韓楠 喬曉峰 朱曉文 倪健

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.骨一科；2.普外科，黑龍江 佳木斯 154000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是最常見的一種關(guān)節(jié)炎，據(jù)估計全球約有2.4億人受到骨關(guān)節(jié)炎的影響[1]。老年人通常開始出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎癥狀，并伴隨這種慢性殘疾生活，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。由于醫(yī)療保健和社會支出，骨關(guān)節(jié)炎的財政支出也給患者個人和保險公司帶來了沉重負(fù)擔(dān)[2]。因此，全面闡明骨關(guān)節(jié)炎疾病進程的分子機制對尋找新的治療方法具有重要意義。各種病理改變可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎癥狀，如關(guān)節(jié)軟骨和韌帶的退化、滑膜炎癥、骨贅形成或關(guān)節(jié)囊肥大。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要常駐細(xì)胞，負(fù)責(zé)產(chǎn)生和維持軟骨基質(zhì)，其失調(diào)是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中最常見的相關(guān)因素之一[3]。細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞增殖能力減弱、軟骨細(xì)胞數(shù)量和活力降低以及軟骨細(xì)胞炎癥通常參與了骨關(guān)節(jié)炎的進展[4]。因此，充分了解軟骨細(xì)胞與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)的調(diào)控機制有助于尋求更有效的骨關(guān)節(jié)炎治療策略。microRNAs (miRNAs)是內(nèi)源性 (21～23個核苷酸)的非編碼RNA，能夠通過與 mRNA序列的3′UTR區(qū)域互補配對控制靶mRNA的翻譯從而負(fù)向調(diào)控靶mRNA的表達[5]。miRNA的異常調(diào)控參與了多種疾病的發(fā)病機制，包括腫瘤發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和骨關(guān)節(jié)炎[6]。miR-200c-3p已被證明在骨關(guān)節(jié)炎樣本中低表達[7]，但其在骨關(guān)節(jié)炎中的具體功能和調(diào)控機制仍有待發(fā)掘。本研究旨在評估m(xù)iR-200c-3p在骨關(guān)節(jié)炎進展中對軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其下游調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 膠原酶D(羅氏)，1%青霉素/鏈霉素(武漢益普生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000(美國英杰公司)，miR-200c-3p模擬物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，脂多糖(上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海朗喜工業(yè)科技有限公司)，miRNeasy Mini試劑盒(德國QIAGE公司)，miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGE公司)，C1磁珠(美國賽默飛世爾生物技術(shù)有限公司)，pmirGLO雙熒光素酶報告載體(上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)，雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)，ELISA試劑盒(美國賽默飛世爾生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司)。

1.2 實驗動物及OA模型的建立 從中國科學(xué)院上海實驗動物中心獲得30只雄性小鼠C57BL/6 (8周,體重20～25 g)，在一個特定的實驗動物設(shè)施的無病原體的微隔離籠子里飼養(yǎng)，溫度為22～24℃，可自由獲得食物和水。小鼠隨機分為對照、Sham、OA組，每組10只。如前所述，通過破壞內(nèi)側(cè)半月板的穩(wěn)定性構(gòu)建小鼠OA模型[8]。實驗所涉及的所有程序均經(jīng)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院批準(zhǔn)。

1.3 小鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞從膝關(guān)節(jié)組織中分離[9]。用頸椎脫位法對8周大的雄性小鼠實施處死，并小心地從脛骨平臺、股骨頭和股骨髁中取出關(guān)節(jié)軟骨組織，然后用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗。切斷關(guān)節(jié)軟骨，用膠原酶D (3 mg/mL)室溫下過夜不旋轉(zhuǎn)。過濾消化液，將細(xì)胞懸浮于Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素。將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(條件設(shè)置為5% CO2, 37℃)。細(xì)胞傳代2～3周，培養(yǎng)至70～80%合流。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將軟骨細(xì)胞用100 ng/mL脂多糖(LPS)處理細(xì)胞6 h，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。將miR-200c-3p模擬物(miR-200c-3p mimics)和陰性對照(NC mimics)，以及pcDNA3.1/Zeb1和pcDNA3.1空載(對照組)分別添加到培養(yǎng)基中，使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞。48 h后，收獲細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.5 檢測方法

1.5.1 實時定量PCR法檢測基因表達 使用RNeasy和miRNeasy Mini試劑盒分離總RNA。用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR檢測試劑盒(Applied Biosystems)進行qPCR。將GAPDH和U6分別作為miR-200c-3p和Zeb1的內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達水平。

1.5.2 CCK-8 將細(xì)胞株懸液(1×105/孔)置于96孔板中，每孔加入10 μL的CCK-8溶劑。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育3 h，采用分光光度計計算450 nm處的吸光度以檢測細(xì)胞增殖能力。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)收集用于流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)制造商說明書，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒雙染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。所有實驗均為3個重復(fù)。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 培養(yǎng)上清液和滑膜液中的蛋白質(zhì)水平通過ELISA試劑盒按照制造商的協(xié)議進行測定。

1.5.5 RNA pull down實驗 用生物素標(biāo)記miR-200c-3p野生型和突變型探針，并與C-1磁珠在25℃孵育2 h形成探針吸附的磁珠。將細(xì)胞裂解液與探針4℃下孵育過夜。洗脫后，將磁珠吸附的RNA混合物洗脫，采用RNeasy Mini試劑盒提取RNA后進行RT-qPCR分析，計算RNA豐度。

1.5.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?擴增Zeb1的3′UTR片段，該片段包含預(yù)測的miR-200c-3p結(jié)合位點，并克隆到雙熒光素酶報告載體pmirGLO中。同時構(gòu)建了Zeb1 3′UTR突變體熒光素酶報告基因。使用LipofectamineTM3000試劑將這三個載體與miR-200c-3p模擬物或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c-3p在OA小鼠模型中低表達 RT-qPCR結(jié)果表明，與對照組和Sham組小鼠相比，OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨中miR-200c-3p的表達明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-200c-3p在OA小鼠模型中低表達Figure 1 miR-200c-3p in the low expression of OA in mice model 注：與對照組、Sham組比較，①P<0.05

2.2 過表達miR-200c-3p保護小鼠軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷 我們在體外構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)LPS處理后的軟骨細(xì)胞中miR-200c-3p的表達顯著下調(diào)(圖2A)。為了進一步驗證miR-200c-3p對骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c-3p mimics增加miR-200c-3p在LPS處理后的軟骨細(xì)胞中的表達(圖2B)。CCK-8實驗結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞活性降低，而miR-200c-3p mimics逆轉(zhuǎn)了LPS處理導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞活力的下降(圖2C)。此外，LPS處理后，軟骨細(xì)胞的凋亡顯著增多，而過表達miR-200c-3p顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖2D)。隨后，我們采用ELISA試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量增加，而過表達miR-200c-3p顯著降低了LPS處理所導(dǎo)致的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(圖2E)。

圖2 過表達miR-200c-3p保護小鼠軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷Figure 2 Overexpression of miR-200c-3p to protect cartilage cells from damage induced by lipopolysaccharide in mice注：A.RT-qPCR檢測LPS處理和Control組軟骨細(xì)胞中miR-200c-3p的水平；B.RT-qPCR檢測Control、LPS、LPS+NC mimics和LPS+miR-200c-3p mimics組小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miR-200c-3p的水平；C.CCK-8法檢測LPS處理后，miR-200c-3p過表達導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞增殖能力的變化；D.流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS處理后，miR-200c-3p過表達導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞凋亡的變化；E.ELISA檢測小鼠原代軟骨細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α在Control、LPS、LPS+NC mimics和LPS+miR-200c-3p mimics組水平。①P<0.05

2.3 Zeb1是miR-200c-3p的靶基因 為了進一步研究miR-200c-3p下游潛在的分子機制，我們使用包括microT和RNA22在內(nèi)的在線生物信息學(xué)分析工具確定了6個miR-200c-3p的潛在的靶mRNA(圖3A)。RT-qPCR分析結(jié)果顯示，miR-200c-3p過表達后，只有Zeb1的表達水平顯著降低(圖3B)。此外，我們發(fā)現(xiàn)OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨中以及LPS處理后的軟骨細(xì)胞中Zeb1的表達明顯上升 (圖3C)。為了進一步探究miR-200c-3p和Zeb1之間的關(guān)系，我們進行了RNA pull down實驗。結(jié)果顯示，Zeb1在野生型的miR-200c-3p探針下拉的RNA復(fù)合物中顯著富集，而在突變型的miR-200c-3p探針下拉的復(fù)合物中無顯著富集(圖3D)。另外，我們在Zeb1的3′UTR區(qū)域預(yù)測了miR-200c-3p的結(jié)合位點(圖3E)。為了驗證這一作用位點，我們將野生型或突變型的Zeb1 3′UTR片段克隆到熒光素酶報告基因載體中，然后將載體與miR-200c-3p mimics或NC mimics共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。過表達miR-200c-3p顯著降低了野生型的熒光素酶活性，但對突變型的活性無顯著影響，表明miR-200c-3p靶向Zeb1 3′UTR(圖3F)。

圖3 Zeb1是miR-200c-3p的靶基因Figure 3 Zeb1 is miR-200c-3p target genes注：A.microT和RNA22在內(nèi)的在線工具進行生物信息學(xué)預(yù)測6個miR-200c-3p的潛在的mRNAs；B.RT-qPCR檢測miR-200c-3p過表達對6個mRNAs表達的影響；C.RT-qPCR檢測OA小鼠、假手術(shù)小鼠和對照小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Zeb1的水平以及LPS處理和Control組軟骨細(xì)胞Zeb1的水平；D.RNA pull down實驗驗證Zeb1和miR-200c-3p結(jié)合；E.Zeb13′UTR和miR-200c-3p的結(jié)合位點；F.熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CZeb13′UTR和miR-200c-3p的結(jié)合。①P<0.05

2.4 miR-200c-3p通過調(diào)控Zeb1保護小鼠軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷 我們在LPS處理的軟骨細(xì)胞中過表達Zeb1，RT-qPCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/Zeb1的細(xì)胞中Zeb1表達顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載的細(xì)胞(圖4A)。隨后進行拯救實驗驗證miR-200c-3p/Zeb1軸對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞功能的影響。CCK-8實驗結(jié)果表明，在LPS處理的軟骨細(xì)胞中，miR-200c-3p過表達導(dǎo)致的細(xì)胞活力的減少以及細(xì)胞凋亡的增加在共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Zeb1后回升至初始水平(圖4B～D)。此外，Zeb1上調(diào)可以逆轉(zhuǎn)miR-200c-3p過表達抑制的IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生(圖4E)。

圖4 miR-200c-3p通過調(diào)控Zeb1保護小鼠軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷Figure 4 miR-200c-3p through regulating Zeb1 protect cartilage cells from damage induced by lipopolysaccharide in mice注：A.RT-qPCR檢測Control組、LPS、LPS+pcDNA3.1和LPS+pcDNA3.1/Zeb1組小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Zeb1的水平；B.CCK-8法檢測LPS處理后，不同分組的軟骨細(xì)胞增殖；C.LPS處理后，不同分組的軟骨細(xì)胞活性；D.流式細(xì)胞分析檢測LPS處理后，不同分組的軟骨細(xì)胞凋亡；E.ELISA檢測不同分組小鼠原代軟骨細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。①P<0.05

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs是人類疾病進展過程的重要參與者[10-15]。在骨關(guān)節(jié)炎中，miRNA-335-5p被報道能夠通過激活骨關(guān)節(jié)炎中的自噬來緩解軟骨細(xì)胞炎癥[16]。miR-29b-3p通過靶向PGRN促進軟骨細(xì)胞凋亡，促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[17]。microRNA-455-3p通過直接靶向PAK2促進TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[18]。據(jù)報道，miR-200c-3p的異常表達存在于不同類型的疾病中，并調(diào)控炎癥、血管生成和腫瘤發(fā)生等許多重要的生物學(xué)過程[19-23]。有研究報道m(xù)iR-200c-3p在骨關(guān)節(jié)炎患者樣本中低表達[7]。然而，miR-200c-3p在骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中的作用和潛在機制仍然有待研究。本研究證實了miR-200c-3p在骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨中表達下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)其在LPS誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中也呈現(xiàn)顯著下調(diào)。我們將miR-200c-3p模擬物轉(zhuǎn)染進骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)過表達miR-200c-3p可以保護軟骨細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷。

Zeb1是已知的誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在正常的生理和病理過程中都起著重要的作用[24]。已有報道顯示內(nèi)皮細(xì)胞Zeb1促進血管生成依賴的骨形成并逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥[25]。Zeb1可作為microRNA-708靶基因共同參與調(diào)控乙醇誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)[26]。然而，Zeb1與miR-200c-3p之間的關(guān)系仍有待進一步研究。本研究首先通過生物信息學(xué)分析工具篩選發(fā)現(xiàn)Zeb1是miR-200c-3p潛在的靶基因。此外，我們確認(rèn)Zeb1在骨關(guān)節(jié)炎軟骨和LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中顯著上調(diào)。通過RNA pull down實驗和熒光素酶報告實驗，我們驗證了miR-200c-3p能夠靶向Zeb1的3′UTR。最后通過功能拯救實驗，我們發(fā)現(xiàn)Zeb1能夠參與miR-200c-3p調(diào)控的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)。這揭示了miR-200c-3p能夠靶向Zeb1調(diào)節(jié)炎癥信號來保護軟骨細(xì)胞。

4 結(jié)論

本研究表明miR-200c-3p直接靶向Zeb1的3′UTR結(jié)合，保護軟骨細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷，為發(fā)掘骨關(guān)節(jié)炎新的治療靶點提供了有價值的見解。