導能夠使BMECs活性下降，這可能影響ONFH病理進程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，ONFH患者股骨頭組織內(nèi)骨髓結(jié)構(gòu)紊亂，有大量骨髓壞死和空骨腔出現(xiàn)，且CircCDR1as在ONFH患者股骨頭組織內(nèi)表達明顯上調(diào)，由此推測，CircCDR1as可能參與ONFH的發(fā)生發(fā)展。許多CircRNA在進化上是相當保守的，并且參與了多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展，目前，已揭示了CircCDR1as在幾種疾病中的表達水平及具體作用，例如，ZAghajani等[12]研究指出CircCDR1as在前列腺癌組織中表達水平異常升高，并前列腺癌的腫瘤細胞行為和表型方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用；研究表明非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者血漿中CircCDR1as表達上調(diào)，且局部壞死組織中的CircCDR1as表達水平也明顯高于鄰近正常組織，其表達與患者的疾病嚴重程度呈正相關(guān)[13]。根據(jù)以上研究結(jié)果，CircCDR1as可能作為評估糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH進展的潛在生物標志物。本研究結(jié)果還顯示，敲低CircCDR1as能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導的BMECs活性下降，對BMECs起到一定的保護作用。

研究證明，ONFH患者BMECs血管生成活性降低反映了BMECs的功能障礙[14]。BMECs排列在血竇和血管內(nèi)層，在血管穩(wěn)態(tài)和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，由于持續(xù)暴露于糖皮質(zhì)激素刺激下，會致使局部BMECs功能障礙并誘導細胞凋亡，而BMECs凋亡或功能障礙會損害血管修復與血管生長過程，最終導致股骨頭局部血流減少，這加速了ONFH的惡化[15]。因此，BMECs的血管生成能力下降可能是糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH的潛在機制。本研究結(jié)果顯示，在糖皮質(zhì)激素誘導后，BMECs的血管形成能力降低，VEGF與VEGFR-2的蛋白相對表達量均下調(diào)，說明血管生成受到抑制。BMECs管腔的形成是新生血管生成的第一步，這對于骨修復和骨重塑至關(guān)重要。血管生成由多種分子機制驅(qū)動，VEGF是生理和病理生理條件下血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，能夠通過促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和生長來誘導血管生成，并與骨形成中間充質(zhì)濃縮、軟骨形成、軟骨吸收和血管侵襲等步驟密切相關(guān)[16]。VEGFR-2是作為一種酪氨酸激酶受體，可通過其細胞外結(jié)構(gòu)域與VEGF結(jié)合，激活其下游信號轉(zhuǎn)導通路，進而促進血管生成。在本研究中，敲低CircCDR1as促進了糖皮質(zhì)激素誘導的BMECs血管生成，提高了細胞內(nèi)VEGF與VEGFR-2的蛋白相對表達量，由此提示，CircCDR1as能夠影響糖皮質(zhì)激素誘導的BMECs血管生成進而參與ONFH的病理進程，敲低CircCDR1as可對ONFH中血管生成起到促進作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CircCDR1as在糖皮質(zhì)激素誘導的ONFH患者股骨頭組織內(nèi)表達上調(diào)，敲低其表達能夠顯著提高糖皮質(zhì)激素誘導的BMECs活性與血管形成能力，并且提高VEGF與VEGFR-2的蛋白表達水平，改善了糖皮質(zhì)激素誘導的BMECs功能障礙。這不僅為揭示糖皮質(zhì)激素性O(shè)NFH的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)，而且對于臨床上ONFH的診療提供了新思路。但本研究僅限于體外細胞學實驗，后續(xù)將進行動物回植實驗，此外，關(guān)于CircCDR1as的具體作用機制也有待進一步深入探究。