張孟昊，鄭文潔

白塞病(Beh?et’s disease，BD)是一種慢性全身性血管炎性疾病，以反復(fù)發(fā)作的口腔、生殖器潰瘍、皮膚病變和眼炎為主要特征，可累及胃腸道、心臟大血管、中樞神經(jīng)等全身多系統(tǒng)，發(fā)病機(jī)制未明[1]。中性粒細(xì)胞又稱中性多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)，其過(guò)度活化與浸潤(rùn)是BD急性炎癥反復(fù)發(fā)作的主要原因，鑒于PMN在BD發(fā)病中的重要性，有專家建議將BD命名為中性粒細(xì)胞性血管炎[2]。PMN的半衰期極為短暫，通常只有18～19 h[3]，因此了解PMN的死亡方式對(duì)BD發(fā)病機(jī)制的探索至關(guān)重要。

1 PMN的亞群

在Ficoll密度梯度分離程序中與紅細(xì)胞位于同一沉降區(qū)，為正常密度中性粒細(xì)胞；與單個(gè)核細(xì)胞位于同一沉降區(qū)的PMN為低密度中性粒細(xì)胞(LDG)[4]。LDGs是PMN的一個(gè)新亞群，能分泌比正常密度粒細(xì)胞更高水平的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)，如IL- 6、IL- 8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)，表現(xiàn)出促炎的特性[5]。

2 PMN的主要功能

PMN是宿主對(duì)病原體的首要防御細(xì)胞。被激活后可釋放活性氧(reactive oxygen species，ROS)和顆粒蛋白酶，吞噬病原體，而后轉(zhuǎn)化為膿細(xì)胞并死亡[6]。過(guò)度活化的PMN可以造成組織損傷，破壞免疫耐受并產(chǎn)生自身抗體，促使自身免疫性疾病的發(fā)生[7]。

PMN可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)活化和巨噬細(xì)胞(macrophages，Mφ)抗炎重編程[8]，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化[9]，促進(jìn)Th1和Th17的分化[10]，放大免疫反應(yīng)。

3 PMN的程序性死亡方式

PMN半衰期僅18～19 h[3]，其常見(jiàn)的程序性死亡方式包括細(xì)胞凋亡、中性粒細(xì)胞細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)形成(NETosis)、細(xì)胞焦亡和鐵死亡。

3.1 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是生理狀態(tài)下由基因調(diào)控的死亡方式。PMN凋亡障礙將導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇和全身性炎癥反應(yīng)綜合征[11]。凋亡的PMN若不即使被清除則會(huì)釋放顆粒酶及損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，引起局部炎癥和組織損傷[12]。

3.2 NETosis

NETs是炎性期激活的PMN胞漿抗菌蛋白附著于解聚的染色質(zhì)上形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被釋放到胞外可以包裹殺傷外來(lái)病原體[13]。但過(guò)度形成或未及時(shí)清除的NETs可直接導(dǎo)致組織損傷；也可以作為新表位參與自身免疫性疾病的發(fā)生[14]。

3.3 細(xì)胞焦亡

2001年cookson等首次使用焦亡形容半胱氨酸蛋白酶(caspase，CASP)依賴的細(xì)胞死亡方式[15]。焦孔素D(gasdermin D，GSDMD)被CASP切割后，GSDMD-N移位到質(zhì)膜誘導(dǎo)細(xì)胞膜孔隙形成，而GSDMD-C則可以抑制N端的焦亡誘導(dǎo)活性[16]。但在PMN中N-GSDMD并不會(huì)聚集到胞膜引起焦亡，而是與嗜藍(lán)顆粒和LC3+自噬體相關(guān)[17]。

3.4 鐵死亡

鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，最早由Stockwell等[18]提出，是鐵超載和脂質(zhì)ROS累積所致，伴隨DAMPs的釋放，介導(dǎo)炎癥[19]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化物度[20]，警告免疫細(xì)胞正處于鐵死亡敏感的環(huán)境中。缺血再灌注損傷后的細(xì)胞鐵死亡會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致DAMP的釋放和炎癥的發(fā)生[21]。

細(xì)胞的死亡方式主要取決于“刺激物”和被激活的受體[22]，通過(guò)啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行不同的細(xì)胞死亡方式。而且不同的細(xì)胞死亡方式發(fā)生的快慢不同：細(xì)胞焦亡很快，而凋亡卻很慢。因此，PMN的死亡可能是細(xì)胞不同死亡方式綜合作用的結(jié)果。表1總結(jié)了常見(jiàn)PMN程序性死亡的方式以及各自的特點(diǎn)。

表1 常見(jiàn)的PMN程序性死亡方式及其各自特點(diǎn)Table 1 Common modes of PMN programmed death and their characteristics

4 PMN的程序性死亡方式在BD發(fā)病中的潛在作用

4.1 細(xì)胞凋亡

PMN數(shù)量、功能穩(wěn)定以及凋亡PMN快速有效的清除，是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，活動(dòng)BD患者體內(nèi)存在PMN凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂。中粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一種促進(jìn)粒細(xì)胞增殖和成熟的生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)PMN生存穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮特定作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)BD血清G-CSF水平增高，且PMN自發(fā)凋亡比例顯著高于健康對(duì)照；但加入自體血清共培養(yǎng)后，BD的PMN凋亡被明顯抑制，提示活動(dòng)BD血清中的G-CSF通過(guò)刺激PMN的增殖和激活，并抑制其凋亡，維持BD炎癥狀態(tài)[24]。男性BD患者中PMN凋亡紊亂強(qiáng)于女性患者，可能與睪酮有關(guān)[25]。但也有研究發(fā)現(xiàn)BD患者的葡萄膜炎緩解期PMN凋亡減少，而活躍期上升，可能是凋亡細(xì)胞通過(guò)Fas-Fas配體相互作用的結(jié)果[26]。一項(xiàng)前瞻性臨床研究發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用G-CSF 可以顯著降低 BD 患者口腔、外陰潰瘍的愈合時(shí)間和疼痛嚴(yán)重程度[27]。因此，PMN凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂可能是BD疾病進(jìn)展的一個(gè)早期、生物學(xué)相關(guān)的危險(xiǎn)因素。

4.2 NETosis

NETosis是目前在BD領(lǐng)域研究最多的PMN程序性死亡方式，可以被病原體、PMA以及唾液酸Lewis(X)等物質(zhì)誘導(dǎo)[28]，但其機(jī)制和產(chǎn)生NETs的性質(zhì)不同。研究顯示來(lái)源于活化血小板的可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)可以通過(guò)P3K/NF-κB信號(hào)通路引起呼吸爆發(fā)，使PMN處于活化狀態(tài)，也可促進(jìn)PMN黏附、遷移[29]。活動(dòng)BD血漿中sCD40L水平較健康人和非活動(dòng)BD明顯升高，NETs增多[30]。BD患者體內(nèi)游離NETs水平及體外PMN產(chǎn)生NETs能力均強(qiáng)于健康對(duì)照[31]；同時(shí)在BD患者針刺反應(yīng)的表皮[32]、脂膜炎、血管壁或心臟內(nèi)血栓[33]病理組織中，均有發(fā)生NETosis的PMN浸潤(rùn)。推測(cè)PMN在BD體內(nèi)即處于活化狀態(tài)，通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的NETs直接參與BD發(fā)病，造成組織器官損傷。此外，口腔中唾液粘蛋白上的唾液酸 Lewis(X)可以與PMN的l-選擇素結(jié)合，誘發(fā)不依賴NADPH 氧化酶、彈性蛋白酶和整合素的NETosis。與病原體誘導(dǎo)的 NADPH 氧化酶依賴性 NETosis 相比，唾液誘導(dǎo)的NETosis發(fā)生得更快，有著不同的蛋白譜和更高的Dnase抗性，且具有更強(qiáng)的殺菌的能力。但BD患者唾液中不含蛋白質(zhì)的部分抑制了粘蛋白誘導(dǎo) NETosis 的能力，導(dǎo)致口腔內(nèi)NETs水平降低，NETs抗菌能力下降，口腔潰瘍發(fā)生[28]。

NET s的另一個(gè)重要來(lái)源是LDGs[34]，LDGs產(chǎn)生促炎因子和NETs的能力均強(qiáng)于正常密度PMN，且LDGs可以通過(guò)增強(qiáng)NETosis而引起內(nèi)皮損傷和血管功能障礙[5，34]。近期研究表明，低密度粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比率能敏感的反應(yīng)BD的活動(dòng)狀態(tài)，且有血管受累的BD患者LDGs比例明顯增多[35]，提示LDGs與血管炎癥有關(guān)。

BD來(lái)源NETs可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、壞死[36]。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞募集PMN并表達(dá)大量血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)形成新生血管并合成一氧化氮，導(dǎo)致血管擴(kuò)張，破壞內(nèi)皮細(xì)胞完整性，使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到血管全層，導(dǎo)致疾病的不斷發(fā)作[37]。此外，PMN活化后產(chǎn)生ROS增多，啟動(dòng)NETosis，并導(dǎo)致血栓形成[38]。

2021年本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)BD外周血及血清NETs含量均升高，且血清NETs含量與BD疾病活動(dòng)指標(biāo)CRP呈正相關(guān)。并首次發(fā)現(xiàn)BD NETs中高水平的組蛋白H4和氧化DNA可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生更多 IL- 8 和 TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，并進(jìn)一步促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[39]。

抑制中性粒細(xì)胞的過(guò)度活化和NETosis將有利于改善BD疾病嚴(yán)重程度[40]，體外研究顯示秋水仙堿和地塞米松這兩種用于治療BD 的藥物均能抑制BD外周血NETosis水平[36]，但目前暫無(wú)體內(nèi)驗(yàn)證。

4.3 細(xì)胞焦亡

多種免疫細(xì)胞均可以發(fā)生焦亡：BD外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和皮損中發(fā)現(xiàn)NLRP3表達(dá)增加，且IL-1β分泌增多，而CASP-1抑制劑會(huì)抑制其增加[41]，提示BD患者的PBMC可能存在焦亡的增加；腸BD患者的腸粘膜組織中觀察到了焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，是血漿中的外泌體通過(guò)激活NLRP3誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的[42]。目前尚無(wú)BD中PMN焦亡的相關(guān)研究，但鑒于多種自身炎癥性疾病都已被證實(shí)與細(xì)胞焦亡存在密切聯(lián)系[43]，因此探究PMN焦亡在BD中的作用機(jī)制將有助于深入探索BD發(fā)病機(jī)制。

4.4 鐵死亡

PMN的鐵死亡目前在自身免疫/炎癥性疾病領(lǐng)域的研究鳳毛麟角，僅在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者血清中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)ROS升高和PMN的鐵死亡[44]。且PMN鐵死亡伴隨自身抗原的釋放，通過(guò)刺激自身反應(yīng)性B細(xì)胞和pDC產(chǎn)生自身抗體和Ⅰ型IFN，形成一個(gè)正反饋環(huán)。提示PMN的鐵死亡不僅是SLE患者白細(xì)胞減少的重要原因，而且能夠誘導(dǎo)發(fā)生級(jí)聯(lián)病理反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)SLE的發(fā)生發(fā)展。鑒于PMN在BD發(fā)病機(jī)制中的重要作用，PMN鐵死亡在SLE患者中的成功探索為此后對(duì)BD患者PMN鐵死亡促炎機(jī)制的研究提供了啟發(fā)。

綜上，PMN作為人體中含量最多的白細(xì)胞，除直接在炎癥部位浸潤(rùn)、脫顆粒并發(fā)揮吞噬作用致組織損傷外，其程序性死亡方式的調(diào)控也與BD發(fā)病有關(guān)。多項(xiàng)研究表明BD患者PMN凋亡和NETosis機(jī)制的紊亂，可直接或間接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織器官損傷。BD患者體內(nèi)PMN 凋亡機(jī)制受損時(shí)，顆粒酶及DAMPs釋放將引起局部炎癥和組織損傷。NETosis與BD疾病的活動(dòng)性及組織損傷密切相關(guān)：過(guò)度激活的PMN釋放的NETs裝配有生物活性的蛋白，可直接導(dǎo)致組織器官損傷；NETs也可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，介導(dǎo)炎性血栓形成；或激活T 淋巴細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，間接參與BD的發(fā)病和病情的惡化。雖然目前尚無(wú)BD中PMN焦亡或鐵死亡的報(bào)道，但隨著該死亡方式在其他自身免疫性疾病或在BD患者其他免疫細(xì)胞中的深入探索，可為BD中PMN焦亡或鐵死亡機(jī)制的研究提供思路。深入探討B(tài)D患者PMN的多種死亡方式，可進(jìn)一步解析PMN參與BD發(fā)病的重要節(jié)點(diǎn)，有望為BD的臨床治療提供新靶點(diǎn)。