蔡貴東， 靳孟妮， 王小軍， 王宗社， 舒瑞朝， 段朝陽， 馬 恩

(1.陜西省寶雞市中心醫(yī)院， 陜西 寶雞 7210002.西安交通大學第二附屬醫(yī)院， 陜西 西安 710004)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)是以動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為病理基礎的心血管疾病，而內皮細胞凋亡被認為是AS發(fā)生的啟動因素[1～3]。因此，有效抑制內皮細胞凋亡可能是CHD有前景的治療方法，但目前影響內皮細胞凋亡的分子機制仍然未闡明。微小RNA(miRNA)作為長度約18-22個核苷酸的非編碼小型內源性RNA，可通過與目標mRNA 3'UTR區(qū)配對來負調控基因表達[3]。有研究揭示miR-383-3p在AS、冠狀動脈疾病等血管疾病中具有重要作用[4,5]，AS大鼠心肌組織中miR-383-3p下調，其過表達可抑制冠狀動脈內皮細胞凋亡[4]。但miR-383-3p在CHD中的詳細作用機制還不甚清楚。人第10號染色體缺失的磷酸酶/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten/Phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PTEN/PI3K/AKT/mTOR)在細胞凋亡、自噬過程中具有重要調控作用，抑制PI3K/AKT通路可誘導CHD小鼠內皮細胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p在乳腺癌中可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮抗腫瘤作用[7]，而其對CHD的影響是否與該通路有關還未可知，基于此，本研究以期通過探究miR-383-3p靶向PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號通路對CHD大鼠內皮細胞凋亡的影響，為CHD治療機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:將從昆明醫(yī)科大學購得的90只SD大鼠(SPF級，215-260g)于通風良好及12h/12h正常晝夜交替的環(huán)境飼養(yǎng)，許可證：SCXK(滇)K2020-0004。本研究經本院動物倫理委員會批準實施。

1.2試劑及儀器:293T細胞(CM8693X，上海淳麥生物科技)；HE染色試劑盒、Lipofectamine 2000 Transfection Reagent、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(AR1180、11668027、E-EL-R1430km，上海恒斐生物)；BCA試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E112-01/02、DD1205-01/02，南京諾唯贊)；TUNEL試劑盒、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)(1521、XFR31390，上海信帆生物)；兔抗Bcl-2、Bax抗體、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(ab182858、ab32503、ab6721，Abcam)；兔抗PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、PTEN、GAPDH、mTOR、p-mTOR抗體(4249、9272、4228、4060、9559、2118、2983、2971，Cell Signaling Technology)；實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time，qRT-PCR)試劑盒(F-430，北京美科美生物)；內皮素-1(endothelin 1，ET-1)(YS04235B，上海雅吉生物)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(ab100786，深圳海思安生物)；凝膠成像系統(tǒng)E-Gel Imager(廣州市科之藍儀器)；全自動生化分析儀PUZS-300(上海帝博思生物)。

1.3 方 法

1.3.1分組和CHD模型大鼠構建:將大鼠分為control組、CHD組(模型組)、mimic NC組、miR-383-3p mimic組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1-PTEN組，每組15只；造模前24h及造模后每兩周，mimic NC組、miR-383-3p mimic組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1-PTEN組大鼠分別于尾靜脈注射100μL慢病毒液(50μg/100mL)及質粒，control組、CHD組注射等量生理鹽水；除control組外其余組大鼠進行CHD模型構建：連續(xù)6周飼喂大鼠高脂飼料(豬油15%、膽固醇5%、膽酸鈉0.2%、丙基硫氧嘧啶0.2%+基礎飼料79.6%)后間隔24h，連續(xù)3d腹腔注射垂體后葉素(30μg/kg)[8]，生理記錄儀進行心電圖檢測，Ⅱ導聯(lián)心電圖中J點位移均≥0.2mV，表明全部建模成功[9]；control組飼喂正?；A飼料并腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2qRT-PCR檢測冠狀動脈miR-383-3p、PTEN表達:造模結束后從每組大鼠中隨機挑選5只，頸椎脫臼處死后室溫下分離獲取其冠狀動脈，經液氮冷凍后，添加預冷的Trizol試劑進行勻漿，依次添加氯仿、異丙醇、乙醇處理以提取冠狀動脈總RNA，經微量核酸儀測定其濃度及純度后逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別以U6、GAPDH為內參，進行qRT-PCR擴增(引物見表1)，擴增程序：95℃ 30s、95℃變性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，×30，2-△△Ct計算miR-383-3p、PTEN表達(n=5)。

表1 引物序列

1.3.3全自動生化分析儀測定大鼠血脂水平:抽取大鼠腹主動脈血5mL，靜置1h后，進行3000r/min離心(15min)取上清液，4℃保存。使用全自動生化分析儀測定血清中三酰甘油(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、總膽固醇(Total Cholesterol，TC)水平(n=10)。

1.3.4ELISA法檢測血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平:使用ELISA試劑盒檢測2.3所得血清中AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平(n=10)。

1.3.5HE染色觀察冠狀動脈組織病理變化:從每組中挑選5只大鼠，將其冠狀動脈組織浸于多聚甲醛中，脫水后將組織包埋于石蠟中，制成4μm切片后HE染色，依次經脫水、透明、封片后光鏡下觀察(×200)。

1.3.6TUNEL法檢測冠狀動脈內皮細胞凋亡:將2.5所制切片置于TUNEL反應液中進行避光孵育(1h)，PBS洗滌，經過DAB染色及封片后于400倍光鏡下觀察棕黃色凋亡細胞(n=5)，凋亡指數(shù)(AI)%=(凋亡數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.3.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-383-3p與PTEN靶向關系:starBase2.0網址預測miR-383-3p與PTEN的結合位點；將PTEN上與miR-383-3p結合的片段進行擴增后插入到pmirGLO載體，以構建野生型PTEN-wt質粒；使用基因突變技術對二者結合位點進行突變，構建突變型PTEN-mut質粒。將293T細胞分為PTEN-wt+miR-383-3p mimics組、PTEN-wt+mimic NC組、PTEN-mut+miR-383-3p mimics組、PTEN-mut+mimic NC組，將mimic NC、miR-383-3p mimics分別與PTEN-wt、PTEN-mut共轉染到293T細胞，經24h培養(yǎng)后測定螢火蟲、海腎熒光值，計算293T細胞的熒光素酶相對活性；將293T細胞分為control組、mimic NC組、miR-383-3p mimics組，使用mimics-NC、miR-383-3p進行轉染，Western blot檢測PTEN蛋白表達。

1.3.8Western blot檢測冠狀動脈組織Bcl-2、Bax及PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達:將每組其余5只大鼠處死，取冠狀動脈組織于冰上裂解并提取總蛋白，BCA法定量后通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，經轉膜及封閉后孵育GAPDH、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、PTEN、mTOR、p-mTOR抗體(兔抗1∶1000)一抗過夜(4℃)，次日孵育經1∶2000稀釋的HRP-IgG二抗，ECL顯色，通過凝膠成像儀曝光拍照，Image J軟件分析各蛋白的條帶灰度值，計算PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、PTEN、mTOR、p-mTOR表達(n=5)。

2 結 果

2.1各組大鼠冠狀動脈組織miR-383-3p、PTEN表達比較:結果顯示miR-383-3pmimic可顯著增加miR-383-3p表達水平(P<0.05)，pcDNA3.1-PTEN可顯著增加PTEN mRNA表達水平(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動脈組織miR-383-3p、PTEN表達比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.2各組大鼠血脂水平比較:結果顯示CHD大鼠TG、LDL-C、TC水平顯著增加(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，miR-383-3p過表達可顯著降低CHD大鼠TG、LDL-C、TC水平(P<0.05)，顯著增加HDL-C水平(P<0.05)，而PTEN高表達則可顯著逆轉miR-383-3p對CHD大鼠血脂水平的改善作用(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠血脂水平比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.3各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平比較:結果顯示，CHD大鼠血清ET-1、AngⅡ水平顯著升高(P<0.05)，VEGF、NO水平顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過表達可顯著降低CHD大鼠ET-1、AngⅡ水平(P<0.05)，顯著增加VEGF、NO水平(P<0.05)；而PTEN高表達則可顯著逆轉miR-383-3p對CHD大鼠內皮細胞功能障礙的改善作用(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.4HE染色觀察冠狀動脈組織病理變化:結果顯示CHD大鼠冠狀動脈結構模糊形態(tài)不規(guī)則，內皮細胞呈無序排列；miR-383-3p過表達后冠狀動脈結構明顯得到改善；而PTEN過表達則可逆轉miR-383-3p過表達的上述改善作用，見圖4。

圖4 HE染色觀察冠狀動脈組織病理變化(HE，比例尺：50μm)

2.5各組大鼠內皮細胞凋亡比較:結果顯示CHD大鼠內皮細胞凋亡顯著增加(P<0.05)；miR-383-3p過表達可顯著抑制內皮細胞凋亡(P<0.05)；而PTEN過表達則可顯著逆轉miR-383-3p對內皮細胞凋亡的抑制作用(P<0.05)，見圖5、6。

圖5 各組大鼠內皮細胞凋亡比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

圖6 各組大鼠內皮細胞凋亡比較(TUNEL，比例尺：50μm)

2.6各組大鼠冠狀動脈組織Bcl-2、Bax表達比較:通過Western blot檢測冠狀動脈組織Bcl-2、Bax表達情況，結果顯示CHD大鼠冠狀動脈組織Bax表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過表達顯著降低Bax表達(P<0.05)，顯著增加Bcl-2表達(P<0.05)；而PTEN過表達則可顯著逆轉miR-383-3p對上述蛋白表達的影響(P<0.05)，見圖7。

圖7 各組大鼠冠狀動脈組織Bcl-2、Bax表達比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.7miR-383-3p與PTEN靶向關系驗證:TargetScan預測顯示：miR-383-3p與PTEN存在結合位點，見圖9(a)；為探究miR-383-3p對PTEN調控作用，通過雙熒光素酶報告基因實驗對miR-383-3p與PTEN靶向關系進行驗證，結果顯示miR-383-3p過表達可顯著降低熒光素酶相對活性(P<0.05)，見圖9(b)，并且顯著降低PTEN蛋白表達水平(P<0.05)，見圖8(c)、(d)。

圖8 miR-383-3p與PTEN靶向關系驗證a， miR-383-3p與PTEN結合位點；b，熒光素酶相對活性比較(與PTEN-wt+mimic NC組相比，aP<0.05。)；c， miR-383-3p過表達對PTEN蛋白表達的影響；d Western blot檢測PTEN蛋白表達的量化圖

圖9 各組大鼠冠狀動脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.8各組大鼠冠狀動脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達比較:通過Western blot實驗檢測大鼠冠狀動脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達情況，結果顯示CHD大鼠冠狀動脈組織PTEN表達顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過表達顯著降低PTEN表達(P<0.05)，顯著增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(P<0.05)；而PTEN過表達則可顯著逆轉miR-383-3p過表達對p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達的促進作用(P<0.05)，見圖9。

3 討 論

CHD是一種威脅人類健康的常見心血管疾病，其發(fā)生與內皮細胞損傷等AS過程密切相關，內皮細胞損傷、長期高脂血癥及炎癥反應可導致內皮功能障礙，致使脂質進入動脈內膜下，逐漸演變成AS斑塊，最終導致CHD發(fā)生[10]。因此，拮抗內皮細胞損傷對CHD治療具有重要意義。

miRNA廣泛參與細胞生長和凋亡的調控，與冠狀動脈疾病、AS、心肌梗塞等多種心血管疾病的發(fā)生有關[4,10]。miR-383-3p作為miRNA成員之一，被發(fā)現(xiàn)在AS大鼠心肌組織中表達下調，其過表達可通過抑制白介素1受體Ⅱ表達減輕炎癥反應，抑制冠狀動脈內皮細胞凋亡，促進內皮細胞存活及血管構建[4]。炎癥反應時巨噬細胞中激活的缺氧誘導因子1α可通過抑制miR-383表達增加腺苷三磷酸消耗，增加細胞壞死性凋亡，從而促進AS小鼠病變進程[11]。但目前關于miR-383-3p在CHD中的影響機制研究甚少，而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-3p在CHD大鼠冠狀動脈組織中表達明顯降低，與前人研究相一致[4]，表明miR-383-3p參與大鼠CHD的發(fā)生。在生理狀態(tài)下，NO/ET處于動態(tài)平衡，當發(fā)生血管內皮損傷時，調控血管收縮的ET及AngⅡ水平顯著增加，而具有維持血管穩(wěn)態(tài)作用的NO水平顯著降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-3p過表達可顯著增加HDL-C、VEGF、NO水平、Bcl-2表達水平，減少TG、LDL-C、TC、ET-1、AngⅡ水平、冠狀動脈組織病理損傷程度、內皮細胞AI、Bax表達，該結果表明，miR-383-3p過表達能夠有效降低CHD大鼠血脂水平及冠狀動脈內皮細胞凋亡，改善內皮細胞功能障礙及病理損傷，有作為CHD潛在治療靶點的潛能。

PI3K作為一種磷脂酰肌醇激酶，可通過磷酸化為PIP3來激活Akt和下游效應器mTOR，以此參與細胞存活及凋亡，而其上游因子PTEN則可將PIP3去磷酸化為PIP2，因此被作為PI3K拮抗劑[13]。有報道稱，miR-26a-5p可通過靶向PTEN激活PI3K/Akt通路，促進冠狀動脈疾病小鼠內皮細胞增殖，抑制細胞凋亡[6]。三氯生可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路刺激人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)損傷[14]。本研究生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，PTEN是miR-383-3p的靶向基因，miR-383-3p過表達能夠顯著抑制CHD大鼠冠狀動脈組織中PTEN表達，促進p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達，該結果表明miR-383-3p能夠通過抑制PTEN表達激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。猜測miR-383-3p過表達對CHD大鼠冠狀動脈內皮細胞凋亡的抑制作用是否可能與其調控該通路有關，基于此猜想，本研究在miR-383-3p過表達基礎上對PTEN進行過表達，發(fā)現(xiàn)，PTEN過表達可逆轉miR-383-3p高表達對CHD大鼠內皮細胞凋亡及功能損傷的改善作用，該結果表明，miR-383-3p可通過靶向抑制PTEN表達激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而起到抑制CHD大鼠內皮細胞凋亡，改善內皮損傷的作用。

綜上所述，miR-383-3p可通過靶向抑制PTEN表達來激活/PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而起到抑制CHD大鼠內皮細胞凋亡的作用。本研究為CHD治療靶點的尋找提供了新方向。本研究目前僅限于大鼠體內實驗，對體外細胞實驗還有所欠缺，因此，在后續(xù)會繼續(xù)深入。