齊相薇 林榮文 蔡康榮 王槐高

(廣東醫(yī)科大學(xué) 1.臨床技能培訓(xùn)中心；2.科研中心；3.病理生理學(xué)教研室,廣東 東莞 523808)

目前我國鼻咽癌在中南部兩廣地區(qū)(廣東、廣西、湖南等)高發(fā)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人口老齡化的出現(xiàn)，發(fā)病率可能還會(huì)上升；同時(shí)鼻咽癌的預(yù)后較差，死亡率也相對(duì)較高[1]。放射治療是目前鼻咽癌首選的治療手段, 調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)可提高腫瘤靶區(qū)劑量,同時(shí)減少周圍正常組織照射劑量[2]，但是電離輻射殺滅腫瘤的同時(shí)，也可以誘導(dǎo)許多基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，導(dǎo)致腫瘤對(duì)電離輻射的敏感性降低，并出現(xiàn)輻射抗性的發(fā)展[3]。鼻咽癌對(duì)放射治療比較敏感，患者的五年生存率可明顯提高，但放射治療同時(shí)會(huì)損傷患者頭頸部的其他組織，引起如頭暈頭痛、口干、聽力下降、頸部纖維化及放射性齲齒等多種毒副作用[4]，放射治療后復(fù)發(fā)率不低。臨床研究證明輔助化療聯(lián)合放療或聯(lián)合化療可改善鼻咽癌晚期患者的預(yù)后[5-6]。前期研究結(jié)果表明[7]，口蝦蛄乙酸乙酯提取物可能通過影響P53蛋白的表達(dá),干擾COX-2和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖。本研究根據(jù)新的提取方法獲得口蝦蛄總生物堿，觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和原料 人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞由廣東醫(yī)科大學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。于海鮮市場(chǎng)購買新鮮口蝦蛄，經(jīng)鑒定屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，口足目，蝦蛄科品種。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司， Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁株式會(huì)社化學(xué)研究所，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，兔抗人Caspase8多抗購自Cell Signaling公司，鼠抗人β-actin單抗、羊抗兔、羊抗鼠 II 抗購自SIGMA公司，其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 口蝦蛄總生物堿提取及初步鑒定 以每公斤口蝦蛄加水3 L絞碎，酸化后，恒溫60℃浸泡過夜，離心后取上清液，調(diào)至pH>10。次日離心后取沉淀以乙酸乙酯分3次萃取，減壓濃縮得到總生物堿，具體操作方法參考前期研究結(jié)果[8-9]?？偵飰A以氯仿-環(huán)乙烷(10∶1)溶劑薄層層析展開，采用改良碘化鉍鉀顯色初步定性分析。總生物堿以DMSO溶解分裝，臨用以培養(yǎng)液稀釋成所需濃度(DMSO的終濃度≤0.1%)。

1.2.2 分組 采用不同濃度(0、50、100 mg/L)的口蝦蛄總生物堿處理人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞，分別記為對(duì)照組、50 mg/L組、100 mg/L組。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)總生物堿細(xì)胞體外抗腫瘤作用 人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,制成單細(xì)胞懸液后調(diào)整細(xì)胞密度，滴入總生物堿溶液，使質(zhì)量終濃度分別為5、25、125、625 mg/L，培養(yǎng)48 h并于終止培養(yǎng)前1 h，加CCK-8溶液混勻，孵育2 h后，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，以試劑盒流程操作，取得細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算公式：抑制率%=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)總生物堿抑制細(xì)胞克隆形成能力 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔400個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，每孔換以0.1%胎牛血清的1640培養(yǎng)24 h，加入總生物堿調(diào)整終質(zhì)量濃度(0、50、100 mg/L)，培養(yǎng)2周；PBS清洗細(xì)胞后甲醇固定0.5 h，結(jié)晶紫染色0.5 h，緩流清水沖洗后空置干燥；以網(wǎng)格透明膠片置培于培養(yǎng)板底部，低倍鏡計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。計(jì)算公式：克隆形成率=(克隆形成數(shù)/接種總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)總生物堿對(duì)細(xì)胞周期分布的影響 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入總生物堿調(diào)整終質(zhì)量濃度(0、50、100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)孔；預(yù)冷的70%乙醇固定胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，保存于 4℃；次日離心，PBS洗滌后，以含質(zhì)量終濃度碘化丙啶(PI)100 mg/L和RNase100 mg/L的染色液0.5 mL染色，在常溫下避光染色0.5 h，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Caspase8蛋白表達(dá) 人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,制成單細(xì)胞懸液后調(diào)整細(xì)胞密度，滴入總生物堿溶液，使質(zhì)量終濃度分別為0、50、100 mg/L，培養(yǎng)24 h，加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白；選用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白樣品濃度均一后以SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，封閉2 h，加入 I 抗 [Caspase8(1∶500)]，保存于4℃封閉過夜；加入Ⅱ抗(1∶10 000)，室溫下?lián)u動(dòng)孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參照。Odyssey掃描成像后繼用Quantity one 軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 口蝦蛄總生物堿薄層層析顯色結(jié)果 口蝦蛄總生物經(jīng)薄層層析顯色，有4個(gè)顏色相同的色斑,為復(fù)合化合物，見圖1。顯色反應(yīng)表明其化學(xué)性質(zhì)為生物堿類物質(zhì)。

圖1 薄層色譜法測(cè)定總生物堿結(jié)果Figure 1 Results of total alkaloid detected by TLC

2.2 口蝦蛄總生物堿抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖 不同質(zhì)量濃度的總生物堿(5、25、125、625 mg/L)作用CNE-2Z細(xì)胞24、48、72 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。隨藥物濃度增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐步增加，具有明顯的劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。采用Bliss算法軟件統(tǒng)計(jì)得到， 其作用于CNE-2Z細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為(578.17±0.65)mg/L、(86.27±0.73)mg/L和(63.31±0.35)mg/L，見圖2。

圖2 總生物堿對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 2 Total alkaloid inhibited the proliferation of CNE-2Z cells

2.3 口蝦蛄總生物堿抑制CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力 不同質(zhì)量濃度的總生物堿(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z細(xì)胞，觀察細(xì)胞克隆形成能力的改變。與對(duì)照組相比，CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力明顯降低；隨著總生物堿濃度的增加，其克隆形成數(shù)目和克隆形成大小均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 總生物堿抑制CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成Figure 3 Total alkaloid suppressed colony formation of CNE-2Z cells注：與對(duì)照組相比，① P<0.05

2.4 口蝦蛄總生物堿對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期的影響 不同質(zhì)量濃度的口蝦蛄總生物堿(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布的改變。與對(duì)照組相比，口蝦蛄總生物堿能誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞周期S期比例由11.7%上升為31.5%，而G0/G1期比例由85.5%下降為56%，呈一定的劑量依賴性，見圖4。提示口蝦蛄總生物堿能將CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯于S期。

圖4 總生物堿作用后CNE-2Z細(xì)胞周期分布Figure 4 The effect of total alkaloid on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells注：與對(duì)照組相比，①P<0.05

2.5 口蝦蛄總生物堿對(duì)CNE-2Z細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)的影響 以總生物堿0、50、100 mg/L處理CNE-2Z細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明caspase-8酶原的蛋白表達(dá)隨濃度增加而減少，有一定的劑量依賴關(guān)系，見圖5。

圖5 總生物堿對(duì)CNE-2Z細(xì)胞Caspase8蛋白表達(dá)的影響Figure 5 The effect of total alkaloid on the expression of Caspase8 protein levels in the CNE-2Z cells

3 討論

海洋生態(tài)系統(tǒng)的高壓、高鹽、缺氧、低溫和低光照等獨(dú)特性賦予了海洋生物多樣、獨(dú)特和新穎的結(jié)構(gòu)，是新藥研制開發(fā)藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。海洋生物來源的具有抗腫瘤作用的多種化合物, 包括生物堿類、萜烯類、甾體類化合物、大環(huán)內(nèi)酯類和多肽等，已經(jīng)進(jìn)入臨床不同的試驗(yàn)階段或有相應(yīng)產(chǎn)品上市[10-11]。

近年來從海洋微生物代謝產(chǎn)物中獲得眾多新的生物堿，其中部分生物堿具有高選擇性和高活性而備受關(guān)注[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)從高領(lǐng)類尖柳珊瑚Muriceides collaris中分離得到的一種愈創(chuàng)木薁倍半萜生物堿Muriceidine A體外對(duì)人宮頸腺癌細(xì)胞HeLa具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用[14]。王亞楠等[15]從泰國紅樹林底泥中的耐酸真菌Aspergillus fumigatus OUCMDZ-5210的次生代謝產(chǎn)物中分離得到6個(gè)吲哚二酮哌嗪類生物堿，其中化合物3和6對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116以及人慢性髓性白血病細(xì)胞K562具有不同程度的抑制活性。本研究所前期研究發(fā)現(xiàn)[16]，口蝦蛄乙酸乙酯提取物能抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)口蝦蛄乙酸乙酯提取物能夠抑制CNE-2Z細(xì)胞的遷移和體外血管生成擬態(tài)的能力，其機(jī)制可能與下調(diào)fascin1和VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)[17]。口蝦蛄乙酸乙酯提取物也可抑制HepG2細(xì)胞增殖并與順鉑聯(lián)合用藥可產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)[18]。早期研究通過系統(tǒng)溶劑法相繼得到口蝦蛄乙醇粗提物、正丁醇提取物，繼用乙酸乙酯萃取得到正丁醇提取物的總生物堿并進(jìn)一步純化，其生物堿類化合物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用[19]。綜合近年的研究結(jié)果，系統(tǒng)溶劑法有提取工藝繁瑣、溶劑及人力成本高及提取效率低下等缺點(diǎn)，有待改進(jìn)。同時(shí)，口蝦蛄抗腫瘤物質(zhì)活性雖強(qiáng)，但是體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)效果不佳，可能是由于系統(tǒng)溶法提取物，其成分、種類過于較復(fù)雜且含有抗腫瘤活性物質(zhì)的量不高等原因引起的。尹田鵬等[20]采用酸提堿沉法，從貴州地區(qū)產(chǎn)烏頭中提取總生物堿浸膏并分離純化,獲得15個(gè)二萜類生物堿類成分。沙棘葉黃酮也可以先通過酸提堿沉法進(jìn)一步純化得到[21]。故本研究采用酸提堿沉法結(jié)合乙酸乙酯萃取法，以探索提取更簡(jiǎn)單、成份抗腫瘤活性更高的方法。本方法避免了乙醇提取法、系統(tǒng)溶劑提取法的繁瑣操作、溶劑、人力成本高等缺點(diǎn)，提取效率明顯提高，而且還可以直接純化總生物堿，提取物經(jīng)薄層板色譜法初步鑒定為生物堿類物質(zhì)。

口蝦蛄總生物堿處理后，CNE-2Z細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，48 h的IC50較舊方法的乙酸乙酯提取物更低[22]。較以往研究，用更低質(zhì)量終濃度50及100 mg/L的總生物堿就能明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞克隆形成能力，使細(xì)胞周期阻滯于S期。Caspase-8是控制細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡的分子開關(guān)[23]，是細(xì)胞死亡途徑的主要因子，活化的Caspase-8可以驅(qū)動(dòng)經(jīng)典的caspase依賴性凋亡[24]。唐旭東[25]發(fā)現(xiàn)用高三尖杉酯堿0、0.125、0.25、0.5和1 mg/L作用CNE-2Z細(xì)胞8 h后，Caspase-8酶原的蛋白表達(dá)隨濃度增加而減少，當(dāng)濃度為1 mg/L時(shí)出現(xiàn)活性裂解片段,Caspase-8激活而誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡。本研究中總生物堿作用后CNE-2Z細(xì)胞后，Caspase-8蛋白的表達(dá)水平明顯下降，可能與Caspase-8激活有關(guān)，并可能繼而誘導(dǎo)凋亡，關(guān)于凋亡的全面觀察及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

口蝦蛄總生物堿抗CNE-2Z細(xì)胞的作用可能通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡等發(fā)生。