代澤詠 駱芷寒 王禹蒙 劉延友 肖靜 汪宇輝 郭慧玲 江舟

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·國家衛(wèi)生健康委員會時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，四川 成都 610041)

芫根，又名蕪青、蔓菁，藏語名為妞瑪，維語名為恰瑪古，十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種二年生草本植物[1]，是川藏高原地區(qū)頗具特色的蔬菜資源，也是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物[2]。芫根富含生物堿、多糖、維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸、黃酮類、粗蛋白、槲皮素、甾體等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，有食、藥、飼三大應(yīng)用價值[3]。芫根的藥理學(xué)研究顯示，芫根提取物在降血糖[4]，抗缺氧[5]，抗腫瘤[6]，改善腸道菌群和調(diào)節(jié)免疫[7-8]，抗疲勞[9]等多重功效，提示芫根的藥用價值不可估量。目前關(guān)于芫根藥理功效的研究還停留在其原料提取、動物實(shí)驗及驗證等方面，有關(guān)芫根改善機(jī)體免疫功能的分子生物學(xué)機(jī)制研究還是空白。小腸是機(jī)體最主要的食物消化和物質(zhì)吸收器官，同時也是最大的免疫器官和免疫前哨站[10]。本課題組擬在前期的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測芫根對小鼠小腸組織全基因表達(dá)譜的影響，一方面對系統(tǒng)闡明芫根的免疫調(diào)節(jié)功能及分子生物學(xué)機(jī)制有重要的意義，為合理表征芫根的性效及拓寬其臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)，從而給發(fā)掘利用這種川藏特色經(jīng)濟(jì)作物資源提供科學(xué)指導(dǎo)；另一方面，相關(guān)機(jī)制可以作為指導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)的篩選標(biāo)準(zhǔn)之一，給相關(guān)藥物靶點(diǎn)的篩選和新藥的研究開發(fā)等工作提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料與動物分組 雄性SPF級BALB/c小鼠18只購買自四川成都達(dá)碩動物有限公司，周齡8周左右，體重18～20g。將小鼠飼養(yǎng)在光暗節(jié)律12L:12D的光暗循環(huán)箱，室溫(25±2)℃，保持動物室安靜，小鼠自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)新環(huán)境兩周使小鼠狀態(tài)同步化。然后將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，SC1組灌胃芫根提取液，SC2組灌芫根原漿懸液，NC組灌胃生理鹽水。芫根提取液和芫根原漿懸液由四川小葉本草生物科技有限公司生產(chǎn)提供。按規(guī)格，小鼠(20 g)的單次劑量：人(70 kg)的單次劑量=1∶387.9，經(jīng)計算后，SC1組小鼠每只每次灌胃 150 μL 芫根提取液，SC2組小鼠每只每次灌胃 150 μL芫根原漿懸液，NC組小鼠每只每次灌胃 150 μL生理鹽水，每日灌胃一次，連續(xù)7 d。本研究通過動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腸RNA的提取與測序 小鼠灌胃7 d后用勁椎脫臼法處死，每組隨機(jī)取3只小鼠取小腸樣本，使用PBS溶液清洗3遍。按照福際生物RNA提取試劑盒說明書提取總RNA?？俁NA經(jīng)質(zhì)檢合格后，采用 Illumina Hiseq4000 進(jìn)行測序，測序讀長為雙端 2*150bp(PE150)。

1.2.2 基因水平差異表達(dá)研究及制圖 利用上述數(shù)據(jù)分析程序?qū)蛩奖磉_(dá)差異展開研究，以參考基因組為基準(zhǔn)利用Hisat軟件將3組測序數(shù)據(jù)分別兩兩比對，利用比對后的結(jié)果(alignments)參與組裝轉(zhuǎn)錄本。然后使用edgeR對NC組基因分別與SC1組和SC2組基因的差異表達(dá)分析，最后采用R語言圖形化以差異倍數(shù)log2(foldchange)為橫坐標(biāo)，顯著水平-log10(p value)為縱坐標(biāo)，顯著差異的閾值為|log2foldchange|≥1，P<0.05，進(jìn)行基因表達(dá)差異評估，對差異表達(dá)的所有基因繪制火山圖。

1.2.3 差異表達(dá)基因GO功能富集性分析 對差異表達(dá)基因的GO功能富集分析可了解功能組基因的富集情況，富集程度高提示兩組在此功能方面的差異效應(yīng)顯著，該GO功能基因組比較重要。首先把所有顯著性差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的各功能基因組映射，計算每個功能基因組的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在顯著性差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目(P<0.05)。采用edgeR對GO富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示。

1.2.4 差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集性分析 基于信號通路的分析有助于更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)效應(yīng)。在生物體內(nèi)，不同基因需要通過相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，KEGG是有關(guān)信號通路的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過差異基因的KEGG富集分析了解哪些信號通路對應(yīng)的基因富集較多。信號通路基因顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在顯著性差異表達(dá)基因中顯著性富集的信號通路(P<0.05)，采用edgeR對KEGG富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示。

1.2.5 免疫通路差異表達(dá)基因熱圖繪制 為了更好地直觀反映免疫功能和信號通路相關(guān)基因的差異表達(dá)和聚類表達(dá)模式，我們采用 log10(FPKM+1)進(jìn)行基因表達(dá)展示，同時將差異表達(dá)基因 FPKM 通過Z值方式進(jìn)行基因表達(dá)展示(P<0.05)。選取SC1組和SC2組中發(fā)生同向表達(dá)差異的免疫通路相關(guān)基因，橫坐標(biāo)為樣本，縱坐標(biāo)為基因，不同的顏色表示不同的基因表達(dá)水平，顏色由藍(lán)色經(jīng)由白色至紅色 表示表達(dá)量從低到高。紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小腸的轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)差異分析 小鼠小腸樣品轉(zhuǎn)錄組測序共檢測到27733條 mRNA的表達(dá)，通過繪制火山圖能可視化差異表達(dá)基因的整體分布情況。 差異基因的整體分布情況見火山圖(圖1A、B)。與NC組相比，SC1組灌喂芫根提取液小鼠腸道表達(dá)上升基因有1236個，SC2組灌喂絞碎芫根原漿懸液小鼠腸道表達(dá)上調(diào)基因有2233個；相比對照組，SC1和SC2組分別有399和639個基因表達(dá)水平下調(diào)(圖1C)。其中，有1287個基因在SC1組灌喂芫根提取液小鼠和SC2組灌喂絞碎芫根原漿懸液小鼠均同向差異表達(dá)(圖1D)。

圖1 小鼠小腸的轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)差異分析Figure 1 Differential analysis of transcription profile expression in small intestine of mice注：A、B分別為差異表達(dá)基因火山圖，橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性，紅色代表上調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，藍(lán)色代表下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，灰色的點(diǎn)代表非顯著性差異表達(dá)基因；C.差異表達(dá)分析基因柱狀圖；D.差異表達(dá)分析基因韋恩圖

2.2 差異表達(dá)基因GO功能富集性分析 GO功能富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示，富集度前20位，采用ggplot2對GO富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示，Rich factor表示位于該GO的差異基因個數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)，Rich factor越大，GO富集程度越高(P<0.05)，見圖2；其中細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答、多細(xì)胞機(jī)體發(fā)育、白細(xì)胞介素分泌、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控是SC1組、SC2組差異表達(dá)基因GO功能富集度均位于前20的功能基因組，見表1。

表1 SC組差異表達(dá)基因GO功能富集度均位于前20的功能基因組Table 1 The GO enrichment degree of differentially expressed genes in SC group was all in the top 20 functional genomes

圖2 差異表達(dá)基因GO功能富集性分析Figure 2 GO functional enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集性分析 KEGG信號通路富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示，富集度前20位，采用ggplot2對KEGG富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示，Rich Factor表示位于該KEGG的差異基因數(shù)/位于該KEGG的總基因數(shù)，Rich Factor值越大，KEGG富集程度越大(P<0.05)，見圖3；其中維生素消化和吸收、T細(xì)胞受體信號通路、脂肪消化和吸收是SC1組、SC2組差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集度均位于前20的信號通路基因組，見表2。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集性分析Figure 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 SC組差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集度均位于前20的信號通路基因組Table 2 KEGG signal pathway enrichment degree of differentially expressed genes in SC group was all in the top 20 signal pathway genomes

2.4 白細(xì)胞介素分泌相關(guān)基因表達(dá) 差異基因聚類分析用于判斷基因在不同實(shí)驗條件下調(diào)控模式的聚類模式。根據(jù)樣品基因表達(dá)譜的相近程度，將基因進(jìn)行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品(或是不同處理)中的表達(dá)情況，由此獲取生物學(xué)相關(guān)信息。根據(jù)前面差異表達(dá)基因富集度的結(jié)果，重點(diǎn)結(jié)合免疫相關(guān)通路，我們選擇了白細(xì)胞介素分泌、細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號通路的差異表達(dá)基因制圖進(jìn)行聚類分析。芫根處理小鼠后，小鼠小腸中Ccl20、Il18、Il1a、Il2rg、Cd274等21個白細(xì)胞介素分泌相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達(dá)。其中19個基因表達(dá)上調(diào)，2個基因表達(dá)下調(diào)(圖4)。表達(dá)下降的Ccl20和Il18是主要分布在腸道黏膜層炎性趨化因子的基因，表達(dá)上調(diào)的大多屬于白介素配體和相關(guān)受體亞基蛋白基因，如Il1和Il2rg等。Cd274是經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞表面特異表達(dá)的抗原分化簇的基因，也呈表達(dá)上升趨勢。

圖4 白細(xì)胞介素分泌過程相關(guān)基因表達(dá)變化熱圖Figure 4 Heat map of interleukin secretion related gene expression changes

2.5 細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá) 芫根處理小鼠后，小鼠小腸中Ifng、Ifnar1、Ifngr2、Ifit3、Cd274等共30個細(xì)胞對干擾素反應(yīng)相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達(dá)。其中25個基因表達(dá)上調(diào)，5個基因表達(dá)下調(diào)(圖5)。此系統(tǒng)里有多個基因同屬上述白介素系統(tǒng)，干擾素誘導(dǎo)蛋白家族基因里Ifit3和Ifit1表達(dá)下調(diào)，其余Ifit表達(dá)上升。與此相應(yīng)，各種干擾素基因和受體亞基基因也均上調(diào)表達(dá)。

圖5 細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)過程相關(guān)基因表達(dá)變化熱圖Figure 5 Heat map of gene expression changes related to the reaction process of cells to interferon

2.6 T細(xì)胞受體信號通路相關(guān)基因表達(dá) 芫根處理小鼠后，小鼠小腸中共21個T細(xì)胞受體信號通路相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達(dá)。其中19個基因表達(dá)上調(diào)，2個基因表達(dá)下調(diào)(圖6)。T細(xì)胞受體信號通路的受體亞基蛋白CD4，接頭蛋白LAT，T細(xì)胞活化相關(guān)激酶LCK、ZAP70、FYN、ITK和調(diào)節(jié)蛋白GRB2、SOS1等的編碼基因均表達(dá)升高。

圖6 T細(xì)胞受體信號通路途徑相關(guān)基因表達(dá)變化熱圖Figure 6 Heat map of T cell receptor signaling pathway related gene expression changes

3 討論

本研究利用RNA序列研究了芫根喂養(yǎng)對小鼠腸道基因表達(dá)變化的影響。 結(jié)果顯示，芫根提取液灌胃小鼠導(dǎo)致小腸中1635個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中1236個基因表達(dá)上調(diào)，399個基因表達(dá)下調(diào)；芫根原漿灌胃小鼠導(dǎo)致小腸中2872個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中2233個基因表達(dá)上調(diào)，639個基因表達(dá)下調(diào)。兩個芫根組的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)都顯著高于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)，且有1287個共同向差異表達(dá)基因，證明芫根灌胃有效達(dá)到了實(shí)驗效果。

單核-巨噬細(xì)胞統(tǒng)稱吞噬細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)最廣泛的免疫細(xì)胞，在不同的生理條件下吞噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化性巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和選擇替代性巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)，兩類巨噬細(xì)胞也可相互極化。M2型巨噬細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤增殖；M1型巨噬細(xì)胞是機(jī)體的防衛(wèi)士，全方位介入非特異性免疫和特異性免疫過程，能分泌的各類細(xì)胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)[11-14]。白細(xì)胞介素在巨噬細(xì)胞和各類白細(xì)胞的信息傳遞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞的激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分裂與轉(zhuǎn)化及炎癥反應(yīng)中起重要作用。本實(shí)驗中白細(xì)胞介素分泌相關(guān)基因差異表達(dá)熱圖顯示芫根組小鼠的CD274基因表達(dá)上調(diào)，Ccl20基因表達(dá)下調(diào)。CD274蛋白是M1型巨噬細(xì)胞表面的標(biāo)記性蛋白，該基因表達(dá)上調(diào)提示巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化率提高，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的抗病毒、抗癌及各種免疫反應(yīng)中的作用[15]。CCL20蛋白是一種炎癥趨化因子，主要由受到損傷或感染的腸上皮細(xì)胞分泌，當(dāng)腸道上皮細(xì)胞被破壞、受到病原體感染或菌群變化時，腸上皮CCL20的表達(dá)迅速升高，打破局部的免疫平衡，該基因的低表達(dá)提示腸道處于健康的防護(hù)的狀態(tài)[16-17]。T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)功能最復(fù)雜的特異性免疫核心淋巴細(xì)胞，直接參與細(xì)胞免疫和遞呈誘導(dǎo)體液免疫，因此T細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)在免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心影響力[18-19]。本實(shí)驗中T細(xì)胞受體信號通路相關(guān)基因差異表達(dá)熱圖顯示芫根組小鼠的受體亞基蛋白CD4，接頭蛋白LAT，T細(xì)胞活化相關(guān)激酶LCK、ZAP70、FYN、ITK和調(diào)節(jié)蛋白GRB2、SOS1等蛋白的編碼基因均表達(dá)升高，提示T細(xì)胞被活化。干擾素是一類具有高度種屬特異性的糖蛋白，具有抗病毒、抗癌和調(diào)節(jié)免疫的作用，細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)熱圖顯示芫根組小鼠的多種干擾素誘導(dǎo)蛋白和靶干擾素的基因表達(dá)量提高，尤其是IFNG和IFNA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)亞基的基因。IFNA是主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒效果的干擾素，IFNG是主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的具有抑制細(xì)菌生長的干擾素，這兩途徑的基因表達(dá)上調(diào)，提示機(jī)體的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的功能活化，機(jī)體的抗病毒和抗病菌感染能力的提升[20-22]。

腸道是機(jī)體最主要的消化吸收器官和最大的免疫器官，正常結(jié)構(gòu)功能與生理反應(yīng)相適應(yīng)，消化吸收功能的正常維持需要有強(qiáng)效且穩(wěn)定的免疫環(huán)境作保障，富集性結(jié)果提示芫根有調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和強(qiáng)化消化吸收的功效。腸道免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞和腸道菌群之間有很多的相互作用，三者復(fù)雜的聯(lián)系共同參與了腸道保護(hù)、耐受和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這些相關(guān)要素以協(xié)調(diào)的方式協(xié)同工作，以預(yù)防疾病、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保障最大限度地獲取營養(yǎng)。一旦動態(tài)平衡被打破，就會導(dǎo)致腸道免疫功能失調(diào)，引發(fā)各種代謝類和消化系統(tǒng)疾病[23-24]。腸道菌群作為身體不可或缺的重要組成部分，其數(shù)量可匹敵機(jī)體本身的細(xì)胞數(shù)，種類繁多且生理機(jī)能復(fù)雜，參與了免疫系統(tǒng)發(fā)育、先天性免疫和特異性免疫等過程，對維持體內(nèi)生理環(huán)境平衡，調(diào)節(jié)腸道營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，調(diào)控機(jī)體免疫功能等都有重要研究價值[25-27]。研究發(fā)現(xiàn)芫根可促進(jìn)腸道內(nèi)一種短鏈脂肪酸SCFAs的分泌，而這種腸道菌群來源的短鏈脂肪酸的增加可提高機(jī)體免疫力并維護(hù)腸道的平衡穩(wěn)態(tài)，對健康具有重要促進(jìn)作用[8，28-29]。GO富集性分析顯示芫根組差異表達(dá)基因在白細(xì)胞介素分泌、細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)以及細(xì)胞質(zhì)膜兩側(cè)、正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程高度富集且多數(shù)表達(dá)上調(diào)。KEGG富集性分析顯示芫根組差異表達(dá)基因富集在T細(xì)胞受體信號通路、病菌免疫及腫瘤監(jiān)控途徑、各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收代謝途徑等通路中高度富集且多數(shù)表達(dá)上調(diào)。推測可能是芫根促進(jìn)腸道益生菌增殖，抑制腸道病原菌的增殖，改善腸道了菌群結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致SCFAs分泌增加進(jìn)而調(diào)節(jié)了免疫系統(tǒng)。

芫根提取液灌胃小鼠共誘導(dǎo)了小腸1635個基因發(fā)生差異表達(dá)，而芫根原漿灌胃小鼠共誘導(dǎo)了小腸2872個基因發(fā)生差異表達(dá)，芫根原漿組差異表達(dá)基因量和基因差異表達(dá)幅度高于芫根提取液組，提示芫根原漿中可能有芫根提取液中丟失的有效成分或者相關(guān)效應(yīng)分子濃度高于芫根提取液。研究發(fā)現(xiàn)食源植物miRNA跨界調(diào)控動物基因表達(dá)的途徑，是中草藥和藥食兩用作物發(fā)揮藥效的潛在調(diào)控機(jī)制[30-31]。芫根提取液在制作過程中容易破環(huán)原料內(nèi)部的核酸分子，因此可能是造成本實(shí)驗兩個芫根組差異表達(dá)基因量差異的根本原因，本課題組下一步還將以miRNA為切入點(diǎn)進(jìn)一步深入探索機(jī)制。

4 結(jié)論

本實(shí)驗利用生物信息學(xué)技術(shù)分析小鼠小腸轉(zhuǎn)錄組基因，揭示了芫根灌胃小鼠小腸的差異表達(dá)基因在白介素分泌、干擾素反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號通路、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等途徑高度富集，提示芫根對腸道免疫系統(tǒng)及腸黏膜功能的調(diào)節(jié)。其中Cd274的表達(dá)上調(diào)和Ccl20的表達(dá)下調(diào)提示誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞活化可能是芫根調(diào)控免疫和維護(hù)腸道正常結(jié)構(gòu)功能的重要途徑。本研究結(jié)果對進(jìn)一步驗證芫根調(diào)節(jié)免疫功能的指標(biāo)，剖析芫根調(diào)控免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制和深入探索其有效成分具有一定的指導(dǎo)意義。