李曉艷， 莫立穩(wěn)， 程 瑩， 吳綺楠

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院， 四川 成都 6100312.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大足醫(yī)院內(nèi)分泌科， 重慶 402360)

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是終末期腎功能衰竭的重要誘發(fā)因素。其特征是蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率下降、高血壓、系膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小球基底膜增厚和腎小管間質(zhì)纖維化[1]。糖尿病腎病進(jìn)展的病理機(jī)制，包括炎癥和纖維化。目前糖尿病患者的治療策略主要是血糖控制和降壓/降脂治療；然而，這些措施對(duì)糖尿病患者的腎臟并不能起到保護(hù)作用。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)糖尿病腎病的新治療方法是一個(gè)非常重要的領(lǐng)域。銀杏葉是世界上應(yīng)用最廣泛的植物治療產(chǎn)品之一，其提取物對(duì)治療糖尿病性心肌病、高血壓、神經(jīng)退行性疾病、白內(nèi)障等多種疾病具有有益的特性。白果內(nèi)酯是銀杏葉提取物中的一種倍半萜，占2.9%-3.2%。研究表明，白果內(nèi)酯通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路在治療高血糖腦缺血、氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用[2，3]。白果內(nèi)酯能降低非酒精性脂肪肝炎大鼠的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)，減輕肝纖維化[4]。白果內(nèi)酯可改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的未成熟大鼠糖尿病肝損傷和代謝紊亂。然而，白果內(nèi)酯在糖尿病腎病調(diào)節(jié)中的具體作用和機(jī)制尚不明確。因此，本研究使用腎小球系膜細(xì)胞系創(chuàng)建了高糖細(xì)胞模型，以評(píng)估白果內(nèi)酯的治療效果，并破解可能的抗炎和抗纖維化機(jī)制，以期為白果內(nèi)酯在預(yù)防或控制糖尿病腎病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料:人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)(上海雅吉)，白果內(nèi)酯(20mg，含量≥98%；北京Solarbio)，針對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)的小干擾RNA、小干擾RNA陰性對(duì)照(上海GenePharma)，SOCS2抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)抗體、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam)，Lipofectamine 2000、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，ECL試劑盒(北京SBS Genetech)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與高糖損傷:腎小球系膜細(xì)胞HMC在補(bǔ)充10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，所處環(huán)境為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。為了模擬高糖環(huán)境，將腎小球系膜細(xì)胞HMC在含30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中刺激24h[5]。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將對(duì)數(shù)期的腎小球系膜細(xì)胞HMC(5×105)接種于6孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)，使用Lipofectamine 2000，將針對(duì)SOCS2的小干擾RNA、小干擾RNA陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染腎小球系膜細(xì)胞HMC，即為干擾SOCS2組和NC組。轉(zhuǎn)染24h后，通過(guò)Western blotting進(jìn)行抑制SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)共分為：NG組、HG組、HG+低白果內(nèi)酯組、HG+中白果內(nèi)酯組、HG+高白果內(nèi)酯組、HG+高白果內(nèi)酯+NC組和HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組。NG組腎小球系膜細(xì)胞HMC正常培養(yǎng)，NG組根據(jù)1.2進(jìn)行高糖損傷，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組細(xì)胞分別在含6μmoL/L、12μmoL/L、24μmoL/L白果內(nèi)酯[6]和30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中處理24h。HG+高白果內(nèi)酯+NC組和HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對(duì)照、針對(duì)SOCS2的小干擾RNA 24h后，在含24μmoL/L白果內(nèi)酯和30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中處理24h。

1.5Western blotting檢測(cè)TGF-β1、CTGF、FN、SOCS2蛋白表達(dá):腎小球系膜細(xì)胞HMC總蛋白使用RIPA測(cè)定緩沖液提取。用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。然后，將40μg蛋白樣品上樣到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。之后，將膜用5%脫脂牛奶的TBST溶液在室溫下封閉1h，用特異性抗體一抗(4℃下孵育過(guò)夜)、以及相應(yīng)的二抗(室溫下孵育1h)進(jìn)行免疫印跡，最后通過(guò)ECL試劑盒進(jìn)行檢測(cè)?？贵w為：TGF-β1抗體、CTGF抗體、FN抗體、SOCS2抗體(均1∶1000稀釋)、對(duì)照GAPDH抗體(1∶2000)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶8000稀釋)。

1.6ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6表達(dá):腎小球系膜細(xì)胞HMC經(jīng)不同處理后，在3500r/min離心并收集上清液。根據(jù)TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒隨附說(shuō)明步驟，測(cè)量TNF-α、IL-6表達(dá)。TNF-α、IL-6表達(dá)通過(guò)檢測(cè)450nm處的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1白果內(nèi)酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分的影響:與NG組相比，HG組腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表達(dá)量逐漸減少(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見(jiàn)圖1、表1。

表1 腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分的檢測(cè)

圖1 白果內(nèi)酯對(duì)腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN蛋白表達(dá)的影響

2.2白果內(nèi)酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子的影響:與NG組相比，HG組腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與HG組相比，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組腎小球系膜HMC細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子的檢測(cè)

2.3白果內(nèi)酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2表達(dá)的影響:HG組比NG組降低腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)(P<0.05)；HG+低、中、高白果內(nèi)酯組比HG組逐漸提高腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 白果內(nèi)酯對(duì)腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2蛋白表達(dá)的影響

表3 腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2表達(dá)的檢測(cè)

2.4抑制SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè):腎小球系膜HMC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SOCS2小干擾RNA后，干擾SOCS2組SOCS2的蛋白表達(dá)量比相應(yīng)對(duì)照NC組減少了約59.74%(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 SOCS2蛋白表達(dá)的檢測(cè)

表4 SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

2.5抑制SOCS2對(duì)白果內(nèi)酯處理的高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的影響:與HG+高白果內(nèi)酯+NC組相比，HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組腎小球系膜HMC細(xì)胞的SOCS2蛋白表達(dá)量減少，TGF-β1、CTGF、FN蛋白表達(dá)量和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均提升(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表5。

表5 抑制SOCS2對(duì)白果內(nèi)酯處理的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的檢測(cè)

圖4 抑制SOCS2對(duì)白果內(nèi)酯處理的腎小球系膜HMC細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

糖尿病腎病是一種以蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率下降為特征的慢性炎癥性疾病。其中，系膜細(xì)胞功能障礙會(huì)促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)展，這是由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的積累引起的。因此，本研究使用高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞系對(duì)糖尿病腎病進(jìn)行建模[7]，旨在揭示白果內(nèi)酯在糖尿病腎病中的作用機(jī)制。

高糖會(huì)加速ECM在腎小球系膜細(xì)胞中的聚集，ECM的過(guò)度積累隨后導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。TGF-β1已被確定為糖尿病腎病中ECM蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要負(fù)責(zé)ECM的積累，與腎纖維化和腎小球硬化的發(fā)展密切相關(guān)。CTGF也可能通過(guò)抑制基質(zhì)分解和誘導(dǎo)ECM合成而導(dǎo)致糖尿病腎病[8]。研究表明，高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN的蛋白增加，而白果內(nèi)酯的給藥濃度依賴性的降低了腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN的水平，延緩了纖維化的趨勢(shì)。與黃茸茸等[6]提供的白果內(nèi)酯抑制非酒精性脂肪肝炎大鼠肝纖維化的結(jié)果相似，提示白果內(nèi)酯可作為治療腎纖維化的潛在抗纖維化劑。

本研究通過(guò)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯可以降低高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞中TNF-α、IL-6的表達(dá)。白果內(nèi)酯可下調(diào)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的水平，減少阿爾茨海默病細(xì)胞和小鼠模型中TNF-α和IL-6釋放以降低神經(jīng)細(xì)胞中的炎癥[9]。而且白果內(nèi)酯降低了高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平，呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了白果內(nèi)酯在糖尿病中的抗炎作用，并顯示了調(diào)節(jié)炎性因子在治療糖尿病腎病中的潛在益處。

此外，白果內(nèi)酯可拮抗高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)降低，提示白果內(nèi)酯可能通過(guò)調(diào)節(jié)SOCS2來(lái)控制糖尿病腎病的進(jìn)展。SOCS2被認(rèn)為是一種炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，影響糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制[10]。為了確定白果內(nèi)酯抑制炎性因子的潛在機(jī)制，在腎小球系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針成功抑制SOCS2后，發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。因此可見(jiàn)白果內(nèi)酯在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中具有的抗纖維化和抗炎特性可能歸因于其對(duì)SOCS2的促進(jìn)。

綜上，白果內(nèi)酯具有減弱糖尿病腎病并抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥和纖維化的特性。此外，白果內(nèi)酯的抑制作用是通過(guò)上調(diào)SOCS2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，證明白果內(nèi)酯可能潛在的應(yīng)用于預(yù)防或治療糖尿病腎病以及其他與炎癥相關(guān)的糖尿病疾病。